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.2023年2月3日；8(1):53.
doi:10.1038/s41392-023-01335-5。

E3连接酶RNF5通过靶向其包膜蛋白进行降解来限制SARS-CoV-2的复制

李兆龙 1, 郝鹏飞 2, 赵志磊 1, 高文英 1, 陈欢 1, 李乐天 2, 向晨 1, 王宏（Hong Wang） 1, 宁义金 2, 赵庆洛 三, 常丽 4, 张文燕（Wenyan Zhang） 5
附属公司

E3连接酶RNF5通过靶向其包膜蛋白进行降解来限制SARS-CoV-2的复制

李兆龙等。 信号传输目标热. .

勘误表in

摘要

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的2019年冠状病毒病（COVID-19）大流行引发了严重的全球卫生危机；其结构蛋白包膜（E）对病毒进入、出芽、产生和诱导病理学至关重要，这使其成为新冠肺炎治疗的潜在靶点。这里，我们发现E3连接酶RNF5与E在第63赖氨酸上的泛素化相互作用并对其进行催化，导致其被泛素蛋白酶体系统（UPS）降解。重要的是，RNF5诱导的E降解抑制SARS-CoV-2复制，而RNF5药理激活剂Analog-1缓解小鼠感染模型中的疾病发展。我们还发现RNF5在不同年龄组和不同疾病严重程度的患者中有不同的表达，这可能被用作新冠肺炎的预后标志物。此外，RNF5识别来自不同SARS-CoV-2毒株和SARS-CoV的E蛋白，表明靶向RNF5是一种广谱抗病毒策略。我们的发现为UPS在对抗SARS-CoV-2复制中的作用提供了新的见解，这为治疗干预抗击新冠肺炎大流行开辟了新的途径。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
鉴定E3泛素连接酶RNF5作为参与SARS-CoV-2 E蛋白降解的因子。一蛋白酶体抑制剂MG132增加了E蛋白的稳定性。b条MG132提高了经环己酰亚胺（CHX）处理的细胞中E蛋白的半衰期。转染HEK293T细胞表达E-HA 24 治疗h 10 µM MG132用于10 h.对于CHX处理，在50添加抑制剂后的指定时间点收获细胞 用免疫印迹法（IB）检测经SDS-PAGE溶解的清除的裂解产物（μg/mL）。cMG132治疗后E蛋白的免疫沉淀（IP）。用MG132处理转染表达E-HA的HEK293T细胞10次 收获前h。裂解液进行HA IP，洗脱液进行质谱分析。d日洗脱液中RNF5结合蛋白的火山图。黑色圆圈代表没有显著变化的蛋白质。红色圆圈表示可能与E蛋白相互作用的蛋白质，蓝色圆圈表示非结合蛋白质。e（电子）RNF5的敲除增加了E稳定性。（f）RT-qPCR检测沉默RNF5的mRNA水平。克RNF5的E3泛素连接酶活性是E降解所必需的。转染RNF5-Flag野生型（WT）或其C42S突变体的RNF5-沉默HEK293T细胞36 h被采集并用IB分析。小时RNF5的敲除延长了E蛋白的半衰期。用E-HA质粒转染接受RNF5沉默或阴性对照pLKO.1的HEK293T细胞，然后用50 在指定的时间点采集之前，CHX的浓度为μg/ml
图2
图2
采集RNF5与转染表达E-HA和RNF5-Flag的构建物的E.HEK293T细胞相互作用并进行裂解。裂解液经HA抗体IP处理一或标志抗体IPb条用IB和适当的抗体分析沉淀物。c通过FRET分析确定E和RNF5之间的相互作用。棒材，10 微米。d日通过GST-E下拉RNF5。培养重组His6-RNF5和GST-E，并用GST-Sepharose捕获潜在的蛋白复合物。e（电子）RNF5的敲除降低了E的泛素化。转染表达E-HA和泛素标记的RNF5沉默的HEK293T细胞的裂解产物经HA IP处理，然后用IB进行分析。（f）从大肠杆菌纯化的重组RNF5催化了大肠杆菌的泛素化。与所示成分的退出反应允许进行4次 考马斯蓝染色检测泛素化前h
图3
图3
RNF5催化大肠杆菌K63位点上K-48型泛素链的形成。一E通过K48连锁而不是K6、K11、K27、K29、K33或K63泛素化。b条RNF5的敲除降低了E。RNF5沉默的HEK293T细胞裂解物的K48连接泛素化，转染表达E-HA和泛素-K48-Flag的细胞后进行HA IP，然后进行IB分析。cK63上的RNF5泛素E。转染HEK293T细胞表达泛素K48-Flag和E-HA，EK53R公司，Ek63转，或EKK53,63RR型将细胞裂解物置于Flag IP下，并用IB检测沉淀物中感兴趣的蛋白质。d日K63是一个普遍存在的位点。允许对含有指示成分的标准脱落反应进行4次 h和蛋白通过SDS-PAGE进行解析，并通过考马斯蓝染色进行检测。e（电子）EK63R公司该突变体对RNF5介导的降解具有抵抗力。用E-HA或其K53R或K63R突变体共表达RNF5-Flag的HEK293T细胞进行裂解，并用IB检测相关蛋白水平
图4
图4
RNF5通过靶向E蛋白降解抑制SARS-CoV-2复制。一——d日通过测定Caco2细胞RNF5基因敲除增加病毒复制N个和E类细胞中的基因一和培养上清液中b条和培养上清液中的病毒滴度c以及N和M蛋白的水平d日Caco2细胞感染SARS-CoV-2 48 h用于通过RT-qPCR或IB分析确定病毒复制。e（电子）——小时RNF5而非RNF5的过度表达C42S系统Vero-E6细胞中的突变降低了病毒复制。过表达RNF5 WT或RNF5的Vero-E6细胞C4秒突变体感染SARS-CoV-2 48 h、 RT-qPCR检测细胞内病毒复制e（电子）和培养上清液中（f），病毒滴度克或IB分析小时使用双侧非配对t检验（NS，无显著性*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001)
图5
图5
在小鼠感染模型中，RNF5的激活可抑制SARS-CoV-2的毒力。一用0，1.5剂量的Analog-1治疗BLAB/C小鼠 mg/kg或3.0 毫克/千克（20 g鼠标，30 μg或60 μg）每隔2天感染7次，然后以10倍的剂量感染SARS-CoV-2病毒5.5TCID公司50/ml经鼻接种。b条通过测量小鼠肺的mRNA水平，检测小鼠肺的病毒RNA载量为7dpiE类和N个基因。c实验期间监测的小鼠重量。d日不同处理小鼠肺部H&E染色的代表性图像。放大倍数，×200。进行HE染色肺损伤评分静态分析。0，无损伤；1、损伤面积<25%；2、损伤面积25-50%；3、损伤面积50-75%；4，损伤面积>75%。棒材，100 微米。e（电子）病毒N、M和E蛋白的染色。棒材，100μm。（f）采用RT-qPCR检测各组脾脏细胞因子和趋化因子的表达。N个 > 每组5个。克用RT-qPCR法检测各组脾脏RNF5的表达。使用双侧非配对t检验分析统计显著性（NS，无显著性*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001)
图6
图6
E蛋白与RNF5相互作用的重要区域。一E缺失突变体的示意图。b条E突变体对RNF5介导的降解的敏感性。通过IB分析转染表达RNF5和E-HA或其突变体的HEK293T细胞的蛋白质水平。cE∆43–52突变株已明显丧失结合RNF5的能力。通过IP测定E缺失突变体与RNF5的结合。d日E的示意图显示了SARS-CoV-2变种中发现的变异位置。e（电子）来自不同SARS-CoV-2变异体的所有测试E等位基因对RNF5敏感
图7
图7
RNF5表达水平与SARS-CoV-2引起的疾病严重程度呈负相关。信使核糖核酸水平一和蛋白质水平b条通过RT-qPCR和IB分析，测定了青年和老年人PBMC细胞和肺组织样本中RNF5的含量。所示结果是三个独立重复序列中的一个代表。c采用RT-qPCR方法检测轻、重度冠状病毒肺炎患者PBMC细胞RNF5 mRNA水平。使用双侧非配对分析统计显著性t吨测试(*第页 < 0.05, ***第页 < 0.001)
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