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《公共科学图书馆·生物》。2007年7月；5（7）：e172。
2007年6月19日在线发布。 数字对象标识：10.1371/期刊.pbio.0050172
预防性维修识别码：项目经理1892574
PMID：17579517

PINK1通过磷酸化线粒体伴侣TRAP1保护氧化应激

朱莉娅·普里金,# 詹姆斯·奥尔兹曼,# 李慎琴,*和连丽*
Huda Y Zoghbi，学术编辑
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

中的突变PTEN诱导的假定激酶1（PINK1）该基因导致常染色体隐性遗传型帕金森病（PD）。到目前为止，还没有关于PINK1底物的报道，PINK1突变导致神经退行性变的机制尚不清楚。在这里，我们报道了TNF受体相关蛋白1（TRAP1）的鉴定，它是一种线粒体分子伴侣，也称为热休克蛋白75（Hsp75），是PINK1激酶的细胞底物。PINK1与线粒体中的TRAP1结合并共定位，在体内外磷酸化TRAP1。我们表明，PINK1通过抑制线粒体释放细胞色素c来防止氧化应激诱导的细胞死亡，PINK1的这种保护作用取决于其磷酸化TRAP1的激酶活性。此外，我们发现，PD-linked PINK1 G309D、L347P和W437X突变损害了PINK1促进TRAP1磷酸化和细胞存活的能力。我们的研究结果表明PINK1磷酸化下游效应器TRAP1以防止氧化应激诱导的细胞凋亡的新途径，并暗示该线粒体途径在PD发病机制中的失调。

作者摘要

帕金森病（PD）的特点是中脑多巴胺能神经元选择性丢失。虽然PD的病因尚不清楚，但病理分析表明其与氧化应激和线粒体功能障碍有关。最近，早发性PD的遗传形式与编码线粒体蛋白PINK1的基因的两个拷贝的突变有关。此外，越来越多的证据表明，PINK1的单拷贝突变是迟发性PD发生的一个重要风险因素。在这里，我们表明，PINH1是一种蛋白激酶，磷酸化线粒体分子伴侣TRAP1以促进细胞存活。我们发现，PINK1通常通过抑制线粒体细胞色素c的释放来防止氧化应激诱导的细胞死亡。与PD相关的PINK1突变削弱了PINK1-磷酸化TRAP1的能力并促进细胞存活。我们的发现揭示了一种新的抗凋亡信号通路，该通路被PINK1突变所破坏。我们认为该途径在PD发病机制中起作用，并可能成为治疗干预的靶点。

编码PINK1的基因突变会导致常见的帕金森病。在这里，作者表明PINK1磷酸化TRAP1，抑制线粒体细胞色素c的凋亡释放。

介绍

帕金森病（PD）是第二常见的神经退行性疾病，其特征是黑质多巴胺能神经元选择性缺失[1]. PD的病因，尤其是散发性疾病，尚不清楚，但可能涉及遗传和环境因素。遗传学研究已经确定了许多与家族性帕金森病相关的基因[2]. 尸检分析显示散发性PD患者线粒体复合体I功能缺陷[三]. 此外，暴露于抑制线粒体复合物I的环境毒素可导致动物模型中出现PD-like表型[4]提示线粒体功能障碍参与了帕金森病的发病机制。

中的突变PTEN诱导的假定激酶1（PINK1）该基因最初在三个隐性遗传PD家系中发现。两个纯合子粉红色1最初发现的突变有：截断无义突变（W437X）和G309D错义突变[5]. 随后，多种额外类型的PD-linked突变或截短粉红色1已报告，正在生成粉红色1隐性PD的第二常见致病基因[6,7]. 有趣的是，尽管常染色体隐性遗传粉红色1-连锁早发PD，多个杂合突变仅影响一个粉红色1等位基因与迟发性PD相关[6–10]. 致病机制粉红色1导致神经变性的突变尚不清楚。

粉红色1编码一个581-氨基酸蛋白，具有预测的N末端线粒体靶向序列和保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域[5]. PINK1蛋白已被证明定位于线粒体[5,11–13]并在体外表现出自磷酸化活性[11,12,14]. PINK1的体内底物和生化功能尚不清楚。在培养的哺乳动物细胞中，野生型PINK1的过度表达保护细胞免受凋亡刺激[5,15]而小干扰RNA（siRNA）介导的PINK1缺失增加了凋亡细胞死亡的易感性[16]. 在果蝇，PINK1缺失导致线粒体缺陷和肌肉及多巴胺能神经元变性[17–20]. 尽管有大量证据表明PINK1在细胞保护中起着重要作用，但PINK1保护细胞凋亡的机制尚不清楚。

在这里，我们描述了线粒体丝氨酸/苏氨酸激酶PINK1的特征，并报道了作为PINK1-底物的TNF受体相关蛋白1（TRAP1）的鉴定，TRAP1是一种线粒体分子伴侣，也称为热休克蛋白75（Hsp75）。我们的结果表明，PINK1通过磷酸化下游效应器TRAP1来防止氧化应激诱导的细胞凋亡，并为PINK1突变导致PD的致病机制提供了新的见解。

结果

PINK1与TRAP1相互作用

为了鉴定PINK1相互作用蛋白，我们使用抗FLAG M2亲和凝胶进行亲和纯化实验，从转染的HeLa细胞提取物中分离出与C-末端FLAG标记的人类野生型PING1相关的蛋白。与以前的报告一致[11,12]Western blot分析检测到细胞提取物中PINK1蛋白的全长形式（PINK1f）和52-kDa处理形式（PING1p）(图1A类,“输入”）。PINK1的两种形式均从第3和第4部分的亲和柱中洗脱(图1A） 。亲合力纯化的PINK1免疫复合物的Ponceau S染色显示存在几种与PINK1特异相关的蛋白(图1B） ●●●●。质谱分析明确地将75-kDa PINK1相关蛋白鉴定为TRAP1，这是一种普遍表达的蛋白，与HSP90AA1分子伴侣家族具有显著的序列同源性[21–23].

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TRAP1与野生型和突变型PINK1的相互作用

（A） 表达C-末端FLAG标记的野生型PINK1（Input）的HeLa细胞裂解液用抗FLAG M2亲和凝胶亲和纯化，洗脱液组分通过抗FLAG抗体免疫印迹分析。

（B） PINK1转染细胞和载体对照的亲和纯化蛋白在SDS-PAGE上进行解析，并通过Ponceau S染色进行检测。箭头表示通过质谱法鉴定为TRAP1、PINK1f和PINK1p的三个带。

（C） 多克隆抗PINK1抗体的特异性。通过抗PINK1和抗肌动蛋白抗体免疫印迹分析来自大鼠大脑、肝脏、未转染PC12细胞和表达野生型（WT）或突变PINK1。

（D） 内源性PINK1与TRAP1相互作用。用抗TRAP1抗体免疫沉淀PC12细胞裂解物（Input），然后用抗PINK1和抗RAP1抗体进行免疫印迹。IgG HC、IgG重链。

（E） 将转染FLAG标记的野生型或突变型PINK1的PC12细胞的裂解液用抗FLAG抗体进行免疫沉淀，然后用抗TRAP1和抗FLAG的抗体进行免疫印迹。

为了表征内源性PINK1蛋白及其与TRAP1的相互作用，我们制备了一种针对人类PINK1135–155氨基酸残基的兔抗PINK1多克隆抗体。Western blot分析表明，抗PINK1抗体（而非免疫前血清）特异性识别内源性PINK1.以及重组野生型和突变型PINK1-蛋白(图1C类；未显示其他数据）。使用这种抗PINK1抗体，我们发现内源性PINK1-全长和加工形式与TRAP1在PC12细胞中共同免疫沉淀(图1D） ，证实已确定的PINK1–TRAP1相互作用发生在体内。然后，我们评估了TRAP1与PD-linked PINK1突变体（G309D、W437X和L347P）的相互作用，以及与假定的催化失活PINK1-突变体（K219A、D362A、D384A和三重突变体K219A/D362A/D384A[KDD]）的相互影响。所检测的PINK1突变对PINK1结合TRAP1的能力没有任何显著影响(图1E） ●●●●。

PINK1在线粒体中与TRAP1结合

接下来，我们使用免疫荧光共聚焦显微镜分析了PINK1和TRAP1的细胞内分布和共定位。PINK1和TRAP1都在其N端含有预测的线粒体靶向信号，此前曾报道过PINH1的线粒体定位[12]以及TRAP1[23]. 与先前的研究一致，我们发现PINK1和TRAP1蛋白都定位于线粒体，线粒体被MitoTracker标记(图S1). 此外，双标记免疫细胞化学分析显示PINK1和TRAP1染色之间存在大量重叠(图S1)这表明这两种蛋白质在线粒体中共存。

为了补充我们的免疫细胞化学数据，我们使用亚细胞分离来表征PINK1和TRAP1的细胞内分布。Western blot分析显示，内源性PINK1和TRAP1在5%–15%的线性Optiprep梯度上与线粒体标记TIMM23明显共分，但与内质网标记CANX没有共分(图2A） 。对分离线粒体的进一步分离研究表明，内源性PINK1和TRAP1均主要存在于线粒体内膜和膜间空间部分(图2B） ●●●●。总之，这些结果为PINK1与线粒体中TRAP1的体内关联提供了有力支持。对表达野生型PINK1或PD-linked G309D、W437X和L347P突变PINK1的PC12细胞的类似分析表明，PINK1-与TRAP1在线粒体中的共定位不受致病性PINK1/突变的影响(图S2).

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PINK1和TRAP1在线粒体内膜和膜间隙中的克隆化

（A） PC12细胞的核后上清液在5%–15%的线性Optiprep梯度上进行分级，并通过免疫印迹分析PINK1、TRAP1、TIMM23和CANX的分级。

（B） 从PC12细胞分离的线粒体（Mito）被分为基质、内线粒体膜（IM）、膜间隙（IMS）和外线粒体膜（OM）组分，并通过免疫印迹分析PINK1、TRAP1和线粒体亚区标记物：HSPD1（基质）、TIMM23（IM。

PINK1磷酸化物TRAP1和激酶活性被PD-连锁突变抵消

我们发现TRAP1和PINK1之间存在特定的相互作用和共定位，这增加了TRAP1可能是PINK1-激酶底物的可能性。为了检验这种可能性，我们进行了体外激酶分析，以研究野生型和突变型PINK1磷酸化TRAP1的能力。我们观察到野生型PINK1强烈磷酸化TRAP1，如PINK1-介导的32P来自[γ-32P] ATP到TRAP1蛋白(图3A） 。PINK1激酶结构域的计算机模拟分析表明，氨基酸残基K219、D362和D384可能是PINK1催化活性的关键决定因素[11]. 为了验证这一预测，我们评估了这些残基对丙氨酸（K219A、D362A、D384A或KDD）的单一或三重突变对磷酸化TRAP1中PINK1激酶活性的影响。尽管K219A突变对PINK1激酶活性没有显著影响，但D362A、D384A和KDD三重突变显著降低了磷酸化TRAP1的PINK1活性(图3A和​和3B）。三B） ●●●●。PD-linked PINK1突变对TRAP1体外磷酸化的影响分析表明，致病性突变G309D或L347P实际上消除了PINK1的激酶活性。相反，W437X突变对PINK1的激酶活性没有显著影响(图3A和​和3三B） ●●●●。

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野生型和突变体PINK1对TRAP1的磷酸化作用

（A） 通过将纯化的TRAP1与[γ32-P] 如图所示，ATP在缺乏（对照）或存在FLAG标记的野生型（WT）或突变PINK1蛋白的情况下。通过放射自显影术（顶面板）观察磷酸化TRAP1。激酶分析中使用的PINK1和TRAP1蛋白通过抗TRAP1（中间面板）和抗FLAG抗体（底部面板）的免疫印迹显示。

（B） 野生型或突变型PINK1体外TRAP1磷酸化的正常水平。数据表示来自三个独立实验的平均值±标准误差（SEM）。*与野生型PINK1显著不同(第页< 0.01).

（C） 用400μM H处理表达野生型或突变PINK1或载体转染对照的PC12细胞2O（运行）2如图所示。内源性TRAP1的体内磷酸化通过使用抗TRAP1抗体进行免疫沉淀，然后使用抗磷酸丝氨酸（上面板）和抗TRAP1（下面板）抗体进行免疫印迹来测定。

（D） 野生型或突变型PINK1体内TRAP1磷酸化的正常水平。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。一与对应的H显著不同2O（运行）2-经处理的载体转染对照(第页< 0.01).b条与野生型PINK1转染细胞显著不同(第页< 0.01).

AU，任意单位。

接下来，我们研究了野生型或突变型PINK1过度表达对PC12细胞内源性TRAP1体内磷酸化的影响。如所示图3C、 我们在未转染的PC12细胞中观察到TRAP1磷酸化的基础水平较低。TRAP1磷酸化显著增加，以应对H诱导的氧化应激2O（运行）2野生型PINK1的过度表达导致TRAP1磷酸化的基础水平增加3.3倍，氧化压力诱导的TRAP1磷酸化增加2.2倍(图3C和​和3D）。三D） ●●●●。PINK1促进体内TRAP1磷酸化的能力被PD-linked PINK1G309D和L347P突变所抵消。事实上，过度表达G309D或L347P突变体PINK1的细胞与未转染细胞相比，其基础和氧化压力诱导的TRAP1磷酸化水平大约降低了50%(图3C和​和3D）。三D） ●●●●。由于G309D和L347P突变没有改变PINK1与TRAP1的相互作用或共定位(图1我们的结果表明，这些致病性PINK1突变体通过与内源性PINK1竞争底物TRAP1的结合，在体内对TRAP1磷酸化具有显性负效应。有趣的是，尽管W437X突变对PINK1介导的体外TRAP1磷酸化没有显著影响(图3A和​和3B），三B） 与野生型PINK1相比，该突变导致体内基础和氧化压力诱导的TRAP1磷酸化水平降低30%至45%(图3C和​和3D）。三D） ●●●●。这些结果表明，W437X突变对体内磷酸化TRAP1的PINK1激酶活性具有抑制作用。

PINK1对氧化应激诱导的细胞死亡的保护作用取决于其激酶活性

鉴于PINK1对TRAP1氧化-压力诱导磷酸化的观察效果(图3)，我们研究了野生型和突变型PINK1蛋白在细胞氧化应激易感性中的作用。用C-末端FLAG标记的野生型或突变型PINK1转染PC12细胞，以获得类似水平的外源性PINK1-蛋白表达，如Western blot分析所证实的（数据未显示）。细胞活性测定显示，用H2O（运行）2导致细胞死亡(图4A；以及未显示的其他数据）。表达外源性野生型PINK1的细胞对H的抗性更强2O（运行）2-诱导细胞死亡(图4A） 支持PINK1对氧化应激的保护作用。PINK1的保护作用因假定的激酶死亡K219A突变而显著降低，并被催化失活的D362A、D384A和KDD三重突变完全消除(图4A） 表明PINK1的细胞保护功能依赖于其激酶活性。

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野生型PINK1，但非激酶-铅或PD-连锁突变型PINK1，可防止氧化应激诱导的细胞凋亡

（A） 用400μM H处理表达野生型（WT）或突变PINK1的PC12细胞或转染载体的对照细胞2O（运行）2用MTT法评估细胞存活的程度。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。一与转染载体的对照组显著不同(第页< 0.01).b条与野生型PINK1转染细胞显著不同(第页< 0.01).

（B） 400μM H处理后表达野生型或突变型PINK1的PC12细胞分离的细胞液和线粒体部分细胞色素c（Cyt.c）的免疫印迹分析2O（运行）2在指定的时间内。

（C） 释放到胞质溶胶的细胞色素C的水平被标准化为每个细胞样品中细胞色素C的总水平。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。一与相应的H显著不同2O（运行）2-经处理的载体转染对照(第页< 0.01).b条与野生型PINK1转染细胞显著不同(第页< 0.01).

PD-linked PINK1突变对细胞易损性的影响分析表明，致病性W437X突变显著降低了PINK1抵抗氧化压力诱导的细胞死亡的能力(图4A） 。我们发现致病性G309D和L347P突变不仅破坏了PINK1的细胞保护作用，而且加剧了氧化应激诱导的细胞死亡(图4A） 这表明这些突变对细胞存活有显著的负面影响。

PINK1通过抑制线粒体释放细胞色素c防止氧化应激诱导的细胞死亡

观察到的线粒体定位(图2)和细胞保护作用(图4A） PINK1的表达增加了PINK1调控线粒体细胞死亡途径的可能性。为了测试这种可能性，我们检测了野生型和突变型PINK1蛋白过度表达对线粒体释放细胞色素c的影响，这是线粒体凋亡级联的关键步骤。如所示图4B、 H对载体转染PC12细胞的治疗作用2O（运行）2以时间依赖的方式诱导细胞色素c从线粒体释放到胞浆。在相同的氧化应激条件下，野生型PINK1的过度表达导致细胞色素c的释放显著减少(图4B和​和4C）。4C） ●●●●。PINK1对细胞色素c释放的抑制作用被催化失活的D362A突变和KDD三重突变完全消除(图4B和​和4C），4C） 提示PINK1激酶活性在线粒体凋亡途径调控中起关键作用。

PD-linked PINK1突变对细胞色素c释放的影响分析表明，W437X突变导致H2O（运行）2-与表达类似水平外源性野生型PINK1的细胞相比，诱导细胞色素c释放(图4B和​和4C），4C） 与W437X突变对PINK1细胞保护功能的观察结果一致(图4A） 。致病性G309D和L347P突变不仅破坏了PINK1抑制细胞色素c释放的能力，而且加速了H2O（运行）2-诱导细胞色素c释放(图4B和​和4C），4C） 与这些突变对细胞生存的主要负面影响一致(图4A） 。Western blot分析证实PINK1在线粒体和胞浆组分中的相对分布没有被H2O（运行）2这表明，野生型和突变型PINK1蛋白对细胞生存的影响是通过其在线粒体中对细胞色素c释放的作用而不是通过改变PINK1的亚细胞定位来介导的。

PINK1对TRAP1磷酸化和抗氧化应激诱导细胞凋亡的保护作用至关重要

为了进一步证明PINK1在调节TRAP1磷酸化和线粒体凋亡信号中的作用，我们检测了siRNA-介导的PINK1敲低对TRAP1磷酸化和氧化应激诱导的凋亡的影响。如所示图5A、 PINK1 siRNA-1和PINK1-siRNA-2是针对PINK1mRNA不同区域的两种不同的siRNA双工体，它们都特异性抑制PC12细胞内源性PINK1的表达。我们发现，在PINK1 siRNA-1或PINK1-siRNA-2转染的细胞中，H2O（运行）2-与转染非靶向（NT）对照siRNA或仅转染载体的细胞相比，内源性TRAP1诱导的磷酸化显著降低(图5B和​和5C）。5C） ●●●●。这些结果进一步证实TRAP1确实是PINK1激酶的底物。

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PINK1敲除降低TRAP1磷酸化和抗氧化应激保护作用

（A） 用载体（对照）、NT siRNA或PINK1特异性siRNA（PINK1-siRNA-1和PINK1-siRNA-2）转染PC12细胞。用抗PINK1和抗肌动蛋白抗体免疫印迹法分析细胞裂解液中PINK1和肌动蛋白的水平。

（B） 用400μM H处理转染有所示siRNA或载体（对照）的PC12细胞2O（运行）2在指定的时间内。内源性TRAP1的体内磷酸化通过使用抗TRAP1抗体进行免疫沉淀，然后使用抗磷丝氨酸和抗TRAP1-抗体进行免疫印迹来测定。

（C） 对照细胞和siRNA-转染细胞体内TRAP1磷酸化的正常水平。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。*与相应的H显著不同2O（运行）2-处理过的对照细胞(第页< 0.01). AU，任意单位。

（D） 用400μM H处理转染载体（对照）或所示siRNAs的PC12细胞2O（运行）2用MTT法评估细胞活力。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。*与H显著不同2O（运行）2-处理过的对照细胞(第页< 0.01).

（E） 用编码增强型绿色荧光蛋白（pEGFP）的表达载体和载体（对照）或指示的siRNAs共同转染PC12细胞，用400μM H2O（运行）216h后，绿色荧光蛋白（GFP）发出绿色荧光，显示转基因细胞，DAPI染色（蓝色）显示细胞核形态。箭头表示转染细胞有凋亡细胞核。比例尺，10μm。

（F） 凋亡是指转染细胞的细胞核形态发生凋亡的百分比。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。*与H显著不同2O（运行）2-处理过的对照细胞(第页< 0.01).

细胞活力和核形态分析表明，PINK1 siRNA-1或PINK1 siRNA-2对内源性PINK1的耗竭增强了PC12细胞对氧化应激诱导的凋亡的易感性(图5D–5F） ●●●●。此外，PINK1缺失显著增加了氧化压力诱导的细胞色素c从线粒体向胞浆的释放(图6). 总之，这些数据为PINK1在线粒体凋亡途径调控中的关键作用提供了有力的支持。

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PINK1耗竭增加线粒体释放细胞色素c

（A） 用400μM H处理转染有所示siRNA或载体（对照）的PC12细胞2O（运行）2在指定的时间内。用抗细胞色素c和抗肌动蛋白抗体免疫印迹法测定细胞液中细胞色素c（Cyt.c）和肌动蛋白的水平。

（B） 释放到细胞液中的细胞色素c水平与每个细胞样本中的肌动蛋白水平标准化。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。*与相应的H显著不同2O（运行）2-处理过的对照细胞(第页< 0.01). AU，任意单位。

（C） 用400μM H处理与pEGFP和载体（对照）共转染的PC12细胞或指示的siRNAs2O（运行）2用相控显微镜（灰色）观察细胞形态，用绿色荧光蛋白（GFP）发出的绿色荧光观察转染细胞，用抗细胞色素c抗体（红色）免疫染色检测细胞色素c的细胞分布。线粒体细胞色素c染色的转基因细胞用箭头表示，细胞色素c扩散染色的细胞用箭头指示。比例尺，10μm。

（D） 显示细胞色素c释放的转染细胞百分比的定量。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。*与H显著不同2O（运行）2-处理过的对照细胞(第页< 0.05).

TRAP1是PINK1介导的抗氧化应激诱导细胞凋亡保护所必需的

我们发现PINK1对TRAP1的磷酸化与PINK1的抗凋亡活性相关，这增加了TRAP1可能是PINK1-与凋亡抑制之间的中间产物的可能性。为了验证这种可能性，我们研究了siRNA-介导的TRAP1敲低对PINK1细胞保护功能的影响。使用两种不同的TRAP1靶向siRNAs（TRAP1 siRNA-1和TRAP1 siRNA-2）来降低PC12细胞内源性TRAP1的表达。Western blot分析表明，TRAP1 siRNA-2引起的TRAP1蛋白水平的下降大于TRAP1 siRNA-1，而NT对照siRNA对TRAP1的表达没有影响(图7A） 。对细胞活力、细胞核形态和细胞色素c释放的分析表明，TRAP1缺失导致氧化应激诱导的细胞色素c的释放和细胞死亡显著增加(图7B–7F） ●●●●。我们发现，与对照组中过度表达野生型PINK1的保护作用相反(图4)或在NT siRNA处理的PC12细胞中(图7)，野生型PINK1在TRAP1缺失的PC12细胞中的过度表达不再能够抑制氧化应激诱导的细胞色素c释放和细胞死亡(图7B–7F） ●●●●。此外，PD-linked G309D和L347P突变体PINK1对细胞存活的主要负面影响(图4)也被TRAP1耗竭所废除(图7B–7F） ●●●●。综上所述，这些结果提供了证据支持TRAP1作为PINK1的下游效应器在保护机体免受氧化压力诱导的凋亡中的作用。

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TRAP1耗竭消除野生型和突变型PINK1对细胞氧化应激易感性的影响

（A） 用载体（对照）、NT siRNA或TRAP1特异性siRNA（TRAP1 siRNA-1和TRAP1 siRNA-2）转染PC12细胞。用抗TRAP1和抗肌动蛋白抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物中TRAP1和肌动蛋白的水平。

（B） 如图所示，用TRAP1 siRNA-2或NT siRNA处理的PC12细胞未被转染（UT）或转染野生型（WT）或突变型PINK1。以车辆处理的非转染PC12细胞作为对照。细胞暴露于400μM H2O（运行）2用MTT法评估细胞存活的程度。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。*，第页< 0.05; ns，不显著。

（C） 用400μM H处理与pEGFP和载体（对照）共转染的PC12细胞或指示的siRNAs和PINK1质粒2O（运行）216 h后，通过DAPI染色细胞核的形态学分析确定细胞凋亡的程度。定量转染细胞的凋亡细胞核形态百分比。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。*,第页< 0.05; ns，不显著。

（D） 用抗细胞色素c和抗肌动蛋白抗体免疫印迹法测定（B）所述细胞胞浆组分中细胞色素c（Cyt.c）和肌动蛋白的水平。

（E） 释放到细胞液中的细胞色素c水平与每个细胞样本中的肌动蛋白水平标准化。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。*,第页< 0.01; ns，不显著。AU，任意单位。

（F） 用pEGFP和载体（对照）或指示的siRNA和PINK1质粒共转染的PC12细胞用400μ2O（运行）216h后，用抗细胞色素c抗体免疫染色检测细胞色素c的细胞分布。定量显示细胞色素c释放的转染细胞百分比。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。*,第页< 0.05; ns，不显著。

鉴于我们的结果，TRAP1定位于线粒体内膜和细胞色素c所在的膜间空间(图2B） 接下来，我们研究了TRAP1是否可以通过与细胞色素c直接结合来发挥其抗凋亡功能，从而阻止其从线粒体释放。在缺乏或存在野生型或突变型PINK1或氧化应激条件下，共免疫沉淀实验未能发现TRAP1与细胞色素c的物理联系(图S3)反对TRAP1介导的细胞色素c释放抑制通过直接相互作用/保留机制发生的可能性。

讨论

虽然推测的激酶PINK1的突变是常染色体隐性遗传PD的常见原因，但对PINK1的生物学功能以及PINK1功能的丧失如何导致神经退行性变知之甚少。本研究表明，PINK1是一种线粒体丝氨酸/苏氨酸激酶，在促进细胞存活方面起着关键作用。我们已经确定了PINK1激酶的第一个底物：线粒体分子伴侣TRAP1。我们的发现揭示了迄今为止尚未探索的PINK1磷酸化下游效应器TRAP1以保护细胞免受凋亡的途径，并表明这种新的线粒体途径的损伤与PD的神经退行性变之间存在联系。

越来越清楚的是，分子伴侣不仅促进蛋白质折叠，而且还调节许多细胞过程，包括细胞存活和凋亡[24,25]. 尽管线粒体在细胞功能和生存中至关重要，但目前关于线粒体分子伴侣的知识有限。TRAP1是一种特征不佳的线粒体蛋白，与HSP90AA1分子伴侣家族具有显著的序列同源性[23]. 我们的发现是，siRNA-介导的TRAP1缺失使细胞对氧化应激诱导的细胞色素c释放和细胞死亡敏感，这表明TRAP1在调节线粒体凋亡级联中发挥作用。与此作用相一致，TRAP1敲除可增强其他应激源诱导的细胞色素c释放和细胞凋亡，如蛋白酪氨酸激酶抑制剂β-羟基异戊基紫草素和拓扑异构酶II抑制剂VP16[26]. TRAP1抗凋亡功能的分子基础尚不清楚。虽然我们发现TRAP1和细胞色素c在线粒体膜间空间共定位，但我们的结果表明，无论是在没有或存在氧化应激的情况下，TRAP1都与细胞色素c没有物理联系。因此，TRAP1可能通过直接相互作用/滞留以外的机制抑制线粒体细胞色素c的释放。需要进一步研究来阐明TRAP1调节细胞色素c释放和凋亡的机制。

我们的数据显示，内源性TRAP1在低水平下被组成型磷酸化，并且TRAP1磷酸化在H诱导的氧化应激反应中显著增加2O（运行）2PINK1的过度表达显著增强了组成性和氧化压力诱导的TRAP1磷酸化，而PINK1-的siRNA-介导的缺失则减少了组成性TRAP1的磷酸化，这表明PINK1是负责细胞内TRAP1磷酸化的主要激酶。这些结果以及体外磷酸化数据提供了令人信服的证据，证明TRAP1是PINK1激酶的真正底物。我们发现，PINK1的过表达通过抑制线粒体细胞色素c的释放来保护细胞免受氧化应激诱导的凋亡，而PINK1的这种保护作用取决于其磷酸化TRAP1的激酶活性。相反，PINK1缺失导致线粒体细胞色素c释放增加，并使细胞对氧化压力诱导的细胞死亡敏感，PINK1缺失的促凋亡作用与TRAP1磷酸化降低相关。此外，我们使用TRAP1 siRNAs的研究提供了直接证据，证明TRAP1是PINK1介导的对氧化压力诱导的细胞色素c释放和细胞死亡的保护所必需的。总之，这些发现指出了PINK1通过磷酸化下游效应器TRAP1抑制线粒体释放细胞色素c来发挥其细胞保护功能的特定途径。

我们的研究表明，线粒体PINK1–TRAP1抗凋亡途径被PD-linked PINK1G309D、L347P和W437X突变所破坏。以前使用体外自磷酸化试验和人工激酶底物对PINK1突变进行的研究导致了相互矛盾的结果。例如，用纯化自大肠杆菌表明G309D突变使PINK1的自磷酸化活性略有降低[11,12]W437X突变显著增加[12]这些突变都不影响PINK1磷酸化人工底物α-酪蛋白的活性[12]. 相反，最近一项使用杆状病毒感染者分离的重组PINK1蛋白的研究sf9系列昆虫细胞未能检测到PINK1的自磷酸化活性，但表明PINK1C末端截短降低了PINK1的活性，使其磷酸化人工底物组蛋白H1[27]. 这些差异强调了了解生理底物对于表征野生型和突变体PINK1的激酶功能的重要性。我们的分析表明，单个G309D和L347P突变在体内外都会破坏PINK1的激酶活性，使其生理底物TRAP1磷酸化。相比之下，W437X突变对PINK1介导的TRAP1磷酸化的影响较弱。我们的发现是，PD-linked突变损害PINK1促进TRAP1磷酸化和细胞存活的能力，这为携带纯合子PINK1突变的家族性PD患者的功能丧失致病机制提供了有力支持。

最近，越来越多的帕金森病患者的杂合突变仅影响一种粉红色1已报道等位基因，包括单一杂合G309D和W437X突变[6–10]. 我们的结果是，PD-linked PINK1突变在不影响PINK1-底物结合或亚细胞定位的情况下特异性抑制PINK1-kinase功能，这增加了一个有趣的可能性，即这些突变可能以显性负向方式抑制正常人的功能粉红色1与内源性野生型PINK1竞争结合其底物TRAP1的等位基因。为了支持这种可能性，我们发现PD-linked PINK1 G309D和L347P突变对体内TRAP1磷酸化和细胞存活具有显著的负面影响。这些结果表明杂合PINK1突变导致帕金森病症状的主要负致病机制[6,7,9]. 相比之下，过表达研究表明，W437X突变对体内TRAP1磷酸化和细胞存活具有较小但显著的抑制作用，为杂合W437X突变的致病作用提供了证据。我们发现线粒体PINK1–TRAP1抗凋亡通路及其因PD-linked突变而受损，这为PD的发病机制提供了新的见解，并为治疗干预提供了新靶点。

材料和方法

质粒和抗PINK1抗体。

常规分子生物学技术[28]用于产生C-末端FLAG标记的人类PINK1（PINK1-FLAG）、PD-linked G309D、W437X和L347P突变体PINK1，以及推测的催化失活PINK1-突变体K219A、D362A、D384A和KDD三重突变体。在兔子中培养了一种针对人类PINK1的135–155氨基酸的多克隆抗PINK1-抗体，并按前述方法纯化亲和力[29].

亲和纯化和质谱分析。

在含有50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1%Triton X-100和蛋白酶抑制剂混合物（Sigma，网址：http://www.sigmaaldrich.com). 用抗FLAG M2亲和凝胶（Sigma）对裂解产物进行亲和纯化。将标记有FLAG的PINK1蛋白复合物洗脱成1ml组分，并用抗FLAG抗体进行免疫印迹分析（罗氏应用科学，http://www.roche-applied-science.com). 将含有FLAG标记的PINK1蛋白的级分合并并在SDS-PAGE上解析。然后将蛋白质转移到PVDF膜上，然后进行Ponceau S染色。如前所述，从膜上切下蛋白质带，用胰蛋白酶消化，并用纳米电喷雾串联质谱分析[30,31].

细胞转染和免疫沉淀。

使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，http://www.invitrogen.com网站)和TransIT神经元转染试剂（Mirus，http://www.mirusbio.com网站)分别按照制造商的说明。如前所述，在转染后24小时进行免疫沉淀[32]使用指示的抗体。免疫复合物通过SDS-PAGE溶解并通过免疫印迹分析[32].

体外和体内磷酸化分析。

按照所述进行体外激酶分析[33]通过将亲和纯化的FLAG标记的野生型或突变型PINK1与TRAP1在30°C的100μl反应缓冲液中孵育20分钟，反应缓冲液含有50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、8 mM MgCl2，2 mM氯化锰2，0.1 mM ATP和5μCi的[γ-32P] ATP。反应混合物通过SDS-PAGE进行解析，磷酸化TRAP1通过放射自显影术进行可视化。体外TRAP1磷酸化的相对水平通过量化32P并入TRAP1，并根据总TRAP1水平进行标准化。为了检测体内TRAP1磷酸化，使用抗TRAP1抗体（BD Biosciences，http://www.bdbiosciences.com)然后用抗磷丝氨酸抗体（Invitrogen）进行免疫印迹。通过测量磷酸丝氨酸免疫活性带的强度来确定体内TRAP1磷酸化的相对水平，并根据总TRAP1水平进行标准化。

免疫荧光共聚焦显微镜。

如前所述进行双标记间接免疫荧光显微镜检查[29,34,35]. 用MitoTracker（分子探针，http://probes.invitrogen.com)固定之前。然后用所示抗体对细胞进行免疫染色，并用蔡司检测(网址：http://www.zeiss.com)LSM 510共焦显微镜。

亚细胞分离。

为了分离线粒体和其他细胞器，PC12细胞在5%–15%线性Optiprep（Nycomed，http://www.nycomed.com网站)如上所述的梯度[32]. 对于亚线粒体分离，通过差速离心将从PC12细胞分离的线粒体进一步分离到基质、线粒体内膜、膜间隙和线粒体外膜部分，如所述[36].

siRNA转染。

对于PC12细胞中PINK1或TRAP1的缺失，siRNAs（Dharmacon，网址：http://www.dharmacon.com)针对以下大鼠PINK1或TRAP1 mRNA序列产生：PINK1 siRNA-1，5′-CAAGUCCGACAACAUACU-3′；PINK1 siRNA-2，5′-GCGUGUGGCCUGCAGUUA-3′；TRAP1 siRNA-1，5′-GCAAAAGAUUUCGCCAACGA-3′；和TRAP1 siRNA-2，5′-GAACAUUCACCCUAUG-3′。使用不具有已知哺乳动物同源性的对照siRNA（siCONTROL非靶向siRNA#1，Dharmacon）作为阴性对照。如前所述，使用TransIT siQUEST（Mirus）试剂将指示的siRNAs转染PC12细胞[37].

细胞活力和凋亡测定。

用H处理PC12细胞2O（运行）2如图所示，并使用所述的3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）分析评估细胞活力[38]. 如前所述，通过对用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，Molecular Probes）染色的细胞核进行形态学评估来测量凋亡细胞的死亡[39]. 以盲法对细胞核收缩和染色质凝集的转染细胞的凋亡百分比进行评分。

细胞色素c释放分析。

细胞色素c释放的生化分析如所述进行[40]. 简言之，将PC12细胞匀浆，然后分为线粒体和胞质溶胶部分。用抗细胞色素c抗体（克隆7H8.2C12，BD Biosciences）免疫印迹法测定细胞色素c从线粒体释放到细胞液中。对于基于细胞的细胞色素c释放测定，细胞色素c的细胞分布通过免疫荧光共聚焦显微镜使用抗细胞色素c抗体（克隆6H2.B4，BD Biosciences）进行测定，如下所述[41]. 从点状细胞色素c免疫染色模式过渡到弥散细胞色素c染色模式，表明细胞色素c从线粒体释放到胞浆。以盲法对显示细胞色素c释放的转染细胞百分比进行评分。

统计分析。

使用方差分析和Tukey的事后分析对数据进行统计分析。

支持信息

图S1

PINK1与TRAP1在线粒体中的克隆化：

用MitoTracker（B和E）、抗FLAG（A）、抗TRAP1（D和H）和抗HA（G）抗体的双标记共聚焦显微镜分析未转染HeLa细胞（D–F）或表达PINK1-FLAG（A–C）或PINK1-HA（G–I）的HeLa转染细胞。比例尺，10μm。

（12 MB TIF）

图S2

PD-Associated PINK1突变对PINK1-与TRAP1的线粒体克隆化没有影响：

从表达野生型PINK1或PD-linked G309D、W437X或L347P突变型PINK1的转染PC12细胞中分离出的线粒体（Mito）被分为基质、内线粒体膜（IM）、膜间隙（IMS）和外线粒体膜（OM）部分，并通过免疫印迹分析PINK1和TRAP1。

（1.6 MB TIF）

图S3

在缺乏或存在PINK1和氧化应激的情况下，TRAP1与细胞色素c无关：

（A） 用抗TRAP1抗体免疫沉淀来自表达野生型（WT）PINK1或所示突变PINK1的未转染（UT）或转染PC12细胞的裂解液，然后用抗TRAP2和细胞色素c（Cyt.c）抗体免疫印迹。“输入”通道显示未转染PC12细胞裂解液中内源性TRAP1和细胞色素c的水平。

（B） 表达野生型PINK1或载体转染对照的PC12细胞在存在或不存在400μM H的条件下培养2O（运行）2对细胞裂解物（输入物）进行抗TRAP1的免疫沉淀，然后使用抗RAP1和细胞色素c（Cyt.c）的抗体进行免疫印迹。

（1.2 MB TIF）

缩写

DAPI公司4′，6-二氨基-2-苯基吲哚
KDD公司K219A/D362A/D384A
MTT公司3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴
NT公司非针对性
PD公司帕金森病
粉红色1PTEN诱导的假定激酶1
扫描电镜平均值标准误差
小干扰RNA小干扰RNA
TRAP1型TNF受体相关蛋白1

脚注

作者贡献。所有作者都构思并设计了实验。JWP、JAO和LSC进行了实验并分析了数据。LSC提供的试剂/材料/分析工具。JWP、JAO和LL撰写了论文。

基金。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款NS050650（LSC）、NS047199和AG021489（LL）的支持。

相互竞争的利益。提交人声明，不存在相互竞争的利益。

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