TLR2感测SARS-CoV-2包膜蛋白以产生炎性细胞因子

TLR2对β-冠状病毒的炎症反应是必需的

据报道，TLR2、3、4、7、8、9和10可在特定条件下识别病毒感染^22，23.TLR3是一种依赖TRIF的固有传感器²³TLR10在小鼠中无功能²⁴此外，TLR8在小鼠中的作用与在人类中的作用相比存在争议²⁵为了确定哪些TLR负责感应β-冠状病毒感染并通过Myd88发出信号，我们用MHV感染TLR2、4、7或9缺陷的BMDM，并监测炎症细胞因子基因的转录。我们发现TLR4、7或9的缺失对MHV诱导的伊尔1b，伊尔6，或天花在BMDM中，TLR2缺陷会破坏这些基因的转录(图2A–2摄氏度). 这表明TLR2是触发β-冠状病毒诱导的炎症细胞因子表达的天然传感器。为了进一步证实TLR2在β-冠状病毒感染过程中的作用，我们检测了Tlr2号机组^–/–MHV感染后的BMDM。MHV诱导的ERK和NF-κB的激活在Tlr2号机组^–/–BMDM(图2D). 相反，TLR7缺乏对MHV诱导的ERK和NF-κB活化没有影响(图2D). 此外，IL-6和TNF-α的分泌在Tlr2号机组^–/–BMDM感染了MHV，而TLR7的缺失并不影响这两种细胞因子的释放(扩展数据图3A和​和3B）。3B公司). 炎症趋化因子的释放，包括CXCL10（IP-10）、CCL3（MIP-1α）、CXCL1（KC）、RANTES、MCP-1和G-CSF，在Tlr2号机组^–/–MHV感染后3和6小时的BMDM，而TLR7的缺失对这些趋化因子的表达影响极小(扩展数据图3C–3小时). 这些发现表明，在MHV感染后，TLR2对这些炎性细胞因子和趋化因子的表达具有特异性。

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图2。

β-冠状病毒感染期间的炎症反应需要TLR2

（A–C）实时PCR分析伊尔1b（A） ，伊尔6（B） 、和天花（C） 在WT中，Tlr2号机组^–/–，Tlr4号机组^–/–，Tlr7号机组^–/–、和第9天^–/–MHV感染后骨髓源性巨噬细胞（BMDM）的MOI为0.1，持续指定时间，与宿主基因水平相关Gapdh公司（D）WT中磷酸化ERK（pERK）、总ERK（tERK），pIκB和tIκB的免疫印迹分析，Tlr2号机组^–/–、和Tlr7号机组^–/–在指定的时间内，以0.1的MOI感染MHV后的BMDM。内部控制采用GAPDH。感染SARS-CoV-2的人外周血单个核细胞（PBMCs）在MOI为0.5时释放（E–L）TNF-α（E）、IFN-γ（F）、IL-1α（G）、IL-6（H）、CXCL10（I）、MCP-1（J）、G-CSF（K）和CCL3（L）20小时，无论是否使用TLR2抑制剂（oxPAPC；TLR2 in）或TLR4抑制剂（CLI-095；TLR4 in）。与媒介控制感染组相比的显著差异表示为*P（P）<0.05和***P（P）< 0.001; ns：不显著（单因素方差分析）（E–L）。完全正确P（P）值显示在补充表1数据代表三个独立实验（A–D）或两个独立试验（E–L）。数据显示为平均值±SEM（n=3个生物复制品）（A–C和E–L）。

对新冠肺炎患者血清细胞因子的研究表明，许多细胞因子和趋化因子（如IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-1α、IL-1ra、G-CSF、MCP-1、CCL3和CXCL10）在SARS-CoV-2感染后升高，并与疾病严重程度呈正相关^4，16，26为了研究TLR2在SARS-CoV-2诱导的细胞因子和趋化因子表达中的作用，我们在TLR2抑制剂存在的情况下用SARS-CoV-2感染人类外周血单个核细胞（PBMC）。首先，我们通过确认两种不同抑制剂对TLR2配体Pam3CSK4（Pam3）刺激的BMDM中TLR2信号的有效性和特异性，确定了一种最佳TLR2抑制剂。我们发现oxPAPC在抑制Pam3诱导的炎症信号传导方面比C29更有效(扩展数据图4A). 此外，oxPAPC对TLR7配体R848诱导的ERK和NF-κB信号的激活没有影响(扩展数据图4B)表明oxPAPC特异性抑制TLR2依赖性炎症反应。在人PBMC中，oxPAPC治疗对TLR2信号的抑制显著降低了严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型诱导的TNF-α、IFN-γ、IL-1α、IL-6、CXCL10、MCP-1、G-CSF和CCL3的分泌(图2E–2升). 相比之下，TLR4特异性抑制剂对SARS-CoV-2感染时这些细胞因子和趋化因子的释放影响极小(图2E–2升).

总之，这些结果表明TLR2可以感知β-冠状病毒感染，并负责β-冠状病毒诱导的炎症细胞因子的产生。

TLR2能感应β-冠状病毒的包膜蛋白

TLR2是一种细胞表面天然免疫传感器，能够识别病毒、真菌、细菌和寄生虫的多种配体²⁷据报道，TLR2在感染后可感知几种病毒蛋白，包括爱泼斯坦-巴尔病毒的dUTPase、巨细胞病毒的糖蛋白B和乙型肝炎病毒的衣壳²⁷因此，我们假设TLR2也能识别β-冠状病毒的病毒蛋白。为了研究独立于功能性病毒的病毒蛋白能否激活TLR2，我们使用热灭活MHV（MHV-HI）²⁸MHV-HI激活WT-BMDM中ERK和NF-κB信号通路(图3A). 相反，这种激活在Tlr2号机组^–/–和Myd88（Myd88）^–/–BMDM(图3A). 这些数据表明，β-冠状病毒激活TLR2信号通路并不需要病毒复制。据报道，在感染前添加氯喹可以抑制冠状病毒进入²⁹我们还观察到，氯喹治疗抑制了活MHV感染期间的细胞融合，进一步表明氯喹抑制病毒进入(扩展数据图5A). 为了测试TLR2信号通路的激活是否需要β-冠状病毒病毒蛋白的内化，我们在添加MHV-HI之前用10μM氯喹处理BMDM 30分钟。我们观察到氯喹治疗并未抑制MHV-HI诱导的TLR2依赖性炎症信号通路的激活(图3B)这表明β-冠状病毒中TLR2感应到的配体是病毒表面蛋白。基于这些发现，我们假设即使SARS-CoV-2由于受体特异性不能感染小鼠细胞³⁰，它仍然能够激活BMDM中的炎症信号通路。事实上，SARS-CoV-2刺激的BMDM显示ERK和NF-κB信号通路激活(图3C). 这可能支持最近的研究结果，即SARS-CoV-2接种可诱导WT C57BL/6小鼠的肺部炎症³¹为了进一步证实SARS-CoV-2蛋白在不感染的情况下激活炎症信号的能力，我们使用热灭活的SARS-CoV-2刺激BMDM。我们发现热失活SARS-CoV-2刺激炎症信号通路，TLR2-和Myd88缺陷BMDM中的炎症信号通路显著减少(图3D). 总的来说，这些数据表明TLR2可以在进入前检测到β-冠状病毒的表面蛋白。

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图3。

TLR2能感应β-冠状病毒的包膜蛋白

（A） WT中磷酸化ERK（pERK）、总ERK（tERK），pIκB和tIκB的免疫印迹分析，Tlr2号机组^–/–、和Myd88（Myd88）^–/–骨髓源性巨噬细胞（BMDM）在指定时间内以0.1的MOI用热灭活MHV（MHV-HI）刺激。内部控制采用GAPDH。（B） WT中pERK、tERK、pIκB和tIκB的免疫印迹分析，Tlr2号机组^–/–、和Tlr7号机组^–/–用MHV-HI刺激指定时间后的BMDM。在刺激前30分钟添加最终浓度为10μM的氯喹（CQ）。Actin被用作内部控制。（C） 用SARS-CoV-2刺激指定时间后，免疫印迹分析WT BMDM中的pERK、tERK、pIκB和tIκB。Actin被用作内部控制。（D） WT中pERK、tERK、pIκB和tIκB的免疫印迹分析，Tlr2号机组^–/–、和Myd88（Myd88）^–/–用热灭活SARS-CoV-2（SARS2-HI）刺激指定时间后的BMDM。肌动蛋白被用作内部控制。（E） WT中pERK、tERK、pIκB和tIκB的免疫印迹分析，Tlr2号机组^–/–、和Myd88（Myd88）^–/–用1μg/ml严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型包膜（E）蛋白刺激指定时间后的BMDMs。Actin被用作内部控制。（F–I）实时PCR分析TNF公司（F） ，IFNG公司（G） ，IL6（IL6）（H） 、和IL1B级（一） 在用1μg/ml SARS-CoV-2或Pam3CSK4（Pam3）中的E或spike（S）蛋白刺激人类外周血单个核细胞（PBMC）4小时后，相对于宿主基因水平呈现GAPDH公司（J）SARS-CoV-2纯化E蛋白与过度表达的人TLR2、TLR3或小鼠TLR2孵育后293T细胞的免疫沉淀物和总裂解物。学生的t吨试验用于E组和Pam3治疗组之间的统计分析；ns：不显著。数据代表三个独立实验（A–J）。ns，不显著（双侧学生t吨测试）（F–I）。数据显示为平均值±SEM（n=2个生物重复加上2个技术重复）（F–I）。

β-冠状病毒表面有三种病毒蛋白，即尖峰蛋白（S）、包膜蛋白（E）和膜蛋白（M）³²先前有报道称，缺乏E蛋白的SARS-CoV-1菌株不能激活NF-κB通路，从而显著减少小鼠感染后炎性细胞因子的产生³³为了确定TLR2是否能检测到E蛋白以激活炎症信号通路，我们用SARS-CoV-2纯化的E蛋白刺激BMDM。我们发现，E蛋白激活了WT BMDM中的ERK和NF-κB信号通路，并且这种激活在两种BMDM中都显著减弱Tlr2号机组^–/–和Myd88（Myd88）^–/–BMDM(图3E). 相反，用SARS-CoV-2纯化的S蛋白刺激BMDM后，我们没有观察到任何激活(扩展数据图6A). 为了进一步证实E蛋白对炎症信号激活的影响，我们评估了炎症细胞因子对不同剂量E蛋白的反应。我们发现，在5 ng/ml的浓度下，E蛋白可以诱导强烈的炎症细胞因子表达，尽管在该浓度下，其效果不如传统TLR2配体Pam3强(扩展数据图6B和​和6C）。6摄氏度). 当添加更高浓度的E蛋白时，其诱导炎症细胞因子表达的能力与Pam3相当(扩展数据图6B和​和6C）。6摄氏度). 此外伊尔1b，Il6，和天花在用E蛋白而不是S蛋白刺激的WT BMDM中强烈上调，TLR2的缺失减弱了伊尔1b，伊尔6、和天花由E蛋白诱导(扩展数据图6D–第6页).

ERK和NF-κB信号也需要用于转录上调Nlrp3号机组³⁴是NLRP3炎症小体激活的先决步骤之一。为了进一步证实E蛋白对激活BMDM炎症信号通路的作用，我们评估了Nlrp3号机组E蛋白启动后上调和ATP诱导NLRP3炎症小体激活。我们观察到Nlrp3号机组启动E蛋白后，WT-BMDMs上调表达和caspase-1裂解，而启动S蛋白未能诱导WT-BMDM细胞凋亡Nlrp3号机组上调和炎症小体激活(扩展数据图6G和​和6H）。6小时). 这个Nlrp3号机组上调和炎症小体激活在两种情况下均减少Tlr2号机组^–/–和Myd88（Myd88）^–/–BMDM(扩展数据图6G和​和6H）。6小时). 在E蛋白加ATP治疗后，两组患者的热解激活和IL-18释放均减少Tlr2号机组^–/–和Myd88（Myd88）^–/–BMDM与WT BMDM中的BMDM相比(扩展数据图6H和​和6I）。第六章). 总之，这些数据表明SARS-CoV-2的E蛋白可以激活TLR2依赖的信号通路。

为了进一步研究E蛋白在人类细胞中驱动炎症信号传导的作用，我们用SARS-CoV-2的E或S蛋白刺激人类PBMC。我们发现E蛋白可以诱导TNF公司，IFNG公司，IL6（IL6）和IL1B级与Pam3在人PBMC中诱导的相似，而S蛋白不能诱导这些炎症细胞因子基因的表达(图3F–第三章). 这些数据表明，β-冠状病毒的E蛋白可以在人类细胞中充当PAMP。为了验证TLR2是否能与SARS-CoV-2的E蛋白直接相互作用，我们与TLR2和E蛋白进行了联合免疫沉淀。我们发现人和小鼠TLR2都能与SARS-CoV-2的E蛋白相互作用(图3J)，进一步支持SARS-CoV-2的E蛋白可在人和小鼠细胞中诱导炎症反应的结论。

综上所述，这些数据表明TLR2可以感应β-冠状病毒的E蛋白，从而启动炎症信号通路和细胞因子的产生。

SARS-CoV-2 E蛋白诱导TLR2驱动的肺部炎症

鉴于SARS-CoV-2感染会导致严重的肺部炎症，我们接下来确定E蛋白是否会在体内引发肺部炎症。据报道，气管内滴注Pam3后会引起肺部炎症³⁵与这种炎症反应相一致，我们检测到大量CD45⁺服用Pam3的WT小鼠肺部的细胞聚集(图4A). 服用SARS-CoV-2中的E蛋白也会在WT小鼠的肺部触发大量炎性细胞的募集，但在Tlr2号机组^–/–老鼠(图4A). 此外，CD45也没有增加⁺与PBS相比，S蛋白处理的小鼠肺部细胞(扩展数据图7A)这与我们的体外研究结果一致，即S蛋白不诱导炎症信号传导。由于明显的炎症细胞因子释放会导致组织损伤，我们评估了E蛋白的使用是否会导致肺损伤。我们发现服用Pam3会触发小鼠肺部的细胞死亡(图4A). 类似地，E蛋白给药也导致小鼠肺部的细胞死亡(图4A)表明SARS-CoV-2的E蛋白有可能在感染期间诱导组织损伤。相比之下，在用S蛋白处理的小鼠的肺中没有检测到细胞死亡(扩展数据图7A). 此外，我们评估了小鼠血清中炎性细胞因子和趋化因子的含量。我们发现，用SARS-CoV-2的E蛋白刺激后，WT小鼠的IL-6水平升高(图4B). 相比之下Tlr2号机组^–/–给予E蛋白或WT的小鼠，以及Tlr2号机组^–/–注射S蛋白的小鼠接近基础水平，表明这些小鼠没有激活IL-6的产生(图4B). 同样，受E蛋白刺激的WT小鼠的CXCL10和G-CSF水平升高，但在Tlr2号机组^–/–给小鼠注射E蛋白或给小鼠注射S蛋白(图4B). 为了进一步证实E蛋白在小鼠肺部的炎症作用，我们在气管内滴注后6 h收集了支气管肺泡灌洗液（BALF）。我们发现S蛋白并没有诱导WT和BALF中测试的任何细胞因子的分泌Tlr2号机组^–/–而E蛋白显著增加了WT小鼠BALF中IL-6、TNF-α、CXCL1、GM-CSF和CCL3的数量(图4C). 综上所述，这些数据表明SARS-CoV-2的E蛋白可以诱导小鼠肺部TLR2依赖性炎症。

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图4。

SARS-CoV-2包膜蛋白可诱导TLR2依赖性炎症和肺部损伤

（A） 将PBS（n=3个生物复制品）、SARS-CoV-2包膜（E）（n=4个生物复制物）或Pam3CSK4（Pam3）（n=4个生物重复物）气管内注入小鼠24小时后获得的肺样本进行CD45免疫染色和TUNEL染色。红色箭头表示TUNEL阳性细胞。比例尺，100μm（黑色）或25μm（红色）。（B） 气管内滴注PBS或SARS-CoV-2的E或S蛋白24小时后，小鼠血清中IL-6、CXCL10和G-CSF的水平。（C） 气管内滴注PBS或SARS-CoV-2的E或S蛋白6 h后，小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-6、TNF-α、CXCL1、GM-CSF和CCL3的水平。与用E蛋白治疗的WT组相比，显著差异表示为*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001和****P（P）<0.0001（单向方差分析）（B和C）。完全正确P（P）值显示在补充表1数据代表两个独立实验（A–C）。数据显示为平均值±SEM（n=3-5个生物重复）（B和C）。

骨髓源性巨噬细胞（BMDM）

原代BMDM在添加10%FBS（Biowest，S1620）、30%L929条件培养基、1%非必需氨基酸（Thermo Fisher Scientific，11140–050）和1%青霉素和链霉素（Thermo-Fisher科学，15070–063）的IMDM（赛默飞世尔科学，12440–053）中培养6天。然后将BMDM接种到12孔板中，密度为每孔100万个细胞，并在使用前培养过夜。

小鼠肝炎病毒（MHV）传播

如前所述，小鼠肝炎病毒（A59株）在17Cl-1细胞中扩增⁵¹简单地说，17Cl-1细胞接种了感染倍数为0.1的MHV-A59。感染后48小时，将装有培养基和细胞的整个烧瓶在-80°C下冷冻，然后在37°C下解冻。重复两次冷冻-解冻循环后，收集上清液并以2000×g离心10分钟以去除细胞碎片。然后以30000 rpm超速离心1小时纯化病毒，然后用新鲜培养基重新悬浮小球。用噬菌斑试验测定17Cl-1细胞的病毒滴度。

外周血单个核细胞的分离

全血来自匿名健康捐赠者，他们按照IRB批准的方案在圣犹德儿童研究医院提供了知情同意书。使用Percoll（GE Healthcare，17–5445-01）通过密度梯度从血液中采集PBMC。PBMC维持在RPMI 1640中，补充10%FBS。

SARS-CoV-2培养

SARS-CoV-2分离物USA-WA1/2020从BEI Resources（NIAID，NIH:SARS-Related Coronavirus 2，isolate USA-WA1/1020，NR-52281）获得，并在补充有5%热灭活FBS（Gibco）的最低基本培养基（MEM；Corning，17–305-CV）中以0.1的MOI在Vero-E6细胞（ATCC，Vero C1008）中繁殖，1%的L-谷氨酰胺（康宁，25–005-Cl）和5 mM青霉素/链霉素（吉布科，30–001-Cl）。如前所述，通过斑块试验测定α病毒的病毒滴度⁵²。所有SARS-CoV-2活病毒实验均在生物安全3级实验室进行。

细胞刺激/感染

对于化学配体诱导的炎症信号反应，1×10⁶接种在12孔板中的BMDM用终浓度为30μg/ml的oxPAPC（Invivogen，tlrl-oxp1）或终浓度为50μM的C29（MedChem-Express，HY-100461）预处理1小时。然后用1μg/ml的Pam3CSK4（Pam3）或1μg/ml的R848刺激细胞指定的时间。为了检查病毒蛋白启动后NLRP3炎症小体的激活，1×10⁶用最终浓度为1μg/ml的SARS-CoV-2的包膜（E）（Abclonal，RP01263）或棘突（S）（Abclonal，RP 01283LQ）蛋白刺激接种在12孔板中的BMDM 4 h，然后用5 mM ATP处理45 min（Roche，10127531001）。

对于MHV感染，1×10⁶接种在12孔板中的BMDM在DMEM普通培养基中以0.1的MOI感染（Sigma，D6171）。培养2小时后，向细胞补充10%的FBS。收集样品作为指示的时间点。对于热灭活MHV刺激，将MHV在65°C下灭活30分钟，然后在指定的时间内将体积等于0.1活MHV MOI的灭活MHV添加到BMDM中。

对于BMDM的SARS-CoV-2感染，1×10⁶将BMDM接种到12孔板中，并在指定时间内以0.5的MOI感染。用RIPA裂解缓冲液裂解细胞。对于PBMC感染，1×10⁶将来自3名健康供体的PBMC接种到24孔培养皿中，以0.5的MOI感染。感染20小时后，收集模拟处理和感染PBMC的上清液。为了抑制TLR2活性，将最终浓度为30μg/ml的oxPAPC与SARS-CoV-2一起使用。为了抑制TLR4活性，CLI-095与SARS-CoV-2一起使用，最终浓度为1μg/ml。热失活SARS-CoV-2通过BEI Resources，NIAID，NIH:SARS-Related Coronavirus 2，Isolate USA-WA1/2020，heat inactivated，NR-52286获得。

细胞融合分析

BMDM（10⁶细胞/孔）接种到12孔板中，用10μM氯喹（CQ）处理30分钟。然后以0.1的MOI感染细胞。在感染后8小时，将DNA染色，即核-ID红（Enzo，ENZ-52406）稀释5000倍后添加到细胞中。使用IncuCyte S3软件分析图像。

免疫共沉淀分析

将表达标记人TLR2、TLR3或小鼠TLR2的质粒转染293T（ATCC，CRL-3216）细胞48小时，然后在NP-40裂解缓冲液（0.1%NP-40，150 mM NaCl，50 mM HEPES）中裂解细胞，20分钟后将细胞裂解液以13000 rpm离心10分钟。收集上清液，并在4°C的摇摆台上与5μg SARS-CoV-2纯化E蛋白和1.5μg指示的一级抗体孵育。过夜培养后，添加蛋白质A/G PLUS琼脂糖（圣克鲁斯生物技术）珠。两小时后，用裂解缓冲液洗涤四次后，通过离心法收集珠子。最后，在100°C的2×SDS加载缓冲液中煮沸5分钟后收集样品。

小鼠SARS-CoV-2感染

8至10周龄K18-ACE-2转基因雄性小鼠腹腔注射200μl DPBS单独或含有oxPAPC的DPBS，剂量为2 mg/kg体重。给药后1 h，用5%异氟醚麻醉小鼠，然后将SARS-CoV-2滴鼻接种在含有约2×10的50μl DPBS中⁴PFU。在感染后3天，给小鼠注射另一剂量的DPBS或DPBS加oxPAPC。每天称量小鼠体重，并在14天内监测其存活情况。为了收集BALF，在感染后第2天处死小鼠。

气管内滴注与组织病理学

使用年龄和性别匹配的6-9周龄雄性和雌性小鼠，通过气管内滴注给每只小鼠25μg SARS-CoV-2包膜（abclonal，RP01263）或spike（abcloal，RP01283LQ）蛋白（LPS污染小于0.1 EU/μg蛋白质，通过LAL法检测）。PBS和Pam3CSK4分别作为阴性和阳性对照。给药后24小时，收集血清，用10%福尔马林固定肺部，然后按标准程序包埋在石蜡中。为了进行免疫组织化学，将福尔马林固定的石蜡包埋的肺切成4μM的切片。CD45（BD-Pharmingen™，553076，1:500）和TUNEL（Promega，PRG7130）染色根据制造商的说明进行，并由对实验组不知情的病理学家进行检查。在滴注后6小时进行BALF收集。

新型冠状病毒肺炎患者基因表达分析

Hadjadj等人分享了健康患者和中、重度和危重新型冠状病毒肺炎患者的纳米线计数器数据¹⁶.的表达式我的88，TRIF公司，TLR1级，TLR2级，TLR3型，TLR4级，TLR5型，TLR7级，TLR8级和TLR9级根据使用Morpheus的选定基因的平均表达生成。

免疫印迹分析

对于caspase-1分析，使用50μl caspase裂解缓冲液（1×蛋白酶抑制剂、1×磷酸酶抑制剂、10%NP-40和25 mM DTT）将BMDM与上清液一起裂解。然后添加125μl 4×SDS负载缓冲液以煮沸样品。为了分析所有其他蛋白质，将受刺激细胞的上清液丢弃，然后用PBS清洗细胞一次，然后添加RIPA裂解缓冲液以裂解细胞。

在10%-12%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离蛋白质。然后将蛋白质转移到PVDF膜上，并在室温下用5%脱脂牛奶封闭1小时。所有一级抗体在4°C下培养过夜，而带有HRP的二级抗体在室温下培养1小时。图像是通过GE Amersham Imager 600开发的。最终图像通过斐济MacOS X（2.0.0-rc-67/1.52c版）进行分析。

使用的抗体有：抗caspase-1（AdipoGen，AG-20B-0042，1:2000）、抗GSDMD（abcam，ab209845，1:1000）、抗病毒ERK（Cell Signaling Technology[CST]，#9101，1:1000，#9101:1000）、抗体pIκB（CST，#2859，1:1000和HRP-结合二级抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories，anti-rabbit[111–035-047]，1:5000；anti-mouse[315–035-07]，1:500）。

实时（RT）PCR分析

使用TRIzol（Thermo Fisher Scientific，15596026）进行RNA提取。根据制造商的说明，使用第一链cDNA合成试剂盒（Applied Biosystems，4368814）进行cDNA合成。在ABI 7500快速RT-PCR机上用2×SYBR Green（Applied Biosystems，4368706）进行实时PCR。使用的引物如下：小鼠-Gapdh公司：5′-CGT CCC GTA GAC AAA ATG GT-3′，5′-TTG ATG GCA ACA ATC TCC AC-3′；伊尔1b：5′-GAT CCA CAC TCT CCA GCT GCA-3′，5′-CAA CCA ACA AGT GAT ATT CTC CAT G-3′；伊尔6：5'-GAC AAA GCC AGA GTC CTT CAG AGA G-3′，5'-CTA GGT TTG CCG AGT TCT C-3′；天花：5'-CAT CTT CTC AAA ATT CGA GTG ACA A-3′，5'-TGG GAG TAG ACA AGG TAC AAC CC-3′；Nlrp3号机组：5'-TCA GAT TGC TGT GTG TGG GAC TGA-3′，5'-AGC TCA GAA CCA ATG CGA GAT CCT-3′；伊夫纳：5'-GCT AGG CHY TRT GCT TTC CT-3′，5'-CAC AGR GGC TGT GTT TCT TC-3′；Ifnb公司：5’-GCC TTT GCC ATC CAA GAG ATG C-3’，5’-ACA CTG TCT GCT GGT GGA GTT C-3’。

人类-GAPDH公司：5′-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3′，5′-AGC CTT CTC CAT GGT GAA GAC-3′；IL6（IL6）：5'-GCC TTC GGT CCA GTT GCC TT-3′，5′-GCA GAA TGA GAT TTG TC-3′；TNF公司：5'-ATG ACT TCC AAG CTG GCC GT-3′，5'-TCC TTG GCA AAA CTG CAC CT-3′；IL1B级：5'-CCA CAG ACC TTC CAG GAG AAT G-3′，5'-GTG CAG TTC GAT CGT ACA GG-3′；如果：5'-GAG TGT GGA GAC CAT CAA GGA AG-3′，5'-TGC TTT GCG TTG GAC ATT CAA GTC-3′。

细胞因子分析

对于使用BMDM的体内分析和研究，根据制造商的说明，通过多重ELISA（Millipore，MCYTOMAG-70K）或IL-18 ELISA（Invitrogen，BMS618-3）测量细胞因子。对于使用PBMC的研究，根据制造商的说明，通过多重ELISA（Millipore，HCYTMAG-60K-PX29）测量上清液中促炎细胞因子的释放。对于多重ELISA，所有抗体均由制造商制备。

统计分析

数据分析使用GraphPad Prism 7.0软件。数据表示为平均值±SEM。统计显著性由非配对双尾学生的t吨对两组比较进行检验，对两组以上的比较进行单因素方差分析和Dunnett多重比较检验，对具有两个或多个时间点的两组以上比较进行双向方差分析，或对生存试验进行对数秩检验。P（P）小于0.05的值被视为具有统计学意义，其中*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，以及****P（P）< 0.0001.

我们感谢Kanneganti实验室的所有成员在编写这份手稿时提出的意见和建议。我们感谢A.Burton（圣犹德儿童研究医院）的技术支持。我们还感谢R.Tweedell博士的科学编辑和写作支持，以及Surekha Surendrathanan的技术援助。我们实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（AI101935、AI124346、AR056296和CA253095 to T.-DK.）和美国黎巴嫩叙利亚联合慈善机构（to T.-D.K.）的支持。内容完全由作者负责，不一定代表国家卫生研究院的官方观点。以下试剂由疾病控制和预防中心保存，并通过BEI Resources、NIAID、NIH获得：SARS-Related Coronavirus 2、Isolate USA-WA1/2020、NR-52281和Heat Inactivated NR-52286。