自噬：自噬的分子机制

摘要

引言

正常的细胞发育和生长需要蛋白质合成和降解之间的良好调节平衡。真核细胞有两种主要的降解途径，蛋白酶体和自噬。自噬，字面意思是“自噬”，参与长寿命细胞溶质蛋白质和细胞器的大量降解，而泛素蛋白酶体系统降解特定的短命蛋白质。伴侣介导的自噬是一种机制，可降解含有特定五肽共有基序的细胞溶质蛋白。^1,2因此，它的降解能力有限，本综述将不再讨论。另外两种类型的自噬是宏观自噬和微观自噬。^三,4这两种途径都涉及动态的膜重排，与蛋白酶体降解不同，终止于溶酶体/液泡。微自噬是通过限制膜的突起、分隔和/或内陷，直接吞噬降解细胞器表面的细胞质。另一方面，大自噬涉及将细胞质隔离在一个称为自噬体的双层细胞溶质囊泡中(图1). 自噬体的形成被认为发生在空泡周围的自噬前结构（PAS）。^5,6直径为300-900 nm的完整自噬体与溶酶体/液泡融合，内部的单膜小泡被释放到腔中。产生的自噬体被溶解，内容物被降解，产生的大分子被回收。在这篇综述中，我们主要关注宏观自噬，以下称为自噬。

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图1

酵母自噬和Cvt途径。形态学步骤如自噬和Cvt途径所示。这两种途径都需要将货物成分隔离在不同的双层膜囊泡中，这种囊泡的形成被认为发生在PAS中。自噬是由Tor激酶在饥饿条件下失活诱导的，例如氮耗尽。器官和大量细胞质被隔离在一个直径为300-900 nm的双膜自噬体中。Cvt途径是一个生物合成过程，在营养条件下将包括Ape1在内的常驻水解酶传递到液泡。Cvt囊泡（直径140-160 nm）包裹特定货物，例如prApe1低聚物（Ape1复合物）。在饥饿条件下，Ape1复合体也被自噬体特异性隔离。一旦完成，双膜囊泡靶向液泡并与液泡融合，单膜囊泡（自噬或Cvt小体）释放到腔中。随后，这些小泡被降解，通过去除其前肽使prApe1成熟为成熟形式（mApe1），并降解细胞质。荧光图像显示，货物蛋白CFP-Ape1定位于YFP-Atg8标记的空泡周围PAS（白色箭头）；液泡在合并图像中用FM4-64标记。DIC，差分干涉对比度

自噬在从酵母到哺乳动物的真核生物中具有进化上的保守性，并在各种细胞功能中发挥着重要作用。^三,7,8例如，在酵母中，营养素饥饿会诱导高度的自噬，这会使多余的蛋白质被降解，氨基酸被循环用于合成对生存至关重要的蛋白质。在高等真核生物中，自噬也被诱导，以应对动物出生时在切断跨塑性食物供应后发生的营养物质耗竭，以及以营养素为目标的培养细胞和组织的营养物质消耗。^9,10此外，自噬参与生理细胞过程，如寿命延长、细胞发育和分化。⁸自噬可能对一些人类疾病的进展起到保护作用，包括癌症、肌肉疾病和神经变性，如亨廷顿病、阿尔茨海默病和帕金森病，^8,11,12作为细胞防御机制，防止某些病原细菌和病毒的感染；^12-14相反，有证据表明自噬与II型程序性细胞死亡有关，可能与某些疾病的病理学有关。^4,15

20世纪60年代首次在哺乳动物细胞中发现了自噬现象；然而，这一过程的分子机制直到最近才开始被阐明。通过鉴定参与自噬过程的基因，在研究自噬的分子基础方面取得了突破，^16,17在酵母中被称为自噬相关（ATG）基因。¹⁸在面包酵母和甲基营养酵母中，分别从生物合成细胞质到液泡靶向（Cvt）途径和pexophagy（过氧化物酶体降解）的研究中发现了ATG基因。^19,20目前，有27个ATG基因的产物似乎对酵母中已鉴定的ATG过程具有特异性。¹⁸此外，早期分泌途径所需的成分以及与液泡融合的成分都是自噬所必需的。^21-23众所周知，生物合成的Cvt和降解的自噬途径在拓扑和形态上相似，并共享Atg的大部分成分(图1).^24-26然而，与自噬相反，Cvt途径是一个高度选择性的过程，涉及至少两种特定货物的隔离，这两种货物是常驻液泡水解酶，氨肽酶I（Ape1）和α-甘露糖苷酶（Ams1）。^27,28这些蛋白质在一个称为Cvt囊泡的双膜囊泡中进行序列分析。除了货物选择性的差异外，Cvt囊泡似乎排除了大量胞液，自噬和Cvt途径之间的囊泡大小存在显著差异；Cvt囊泡大小相当一致，远小于自噬体，直径为140-160 nm。²⁶类似地，在吞咽过程中形成的隔离囊泡（pexocaphasome）似乎只包裹过氧化物酶体，尽管它可能比Cvt囊泡大得多，以容纳其货物。²⁹

对酵母菌的研究提高了我们对自噬、pexophagy和Cvt途径所需的分子机制的理解。此外，最近在哺乳动物、昆虫、蠕虫和植物等高等真核生物中发现了ATG基因产物的直系同源序列，并对其功能进行了表征，并且已经证明在上述ATG细胞功能中发挥着重要作用。^三,8这些发现表明，在酵母中发现的自噬分子机制也普遍用于各种其他真核细胞。这篇综述总结了我们目前对自噬分子机制的理解，重点是酵母。

自噬的调节和诱导

在正常生长条件下，自噬发生在基础水平；然而，某些类型的环境压力会导致戏剧性的诱导。例如，酵母菌自噬是由营养饥饿引起的，包括氮和碳的消耗。雷帕霉素（Tor）的蛋白激酶靶点是一种负调控因子，对氮水平有特异性反应，尽管Tor上游的营养传感器未知。³⁰在营养丰富的条件下，Tor激酶是活性的，自噬被抑制，而在营养缺乏的条件下Tor是失活的，自吞噬活性增强。Tor蛋白（mTor）在哺乳动物细胞中是保守的，也能感知环境变化来调节自噬，但其调节机制可能比酵母中的更复杂。^31,32在哺乳动物细胞中，mTor上游的负调控级联包括I类磷脂酰肌醇（PtdIns）3-激酶、PDK1和Akt/PKB，而磷酸酶PTEN与PtdIns3-激酶拮抗，诱导自噬。

在酵母中，Tor控制Atg13的磷酸化状态，Atg13是自噬所需的蛋白质之一(图2).^33,34在营养丰富的条件下，Atg13被高度磷酸化，对Atg1激酶的亲和力较低；在这种情况下，自噬被抑制。相反，在饥饿条件下或在接受Tor抑制剂雷帕霉素治疗后，Atg13会快速部分地去磷酸化，并以较高的亲和力与Atg1相互作用。这些变化与自噬活性的增加有关。Atg1是Atg蛋白中唯一的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，³⁵对Cvt途径和自噬都至关重要；²⁴然而，与这两条通路相关的Atg1激酶活性的要求尚不明确。一份报告显示，由Atg13调节的Atg1激酶活性是自噬所必需的。³⁴根据该模型，用雷帕霉素或通过饥饿抑制Tor可以使低磷酸化的Atg13与Atg1相互作用，导致Atg1激酶活性和自噬增加，尽管Atg1的下游靶点尚不清楚。相反，另一项研究表明，Cvt途径需要更高水平的Atg1激酶活性。³⁶在这种情况下，虽然仍需要较低水平的激酶活性，但Atg1被认为在自噬过程中具有主要的结构作用。Atg1激酶活性的作用仍有争议；然而，Atg1激酶复合物可能在诱导和调节中发挥重要作用，可能在Cvt途径和自噬之间转换模式以响应环境变化。

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图2

自噬诱导的调控复合体。Tor激酶在感知营养状况时调节自噬的诱导。Atg1激酶对自噬和Cvt途径都至关重要，它与几种蛋白质形成复合物，其特征是优先参与Cvt通路（白色圆圈）或自噬（深灰色圆圈）。在营养丰富的条件下，Tor激酶是活性的，Atg13被过度磷酸化。这种高度磷酸化的Atg13与Atg1和Atg17的亲和力较低，并且自噬被下调。在饥饿条件下，Tor处于非活性状态，Atg13处于亚磷酸化状态。去磷酸化的Atg13与Atg1和Atg17以较高的亲和力相互作用。Atg1-Atg13-Atg17复合物的形成增强介导了自噬的诱导。Atg20-Atg24复合体、Atg11和Vac8也可能属于该复合体，但尚未确定所描述的完整完整复合体

Atg1-Atg13复合物还与多种蛋白质相互作用，如Vac8、Atg11和Atg17。^34,37,38Atg11和Vac8也被磷酸化，独立于Atg1Atg13复合物，尽管其磷酸化作用未知。³⁷在饥饿条件下，Atg17是自噬所必需的，但在营养丰富的条件下，Cvt途径不需要Atg17。³⁴最近的报告显示，atg17Δ细胞中存在较小的自噬体，直径近200 nm。^39,40这些异常的自噬体允许摄取前体Ape1（prApe1），但在pexophagy中有缺陷，并导致大量自噬显著减少。在没有Atg1的情况下，Atg17与Atg13相互作用，但反之亦然，这表明Atg17是通过与Atg3的直接相互作用与Atg1-Atg13复合体组装的。这种Atg17相互作用似乎在自噬体生物发生的调节中起着重要作用；不能与Atg1-Atg13复合物相互作用的Atg17突变体降低了自噬水平。这些结果表明，Atg1-Atg13-Atg17复合物可能在自噬中发挥作用，与诱导作用分离，并可能参与控制自噬体的形成，特别是决定囊泡的最终大小。虽然Atg1在哺乳动物中是保守的，但尚不清楚Atg1同源物在哺乳动物自噬系统中的作用。相反，在哺乳动物中没有发现Atg13和Atg17同源物。

选择性自噬/Cvt途径

自噬通常被认为是一个涉及大量细胞质成分降解的过程，这些细胞质成分非特异性地被隔离在自噬体中。然而，有一些特定的货物可供自噬。在酵母中，如酿酒酵母、毕赤酵母、多形汉森酵母和溶脂雅罗华酵母，过氧化物酶体通过微观和宏观自噬过程被特异性隔离和降解。^29,41-43当酵母菌生长在需要过氧化物酶体进行代谢的碳源上时，过氧化物酶会增殖。转移到另一种碳源，如葡萄糖，会使多余的过氧化物酶体过剩，并迅速消除。在营养丰富的条件下，与饥饿相反，过氧化物酶体的特异性降解被称为pexophagy。微噬和巨噬似乎涉及与非特异性自噬相同的机制，²⁹尽管Atg11是Cvt途径的特异性因子，在过氧化物酶体的特异性降解中起作用，但所有使pexophagy特异性的成分尚未阐明。即使在大量自噬的情况下，也有报道称至少有一种蛋白质，即胞浆乙醛脱氢酶或Ald6，相对于其他胞浆蛋白质优先被隔离在自噬体中。⁴⁴

prApe1被隔离在Cvt小泡或自噬体中，这取决于营养条件，并传递到液泡。自噬和Cvt途径在拓扑和机制上相似，并共享大部分相同的机制(图1).^24-26最近，prApe1的选择性识别和包装机制已经得到了比较好的阐明(图3). 前Ape1蛋白在胞浆中合成。⁴⁵合成后，prApe1形成十二聚体，这些十二聚体进一步组装成一个更大的低聚物结构，称为Ape1复合物，其过程依赖于prApe1前肽。⁴⁶Ape1复合物最终包裹在空泡周围PAS的Cvt小泡或自噬体中。^26,47,48

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图3

货物的选择性识别和包装，以及Cvt途径中的囊泡形成。Cvt途径是一个Atg过程，允许液泡水解酶Ape1和Ams1选择性运输到液泡。前Ape1在细胞溶质中合成，随后组装成十二聚体，并进一步形成一个较大的低聚物，称为Ape1复合物。受体蛋白Atg19通过prApe1前肽与Ape1复合物结合形成Cvt复合物；Ams1低聚物通过与Atg19的结合被招募到复合物中。Atg11通过与Atg19相互作用与Cvt复合体组装，并将复合体引导至PAS。Atg11在PAS处形成同二聚体或同低聚体，尽管尚不清楚它是在到达该位点之后还是之前发生的。一旦Cvt复合物到达PAS，Atg组分，如与磷脂酰乙醇胺（Atg8-PE）偶联的Atg8，被招募用于囊泡形成。Atg19进一步与Atg8-PE相互作用，这可能确保货物正确包装到形成的Cvt囊泡中。在囊泡完成之前，Atg11在PAS处与Cvt复合物分离，尽管确切的时间尚不清楚

受体蛋白Atg19通过prApe1前肽与Ape1复合物结合，在胞浆中形成Cvt复合物。⁴⁹在没有Atg19的情况下，prApe1可以形成Ape1复合体，但它不会定位于PAS。^47,48另一种液泡驻留水解酶α-甘露糖苷酶（Ams1）也在与prApe1不同的位置结合Atg19，并与Cvt复合物一起被隔离在囊泡内。⁴⁸将Cvt复合物定位到PAS需要至少一个额外的蛋白质Atg11；³⁸如果没有Atg11，Atg19和prApe1可以形成Cvt复合物，但复合物不以PAS为靶点。⁴⁸Atg19的C末端通过C末端线圈区域与Atg11结合；向PAS移动需要额外的Atg11线圈域。⁵⁰然而，尚不清楚是否需要另一种蛋白质来调节转运和靶向步骤。一旦货物复合物到达PAS，Atg19可能通过与Atg8-PE的相互作用通过形成囊泡介导隔离。⁴⁸Atg19-Atg8-PE相互作用可能有助于确保非特异性细胞溶质成分被排除在形成的Cvt囊泡之外，而Cvt复合物被选择性地包装在囊泡中。在Cvt囊泡完成后，Atg19仍整合在囊泡中，并与货物一起运输到液泡中，在那里降解。⁴⁹相反，人们认为Atg11并没有被输送到液泡中，而是从货物分子中释放出来，并在囊泡完成之前循环使用。³⁸虽然Atg19释放Atg11的时间尚不清楚，但Atg1激酶可能参与了这一步骤；据观察，在没有Atg1-Atg13激酶复合物或存在激酶缺陷型Atg1突变体的情况下，Atg11同源齐聚反应更有效。⁵⁰

在饥饿条件下，大量非选择性自噬不需要Atg11或Atg19。然而，在缺乏Atg11和Atg19的情况下，prApe1转运到液泡的效率显著降低，这表明，在自噬/饥饿条件下，这些蛋白质是Ape1复合物选择性自噬转运所必需的，其功能与Cvt途径类似。⁵¹观察到，在没有Cvt复合物或Atg11的情况下，或者在存在某些不能将Cvt复合物递送到PAS的Atg11突变体的情况下，一些通常定位到PAS的Atg组分没有显示出这种定位。^51,50这种不能正确组装PAS的情况仅在植物/Cvt途径条件下出现，而在饥饿/自噬期间没有。这一观察结果可能表明，根据营养条件，PAS的形成有不同的方式，并进一步表明了一种机制，允许Cvt途径对货物具有高度选择性。

选择性自噬的货物尚未在哺乳动物系统中被记录。例如，已知酵母外不存在生物合成Cvt途径。类似地，过氧化物酶体的特异性降解尚未显示在高等真核生物中发生。沿着这些路线，已知在货物识别中起作用的Atg蛋白在任何具有特征的高等真核生物系统中都没有同源物。单细胞生物可能对调节自噬过程有更大的需求；然而，很可能至少降解型的特定自噬确实发生在所有生物体中。

共轭系统

两个独特的泛素样结合系统，Atg8-磷脂酰乙醇胺（Atg8-PE）和Atg12-Atg5，参与了自噬小泡的生物生成(图4).⁵²这些结合系统在各种真核生物中广泛保守，在自噬中起着重要作用。^三,8

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图4

两台共轭机械。一种结合始于Atg7，它与E1泛素激活酶同源，通过形成涉及Atg12的C末端甘氨酸残基的硫代酯键与Atg12相连。活化的Atg12被转移到类E2蛋白Atg10，该蛋白通过Atg12的活化甘氨酸和Atg5的内部赖氨酸之间形成异肽键来催化与Atg5结合。最后，用Atg12-Atg5共轭物组装Atg16。Atg16还可以形成同四聚体，从而形成Atg12-Atg5-Atg16复合物的多聚体。另一个系统从半胱氨酸蛋白酶Atg4开始，它通过蛋白质水解去除Atg8的C末端精氨酸，从而获得甘氨酸残基。相同的E1-like Atg7激活这个暴露的甘氨酸残基，然后将激活的Atg8转移到Atg3。最后，Atg3介导Atg8与磷脂酰乙醇胺的偶联形成Atg8-PE。虽然机制尚不清楚，但Atg12-Atg5-Atg16偶联物也是Atg8-PE稳定性所必需的。Atg12-Atg5-Atg16和Atg8-PE均定位于PAS，似乎参与囊泡形成。Atg8-PE是完整的Cvt囊泡和自噬体的结构成分，但在内膜上富集。在囊泡形成期间或形成后不久，囊泡外膜上的Atg8-PE被Atg4蛋白酶裂解

在Atg12-Atg5共轭体系中，Atg12的C末端甘氨酸残基和Atg5的中心赖氨酸残基之间形成不可逆的异肽键。⁵³形成共轭物需要另外两种蛋白质；一个是Atg7，它是E1泛素激活酶Uba1的同源物，⁵⁴另一种是Atg10，其功能类似于E2泛素结合酶。⁵⁵与泛素系统一样，E1-like Atg7通过其活性位点半胱氨酸结合Atg12的C末端甘氨酸，通过硫酯键形成中间络合物。ATP水解导致Atg12活化。随后，活化的Atg12转移到类E2的Atg10，并通过另一个硫酯键瞬时连接。最后，Atg12与Atg5的内部赖氨酸残基共价键合形成最终共轭物。Atg12-Atg5结合物与另一种蛋白质Atg16非共价结合。⁵⁶Atg16可以形成同源异构体，以介导Atg12、Atg5和Atg16形成更高的多聚体结构，酵母中的分子量为350kDa，小鼠中的分子质量为800kDa。据预测，这些多聚体分别由Atg12-Atg5-Atg16复合物的四聚体和八聚体组成。^57,58此外，调控Atg16齐聚的实验表明，多聚体Atg12-Atg5-Atg16复合物的形成对自噬具有重要的功能。⁵⁷

另一个共轭体系涉及Atg8作为脂质磷脂酰乙醇胺的改性剂。^59,60Atg8最初的特征是自噬和Cvt途径所需的微管相关蛋白，⁶¹尽管与微管的功能关联尚未得到证实。在Atg8结合的第一步中，半胱氨酸蛋白酶Atg4通过蛋白质水解作用去除Atg8的C末端精氨酸残基，从而暴露出一种甘氨酸，这种甘氨酸现在可被E1样的Atg7获得，与Atg12-Atg5结合系统中使用的酶相同。Atg7激活Atg8，然后将其转移到另一种类E2酶Atg3，并最终通过酰胺键与磷脂酰乙醇胺结合。与PE结合的Atg8表现为膜蛋白。与Atg12-Atg5结合不同，用Atg8修饰PE是一个可逆的过程，其中Atg4可以在甘氨酸残基之后再次裂解Atg8，将其从脂质中去除。⁵⁹最近，使用从大肠杆菌中纯化的蛋白质重建了Atg8 PE缀合过程。⁶²如果对Atg8进行基因改造以去除C末端精氨酸，则只需要Atg7和Atg3在体外生成Atg8-PE，从而绕过最初的Atg4切割事件；然而，由于Atg12-Atg5结合物的耗竭导致Atg8-PE的不稳定性，因此在体内似乎以更复杂的方式调节Atg8-PE结合物。⁵

Atg12-Atg5-Atg16复合物和Atg8-PE共轭物均定位于PAS，并在囊泡形成中发挥一定作用。^5,63在完整的自噬体上未观察到Atg12-Atg5-Atg16复合物。然而，在哺乳动物细胞中，这种复合物明显与形成自噬体有关，自噬小体被称为吞噬体或隔离膜。^64,58这些结果使我们认为，在膜形成阶段，Atg12-Atg5-Atg16复合物驱动膜包膜的膨胀和/或弯曲，并最终在完成之前或之后与囊泡分离。另一方面，在形成的中间囊泡和完成的自噬体上都检测到Atg8 PE。⁶⁵它被运输到溶酶体/液泡，并随货物一起降解。因此，Atg8-PE是自噬体结构成分的最佳候选成分。在饥饿条件下，可显著诱导Atg8/Atg8-PE水平。这可能是一个重要因素，使自噬体相对于Cvt囊泡的大小增加。沿着这些线，在饥饿条件下atg8Δ细胞中观察到异常或小的自噬体样结构。根据这些观察，Atg8可能是控制自噬体大小的另一个因素。

哺乳动物细胞中至少有三种Atg8同源物，即GATE-16、GABARAP和MAP1LC3。^66,67这三种蛋白质似乎都以与酵母中相同的方式被脂质修饰，并已被证明定位于自噬体。其中，LC3的特性最好，并被用作哺乳动物自噬体的标记，类似于酵母Atg8。虽然酵母Atg8在自噬过程中明显被诱导，但哺乳动物同源物不一定是这样。LC3水平通常在自噬诱导后增加，但这种增加是细胞系依赖性的，其幅度不如Atg8大。

磷脂酰肌醇3-磷酸和磷脂酰肌酸3-激酶复合物

磷脂酰肌醇3-磷酸（PtdIns（3）P）在多种细胞功能中起着重要作用。酵母中只有一种PtdIns 3-激酶，即Vps34。Vps34参与形成两种不同的PtdIns 3-激酶复合物(图5).⁶⁸复合物I由Vps34、Vps15、Vps30/Atg6和Atg14组成，而复合物II包含相同的蛋白质，只是Atg14被Vps38取代。在缺乏Atg14的情况下，复合物I被破坏，导致羧肽酶Y（Prc1）的正常分选，该酶通常通过CPY途径从晚期高尔基体转运到液泡，但自噬和Cvt途径丢失。另一方面，Vps38缺失导致Prc1分选缺陷，但允许自噬和Cvt途径的正常进展。

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图5

酵母中的两个PtdIns 3-激酶复合物。（a） 两个复合物共享Vps15、Vps30/Atg6和Vps34。复合物I具有Atg14，并在自噬和Cvt途径中发挥作用。复合物II含有Vps38，参与CPY和Mvb途径。（b） 据推测，复合物I可能产生PtdIns（3）P用于自噬和PAS处的Cvt通路。Atg20-Atg24复合物、Atg18、Atg21和Atg27通过与PtdIns（3）P的结合被招募到PAS

已知PtdIns（3）P被具有PtdIns（3）P-结合位点的蛋白质结合，如PX和FYVE结构域。两种蛋白质，Atg20和Atg24，具有PX结构域并与PtdIns（3）P结合。^69,70Atg20和Atg24也属于排序连接蛋白家族，在高尔基体到内体的蛋白质运输中起作用，但这两种蛋白质都只参与Cvt途径。这些蛋白质相互作用，并显示出两种类型的亚细胞定位，即内体和PAS。它们的内体定位需要PtdIns3-激酶复合物II，而PAS定位需要复合物I。Atg20-Atg24复合物的内体定位似乎对Cvt途径是可有可无的。相反，该复合物在PAS的Cvt途径中起作用。此外，Atg24和可能的Atg20与Atg17相互作用，Atg20也与Atg11相互作用；^69,50因此，Atg20-Atg24复合物可能作为Atg1激酶复合物的一部分发挥作用(图2).

Atg18、Atg21和Atg27也以依赖PtdIns 3-激酶复合物I的方式被招募到PAS中；^71-73所有三种蛋白都与PtdIns（3）P结合，尽管它们都没有已知的结合域。Cvt和自噬途径都需要Atg18，而Cvt途径主要需要Atg21和Atg27。PtdIns（3）P在自噬中的作用仍有待研究，但它可能介导一些Atg组分向PAS的募集，使它们能够参与囊泡形成机制；然而，没有直接证据表明PtdIns（3）P存在于PAS的假定膜中。

与酵母相反，哺乳动物细胞通过两种PtdIns 3-激酶复合物（I类和III类）调节自噬。³²III类酶类似于酵母Vps34，生成PtdIns（3）P，在自噬中起刺激作用。I类酶转化PtdIns（4,5）P₂至PtdIns（3,4,5）P_三这种酶复合物在质膜上起作用，是激活mTor和其他激酶的信号级联的一部分，因此具有抑制作用。PtdIns（3）P在哺乳动物细胞中的作用尚不清楚，尽管它可能与在酵母中的作用类似；然而，似乎能结合这种磷脂酰肌醇的Atg20、Atg21、Atg24和Atg27蛋白在高等真核生物中没有同源物。Atg18是唯一具有哺乳动物同源物的PtdIns（3）P-结合蛋白，但在高等真核生物中尚未发现其特征。

检索

大多数Atg组分是可溶性或外周膜相关蛋白，在PAS处显示单点定位。然而，预计Atg9是一种多跨膜蛋白。⁷⁴与其他Atg蛋白相比，Atg9不仅定位于PAS，还分布于其他一些点状结构。⁵类似地，Atg23是一种外周膜蛋白，也显示出包括PAS在内的多点定位。⁷⁵最近我们的实验室表明，在缺乏Atg1-Atg13激酶复合物的情况下，Atg9和Atg23都只在PAS中积累。⁷⁶这一结果表明，Atg9和Ag23在PAS和其他结构/细胞器之间循环，并且Atg1-Atg13复合体参与从PAS中检索这些蛋白质。此外，只有Atg23检索需要高水平的Atg1激酶活性，而Atg2、Atg18和PtdIns 3-激酶复合物I组分是检索Atg9所必需的(图6).

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图6

回收Atg9和Atg23。Atg9和Atg23定位于PAS和多个外周点状结构（显示为Atg9的线粒体）。从PAS中检索完整膜蛋白Atg9涉及Atg1-Atg13复合物、Atg2和Atg18。PtdIns 3-激酶复合物I被提议在PAS处生成PtdIns（3）P，并且Atg18可能通过与该磷脂酰肌醇结合而定位于PAS。Atg1-Atg13复合物诱导Atg2、Atg9和Atg18的相互作用。最后，这个三元复合体允许从PAS检索Atg9。Atg23是一种外周膜蛋白。目前尚不清楚Atg23是否从胞质或膜相关池被募集到PAS。与Atg9相比，需要高水平的Atg1激酶活性来调节从PAS中提取Atg23

Atg9与Atg2交互，也可以绑定Atg18。^76,77外周膜蛋白Atg2向PAS的募集需要Atg1、Atg13、PtdIns 3-激酶复合物I和Atg18，^71,78而Atg9与Atg18的交互需要Atg1和Atg2。⁷⁶一种模型是，一旦Atg9从外周结构募集到PAS，Atg1-Atg13激酶复合物介导Atg9与Atg2和Atg18的相互作用，并且这种三元复合物的形成允许Atg9从PAS回收回外周位点。

Atg23定位的外周（非PAS）结构或细胞器的身份尚不清楚。最近的一项分析表明，Atg9的外围结构与线粒体相对应，⁷⁹尽管靶向线粒体的Atg9的信号和机制尚不清楚。目前尚不清楚Atg9和Atg23蛋白及其循环如何在自噬途径中发挥作用。然而，这两种蛋白质在囊泡形成中都有一定作用，因为在缺乏Atg9的情况下，不会形成隔离囊泡。⁷⁴相反，如果没有Atg23，自噬体的大小基本正常，但数量大大减少。⁷⁵最近，发现了Atg9的两个哺乳动物同源物。⁸⁰有趣的是，除了完整的膜区域外，其中一个区域还具有线粒体定位的假定信号序列；然而，在培养细胞中，这两种蛋白主要定位于核周区域，而不是定位于线粒体。虽然可能存在类似的机制，但在高等真核生物中还没有发现Atg9的检索过程。沿着这些路线，有趣的是，如前所述，存在Atg18的同源物，这表明该蛋白可能在检索过程中具有保守的作用。

囊泡生物发生

水泡是如何在自噬过程中形成的？这是一个关键问题，但尚未得到令人满意的回答。用于自噬和Cvt途径的双层膜囊泡是从头生成的，因为它们似乎不是从预先存在的细胞器中萌芽而来。图7显示了囊泡形成的假设模型。PAS是囊泡形成的假定部位；大多数Atg组件都会定位到此站点，至少是暂时的。^5,63Atg蛋白构成形成囊泡的机制，几乎所有的Atg蛋白都可能以某种方式参与囊泡的形成步骤。与出芽形成的囊泡不同，自噬过程中必须形成初始膜；这是囊泡形成的成核步骤。这种膜的来源尚不清楚。虽然不是普遍的，但人们普遍认为内质网是形成囊泡的膜的来源。据报道，ER功能和早期分泌途径的机制是酵母自噬和Cvt途径所必需的；^21-23然而，为了理解这种关系，还需要进一步的研究。高等真核生物中缺乏合适的条件突变体，因此无法对隔离膜的起源进行类似的分析，而相应的研究一直是形态学和细胞学性质的。

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图7

囊泡形成步骤的示意图模型。首先，膜成核依赖于PtdIns 3-激酶复合物I和Atg9。Atg蛋白，包括Atg12-Atg5-Atg16复合物和Atg8-PE偶联物，囊泡形成机制的组成部分，被招募到PAS中。Atg12-Atg5-Atg16复合物可能通过充当外壳来调节囊泡的膨胀。Atg8-PE被募集到依赖于Atg12-Atg5-Atg16复合物的形成囊泡中，并且还作为结构成分在囊泡的延伸中起作用。PAS和线粒体之间的Atg9循环；Atg9循环可能为扩张膜提供脂质。在囊泡完成时或之前，外壳蛋白和Atg蛋白（朝向内腔的Atg8-PE（和Atg19）除外）与囊泡分离。最后，完成的囊泡可以与液泡融合

在Atg组分中，PtdIns3-激酶复合物I被认为在膜成核中起一定作用。复合物I可能在PAS处生成PtdIns（3）P，并促进某些Atg成分的补充，例如囊泡形成机制。Atg12-Atg5-Atg16复合体和Atg8-PE共轭物包含在该机器中，它们在PAS中的定位也需要Atg9。⁵PtdIns 3-激酶复合物I和Atg9可能在Atg12-Atg5-Atg16和Atg8-PE之前发挥作用；虽然Atg9和络合物I不影响共轭物的形成，但它们是在PAS中正确定位所必需的。在没有它们的情况下，结合物在胞浆中扩散，没有任何点状定位。建议Atg12-Atg5-Atg16复合物和Atg8-PE共轭物首先位于初始成核膜上，然后在囊泡膨胀中起作用。在没有Atg12-Atg5-Atg16复合物的情况下，Atg8-PE不会定位在PAS，导致囊泡形成受阻。相反，无论是Atg5在PAS的定位还是Atg12-Atg5共轭形成都不需要Atg8-PE。^5,57因此，形成了Atg12-Atg5-Atg16复合物，并可能在PAS的Atg8-PE之前发挥作用。随后，Atg8-PE可以定位于PAS，或稳定在该位置，并并入形成囊泡的膜中，可能在确定囊泡大小方面发挥作用。在囊泡扩张过程中，Atg12-Atg5-Atg16复合物可能暂时覆盖形成膜囊泡并控制囊泡曲率。

囊泡的扩张可能需要脂质的输送，可能以脂质双层的形式存在于运输囊泡中；然而，这些脂质的来源尚不完全清楚。Atg9定位于PAS和线粒体，呈多个点，并可能在这些结构之间循环。^76,79目前尚不清楚Atg9的循环功能；然而，有一种假设是Atg9标志着自噬体的膜来源。Atg9可能通过从供体（线粒体）循环到受体膜（自噬体）来调节脂质/膜的传递。这种由Atg9循环介导的脂流可以通过Atg1-Atg13复合物和PtdIns3-激酶复合物I以包括Atg2和Atg18的方式进行调节(图6). Atg9蛋白是向PAS招募Atg12-Atg5-Atg16复合物和Atg8-PE所必需的。⁵相比之下，共轭物的PAS定位不需要Atg1和Atg2，⁵这表明从PAS检索Atg9（依赖于Atg1和Atg2）在这方面也不重要。Atg9循环可能提供膜，与Atg12-Atg5-Atg16复合物和Atg8-PE协同驱动囊泡扩张。

隔离囊泡可能在囊泡完成之前或之后立即被揭开。事实上，GFP标记的Atg5在哺乳动物细胞中的实时成像显示了Atg5蛋白与形成自噬体的短暂关联。⁶⁴GFP-Atg5最初表现为一个小点，变长为球形结构，最后在自噬体完成时解离。囊泡完成后，构成囊泡形成机制的其他Atg蛋白也从囊泡中分离出来。揭开包衣后，囊泡上的假定融合机制将暴露出来，以驱动自噬体与液泡的融合。所以，涂层可以部分防止形成中间囊泡和液泡的过早融合。

液泡融合和囊泡破裂

一旦完成，双膜自噬体被运输到液泡，囊泡的外膜与液泡膜融合，这一过程依赖于Ccz1和Mon1。⁸¹Ccz1和Mon1形成复合物，在同型液泡融合中也起作用。⁸²Ccz1-Mon1复合物是由SNARE蛋白Vam3、Vti1和Vam7、NSF Sec18、α-SNAP Sec17、Rab GTPase Ypt7和C类Vps/HOPS复合物组成的常见融合机制的一部分。^4,31融合后，自噬体内部单膜囊泡在液泡腔内释放，现在称为自噬体(图1).

随后，自噬体的膜在空泡腔内被破坏。自噬体的降解依赖于两种驻留的液泡蛋白酶Pep4和Prb1以及液泡腔的酸化。^83,84除这些因素外，跨膜蛋白Atg15也需要用于裂解。^85,86Atg15在酯酶和脂肪酶中具有保守的功能基序。这种蛋白质通过多泡体（Mvb）途径运输到液泡中。⁸⁷自噬体的分解导致货物释放到液泡腔中，在那里细胞质成分被降解。最后，通过回收产生的大分子，在缺乏营养的条件下合成生存所必需的蛋白质，可以完成自噬。

在哺乳动物细胞中，自噬体与溶酶体（酵母液泡的类似物）融合，生成自噬溶酶体。有人认为，Rab GTPase Rab7以自噬体膜为靶点，参与后期步骤，与溶酶体融合，使其成熟。^88,89与哺乳动物Rab GTPase相反，尚未证明酵母Rab GTPase Ypt7定位于自噬体膜。融合后，溶酶体腔中的溶解酶可能会降解自噬体，如酵母液泡。

结论

自噬涉及细胞质的膜重排，并将其输送到溶酶体或液泡。这是一个在所有真核生物中高度保守的过程，在涉及正常生长、发育和分化的细胞过程中具有重要作用。对酵母自噬、pexophagy和Cvt途径的研究已经确定了这两条途径所需的27个ATG基因，并揭示了驱动它们的独特机制。酵母菌中鉴定出的大多数蛋白质成分也存在于高等真核生物中，这表明在自噬方面，从单细胞生物到多细胞生物都有高度的保守性。然而，许多问题仍有待回答，特别是与囊泡形成步骤有关的问题，包括自噬体是如何产生的，以及脂质膜的起源。酵母模型生物仍然是检验这些和其他问题的有力工具。对自噬、pexophagy和Cvt途径的进一步研究将继续提供答案，并进一步加深我们对指导这些过程的分子机制的理解。

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