介绍
严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）已在全球范围内引起大流行。以免疫功能异常和严重肺损伤为特征的细胞因子风暴和继发性急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是SARS-CoV-2相关死亡的主要原因。1–三炎症细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α等）和趋化因子（CXCL10、CXCL9、CCL2、CCL3、CCL5等）的过度反应性分泌容易导致免疫系统“攻击”各种组织，从而导致ARDS。4炎症爆发后，重症新冠肺炎患者的免疫系统可能会被编程为免疫抑制状态，从而导致整个免疫系统崩溃而死亡。5对宿主-病原相互作用的深入研究部分揭示了新冠肺炎的免疫发病机制。6–8与其他两种β-冠状病毒类似，严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠病毒（MERS-CoV）可导致致命肺炎，9–11严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型还可以通过释放病原体相关分子模式（PAMP），如病毒RNA和损伤相关分子模式（DAMP），包括三磷酸腺苷（ATP）和脱氧核糖核酸（DNA），诱导炎性细胞因子的分泌和细胞死亡。根据对SARS-CoV的研究，SARS-CoV-2很可能在各种干扰素信号通路中拮抗干扰素反应。2，12–14然而，除了宿主细胞功能失调的防御反应和病毒对干扰素信号通路的拮抗外，尚不清楚SARS-CoV-2本身是否具有攻击性毒力因子，能够诱导细胞因子风暴并直接快速杀死靶细胞。
SARS-CoV-2是一种包膜、阳性、单链RNAβ-冠状病毒。它包含四种结构蛋白，Spike（S）、Membrane（M）、Nucleocapsid（N）和Envelope（E）蛋白，所有这些都是形成成熟病毒颗粒所必需的。15SARS-CoV-2的S蛋白是病毒表面的糖蛋白，由两个结构域S1（14–667 aa）和S2（668–1255 aa）组成。S1识别并结合宿主表面的人血管紧张素转换酶2（hACE-2），S2形成六螺旋构象，介导病毒包膜与宿主细胞质膜的融合。16–18由于S蛋白对宿主细胞的初始侵袭起着至关重要的作用，它已成为疫苗开发和药物设计中抗病毒靶点的主要焦点。16M蛋白（222 aa）是一种高度保守的非糖基化膜蛋白，主要位于病毒包膜的内表面，构成连接病毒内膜和N蛋白的支架。在病毒感染的早期，M蛋白积聚在宿主细胞核中，抑制宿主细胞基因的转录和翻译，为病毒基因组的复制、转录和翻译提供足够的时间。在感染后期，M蛋白进入细胞质，协助子代病毒颗粒的组装和释放。19N蛋白（419 aa）位于SARS-CoV-2病毒颗粒的中心，与病毒RNA相互作用，在病毒组装过程中对病毒RNA基因组的包装起着关键作用。20在四种主要结构蛋白中，SARS-CoV-2包膜蛋白（2-E）是最小的，只有75个氨基酸，被认为是跨膜蛋白。15其C末端结构域可能与宿主细胞胞内蛋白秀丽隐杆线虫lin-7蛋白1（PALS1）相互作用，该蛋白对维持哺乳动物上皮极性至关重要。212003年出现的一些关于SARS-CoV高度保守E蛋白的研究限制了对包膜蛋白（E）的更多了解。22E蛋白包含亲水性氨基末端结构域（NTD）、疏水性跨膜结构域（TMD）和长的亲水性羧基末端结构域。22据报道，严重急性呼吸系统综合征冠状病毒的E蛋白可能形成具有离子通道活性的孔。23–25病毒复制期间E蛋白的表达被认为对SARS-CoV的组装和出芽至关重要。26最近的一项研究认为，SARS-CoV-E蛋白不参与病毒的产生，而是一种独立的毒力因子。27有人认为SARS-CoV-E蛋白也可能作为一种促凋亡蛋白，通过激活内质网应激或与其他蛋白相互作用诱导细胞凋亡。22，28然而，迄今为止，冠状病毒E蛋白的药物活性尚未得到验证。
在这里，通过结合生物化学、电生理学方法和动物模型，我们发现2-E蛋白形成了一个阳离子通道，对宿主细胞甚至健康的周围细胞都是致命的，抑制2-E通道是一种很有前途的抗病毒策略。
结果
SARS-CoV-2-E形成阳离子通道
使用平面脂质双层记录技术评估2-E蛋白介导的潜在电信号（补充信息，图S1a、b). 当蛋白质以不对称50:500重组时，捕捉到典型的单通道电流 mM KCl溶液和3:2 PC/PS脂质膜，应用电位为-100 毫伏至+150 mV（图). 测量的反向电势（59.25 mV）非常接近K的理论平衡势+表明2-E通道对K具有渗透性+但不适用于Cl–.通过检查含有不同浓度K的溶液中的反转电位+，纳+和Cl–，我们发现2-E通道对Na具有渗透性+在K在场的情况下+和Cl-（图). 有趣的是，2-E通道对二价钙也具有渗透性2+和Mg2+然而，对二价Ca的渗透性2+和Mg2+低于单价离子（图). 渗透率等级((P（P）纳+≈P（P）K（K）+)/(P（P）钙2+≈P（P）镁2+)≈3.0）表明2-E通道具有与经典电压依赖通道不同的选择性模式。冠状病毒感染后，细胞器管腔侧的pH值可能发生变化。26我们发现，在独立实验中，当pH值降低时，振幅和打开概率都逐渐增加。pH值为10时，2-E通道在0以下几乎完全关闭 mV（图; 补充信息，图S1c、d). 一致地，最近解析的跨膜结构域证实了2-E确实形成了同五聚体通道，其N端和C端半对pH变化敏感。29总之，我们的数据支持2-E形成一种pH-敏感阳离子通道，这与同源E蛋白在SARS-CoV生命周期中的作用一致。27
SARS-CoV-2-E形成阳离子通道。一PC/PS在脂质双层中重构后2-E的单通道电流记录 = 3:2指示电位和溶液下的脂质。蛋白质（5-50 ng/mL）添加到顺式侧面。左记录道的所有点电流直方图（0，0，–50，0，0 mV）（“C”表示关闭；“O”表示打开）。b条
我-V（V）2-E蛋白在不同溶液中的曲线如左图所示(n个 ≥ 3).c（c）0中不同pH值下2-E的典型单通道电流记录 mV。右侧显示了高斯拟合的振幅直方图。以不对称50:500记录电流 mM KCl解决方案(反式：顺式)以及两者的pH值顺式和反式双方同时更换。d日
我–V（V）图（左）和开放概率（右）显示在不同的pH条件下(n个 ≥ 3).e（电子）2-E通道打开和关闭状态示意图。显示了每种离子的反向电势和磁导率。所有误差条均为SEM。
SARS-CoV-2-E体外诱导细胞死亡
据报道，细胞凋亡（GSDMD）和细胞坏死（p-MLKL）的执行者通过形成孔或通道破坏细胞膜的完整性。30，31在14个细胞系中评估了2-E通道对宿主细胞的影响，并在12、24、48和72个细胞系中测量了每个细胞系的存活率 瞬时转染后h。其中，Vero E6（非洲绿猴肾）、16HBE（人支气管上皮）、A549（人肺泡基底上皮）、HeLa（人宫颈癌）和CaCO-2（人肠癌）细胞逐渐死亡，其余细胞保持健康状态（图). 在易感细胞系中观察到2-E的相对高表达水平，而其余细胞系没有表达（补充信息，图S2系列). 选择Vero E6细胞进行进一步检查。用2-E质粒转染后，表达2-E的濒死细胞的初始光滑表面开始膨胀，最终爆炸并释放细胞内容物（图). 同时，流式细胞术证实，表达2-E的细胞进入了Annexin V和碘化丙啶（PI）双阳性阶段（补充信息，图第3章). 双阳性结果表明磷脂酰丝氨酸（PS）暴露和质膜完整性丧失是细胞死亡的标志。32，33值得注意的是，SARS-CoV-2感染导致Vero E6细胞严重死亡，其特征也是起泡（图). 然而，在坏死和热解的受试生物标记物中，磷酸化混合谱系激酶域样蛋白（p-MLKL，坏死）和裂解的胃泌素D（GSDMD，热解）的水平均未增加（补充信息，图S4系列). 这些数据表明，2-E以非典型方式诱导类似于细胞凋亡的细胞死亡。接下来，进一步评估2-E蛋白在生理浓度下是否能诱导细胞死亡。由于缺乏2-E蛋白抗体，我们比较了两种异源表达系统（转染2-E质粒25-200）中2-E和定量实时PCR（qRT-PCR）的细胞mRNA水平 ng/口井，约3–25 纳克/10三细胞）和SARS-CoV-2病毒（MOI = 0.1）感染系统（图). 对于Vero E6细胞，SARS-CoV-2感染细胞中2-E的mRNA水平与瞬时转染25 ng质粒，我们检测转染的最低DNA水平。重要的是，感染SARS-CoV-2的Calu-3细胞中2-E的mRNA水平是瞬时转染2-E质粒DNA水平最高的细胞的80倍（200 ng），表明2-E效应在体内外SARS-CoV-2病毒感染中可能比转染2-E表达质粒的细胞更显著。总之，这些数据表明，2-E诱导的细胞死亡可能在发病机制中发挥关键作用。
SARS-CoV-2-E的表达与SARS-CoV-2一样在体外诱导细胞死亡。一用2-E质粒转染后，14个细胞系在指定时间的细胞活力。b条细胞死亡期间Vero E6细胞中2-E表达的显微图像（bar，10μm）。c（c）感染SARS-CoV-2病毒的Vero E6细胞图像（bar，25 微米）。以指定浓度用2-E-mCherry质粒转染Vero E6和Calu-3细胞。d日不同转染水平下Vero E6细胞的存活率。e（电子）转染后Vero E6细胞中2-E的蛋白表达水平。（f）2-E转染和SARS-CoV-2感染Vero E6（左）和Calu-3（右）细胞（MOI）中2-E的表达 = 0.1). 所有数据均代表三个独立实验*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001; 未成对学生的t吨-测试。所有误差条均为SEM。
所有七种人类冠状病毒，包括HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2，都可能导致呼吸系统损害。根据其传播能力、感染人群、疾病严重程度和死亡率，人冠状病毒可分为低致病性和高致病性冠状病毒。34这些不同冠状病毒的E蛋白高度保守，序列同源性约为40%。特别是，严重急性呼吸系统综合征冠状病毒和严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型的E蛋白之间的同源性高达95%（补充信息，图S5a系列). 与之前的报告一致，SARS-CoV的E蛋白确实形成阳离子通透性通道（补充信息，图5亿美元).24我们发现，当在Vero E6细胞中异质表达时，它引起的细胞死亡与2-E相似（补充信息，图S5c系列). 有趣的是，低致病性冠状病毒HCoV-OC43的E蛋白也显示了通道活性。然而，HCoV-OC43-E的表达水平需要更高才能对细胞致命（补充信息，图S5d、e). 值得注意的是，许多其他因素，如侵袭能力、病毒复制程度和病毒转运效率，也被发现与冠状病毒的发病机制有关。34–362-E通道如何影响SARS-CoV-2感染的发病机制值得研究。
SARS-CoV-2-E在体内外激发强大的免疫反应
先前的研究表明，SARS-CoV-E蛋白与巨噬细胞浸润和炎性细胞因子的产生有关。27，37使用三种方法探索2-E诱导巨噬细胞的病理过程（补充信息，图S6a系列). 首先，我们用2-E质粒转染小鼠巨噬细胞系（RAW264.7）24小时 h和48 h.如图所示，转染后细胞和上清液中TNF-α和IL-6等细胞因子以及CXCL9和CCL12等趋化因子的表达水平显著上调，如先前在新冠肺炎患者中观察到的那样12（图; 补充信息，图S6b、c系列和表S1（第一阶段）). 其次，我们用纯化的2-E蛋白处理巨噬细胞，并获得了类似的增强的细胞因子水平（补充信息，图S6d系列). 鉴于病毒感染与先天性和适应性免疫反应有关，可以合理推测2-E对宿主细胞的损伤会导致二次炎症级联反应。为了验证这个假设，我们用2-E质粒转染Vero E6，24 h后，收集培养上清液并用于处理RAW264.7细胞。正如预期的那样，受损细胞的上清液也促进了细胞因子的表达（补充信息，图S6e系列). 然后我们用纯化的2-E蛋白静脉注射C57BL/6小鼠6小时和72小时 h.令人惊讶的是，72岁时，我们观察到肺部出现严重的肺实变灶和脾脏水肿 h（图)，但在模拟和牛血清白蛋白（BSA）组中没有（补充信息，图第7部分). 肺组织苏木精-伊红（H&E）染色显示明显的炎性细胞浸润、水肿、肺间质充血、出血和肺泡塌陷。这些观察结果与新冠肺炎患者的肺部相似，其中出现了最早和最严重的病变征象三（图). SARS-CoV-2感染可能引发过度炎症反应，导致多器官损伤。13，38，39我们使用qRT-PCR和酶联免疫吸附试验（ELISA）来表征病理特征。体内细胞因子和趋化因子的表达显著增加，炎症标记物显著上调，这也与之前报道的患者细胞因子风暴有关（图; 补充信息，图第8节). 我们的数据表明，2-E蛋白单独能够驱动肺充血，并在体内外激发强大的免疫反应。
SARS-CoV-2-E可在体内外激发强大的免疫反应。一与2-E转染防御反应相关的差异表达基因在热图中进行了总结。色码表示线性比例。红三角和黄菱形，用2-E质粒转染后IL-6和TNF-α水平的时间进程（补充信息，图S6b系列).b条，c（c）大体病理学(b条)和组织病理学(c（c）)来自对照小鼠（模拟，TBS）和模型小鼠（2-E，2-E蛋白质）（bar，10 微米）。d日6岁时的血清细胞因子水平 h和72 治疗后h*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001; 未成对学生的t吨-测试。所有误差条均为SEM。
显性负突变Thr11Ala（2-ET11A型)通过损害2-E通道功能削弱SARS-CoV-2复制和毒力
使用从丙氨酸扫描策略获得的突变体来研究2-E通道的功能含义。每个残基被丙氨酸（A）取代，并分别检测每个突变对细胞死亡诱导的影响。在总共70个突变体中，我们发现两个突变体Phe4Ala（2-E功能4a)和Thr11Ala（2-ET11A型)与野生型（WT，2-E）和其他突变通道相比，显著减轻了细胞死亡（图). 免疫荧光图像和western blot结果表明，这两个突变并没有改变转染效率和表达水平（补充信息，图第9部分). 然后评估这两个突变体如何影响细胞因子释放和体内病理表型。我们发现，与WT通道相比，突变体的异质表达导致RAW264.7细胞中细胞因子释放较少，将突变体蛋白接种到小鼠体内导致体内肺部病理表型较弱（补充信息，图S10–12). 然后我们纯化了突变蛋白（2-E四层甲和2-ET11A型)并使用双层脂质系统进行单通道记录。与它们不能诱导细胞死亡一致，这两个突变体在高于0的刺激电位下都不能诱导典型的单通道电流 mV。仅当刺激电位在-50或以下时 mV，可以从突变通道中记录到大大减小的电流（图). 突变体2-ET11A型被选中进行进一步调查。我们彻底混合了2-E重量和2-ET11A型蛋白以1:1的比例混合，随机组合后记录通道电流。通过20个独立的检测实验，我们发现记录的单通道电流可以根据电流幅值分为两组。一组振幅较小，范围为-0.8至-3.3 pA。比例为18/20（更多n个数字）。另一组振幅较大，约为5.8 pA。比例为2/20（较少n个数字）。较小组的平均振幅约为-1.69 pA，接近2-ET11A型单独（-1.6 pA），而较大组为-5.8 pA，类似于2-E重量单独（-5.7 pA）（补充信息，图第13节). 这些数据表明突变体2-ET11A型和2-E重量可以组装在一起形成具有不同化学计量比和突变2-E的异多聚体T11A型对2-E通道电流产生了主要的负面影响（图). 振幅较大的事件与振幅较小的事件的概率比为1:10。最近的一项结构研究证实，2-E跨膜结构域与SARS-CoV的E蛋白一样形成同型五聚体，29我们认为五聚体通道中的一个或多个突变亚基将主要损害通道的功能。
显性阴性突变Thr11Ala（2-ET11A型)通过损害2-E通道功能削弱SARS-CoV-2复制和毒力。一每个突变体的存活水平。用丙氨酸（A）取代2-E蛋白的每个残基，并通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测每个突变对细胞死亡诱导的影响。b条2-E、2-E的代表性记录道四层甲和2-ET11A型在含有PC/PS的脂质双层中 = 3:2指示电位下的脂质。c（c）
我–V（V）2-E、2-E曲线四层甲和2-ET11A型(n个 ≥ 3).d日仅2-E、2-E的代表记录道T11A型单独和2-E/2-E混合物T11A型(1:1).e（电子）2-E和2-E的电流振幅T11A型（向上）；2-E/2-E混合物的电流振幅T11A型（1:1），这幅漫画展示了五聚体（向下）的模型。（f）如图所示，转染质粒后Vero E6细胞的存活水平。克实验流程图（左），以及通过qRT-PCR测定的细胞和上清液中的病毒拷贝数（右）。SARS-CoV-2感染的MOI为0.01。独立进行了两次实验，获得了类似的结果。这里显示了一组具有代表性的数据(n个 ≥ 3) (（f），克). *P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001; 未成对学生的t吨-测试。所有误差条均为SEM。
为了评估2-E的功能含义T11A型，我们首先测试突变2-ET11A型影响2-E诱导细胞死亡的能力。用2-E混合物转染Vero E6细胞重量/2-E型T11A型（1:1），2-E重量单独和2-ET11A型单独使用，并分别检查细胞存活率。始终如一，2-E重量/2-E型T11A型或2-ET11A型与2-E相比，转染细胞的存活率更高重量（图). 有趣的是，2-E的蛋白表达水平重量/2-E型T11A型和2-ET11A型实际上比2-E高重量支持显性阴性突变确实通过降低2-E通道活性而不是降低蛋白质表达水平来减轻细胞致死性（补充信息，图S9c公司).
下一个问题是，蛋白质2-E作为离子通道在SARS-CoV-2生命周期中起着什么作用，以及2-E通道的活性是否具有生理意义和治疗价值。我们设计了以下实验来解决这些问题。第1天，用2-E转染Vero E6细胞重量或2-ET11A型质粒，然后在第2天感染SARS-CoV-2病毒。通过qRT-PCR测定，突变体2-E的预表达T11A型与2-E相比，病毒载量和滴度显著降低重量确实存在于细胞和上清液中（图). 逻辑上可以推断出一些外源2-ET11A型由于突变2-E的显性负效应，亚基将与病毒的WT亚基共同组装，形成通道活性受损的异多聚体T11A型，从而极大地阻碍了严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型的产生。总之，这些结果支持2-E在SARS-CoV-2生命周期中作为离子通道发挥生理作用。
2-E通道抑制剂对SARS-CoV-2感染hACE-2小鼠模型的防治作用
在表达hACE-2（SARS-CoV-2感染的常见动物模型）的转基因小鼠中评估2-E通道抑制剂的体内抗病毒活性。38，40–43我们通过两种给药方式测定了BE-33的体内疗效。或者，ACE-2人源化小鼠（hACE-2小鼠）接受预防性剂量的5 mg/kg BE-33或作为对照的载体2 感染SARS-CoV-2（2）前h × 106TCID公司50). 或者，用5 毫克/千克BE-33 2 SARS-CoV-2感染后h（2 × 106TCID公司50)（图). 我们在感染后一天监测小鼠的病理状况。研究结束时，所有小鼠均存活并处死以收集组织。检测到体重、肺重量和脾脏重量，未观察到明显变化（图). 与先前的研究一样，通过qRT-PCR检测严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型的病毒复制。4，44对于接受BE-33的小鼠，我们观察到与对照小鼠相比，治疗性或预防性给药的肺部病毒RNA水平有降低的趋势。特别是在治疗组，所有肺叶的病毒拷贝数都低于检测限（图). 然后进行尸检，尸检显示肺部有严重病灶，下呼吸道有不同程度的实变、水肿、出血和坏死，表明对照组为间质性肺炎，而BE-33可以缓解实验组的这些症状（图，上面板）。服用BE-33后，脾脏水肿明显减轻，尤其是治疗组（图，底部面板）。经组织病理学分析，SARS-CoV-2感染引起的小鼠肺部病理学与人类SARS-CoV-2感染的严重病例相似，表现为弥漫性肺泡损伤、肺水肿、透明膜形成和淋巴细胞浸润肺泡隔，而在BE-33治疗组中，只观察到少量的曙红在肺部，小鼠肺部受到轻微损伤（图). 为了评估BE-33是否可以减轻病毒诱导的炎症，我们测量了左肺中炎症细胞因子和趋化因子的mRNA水平（图). 与感染小鼠相比，BE-33治疗小鼠的炎症细胞因子和部分趋化因子水平显著降低。具体而言，治疗组和预防组在感染期间IL-6、IL-1RA和IL-1β均降低。通道抑制剂BE-33的体内抗病毒活性支持2-E通道作为一个有前景的药物靶点。
2-E通道抑制剂保护小鼠免受SARS-CoV-2感染，并限制肺部炎症。一实验参数方案。SARS-CoV-2的剂量为2×106TCID公司50每个鼠标。 b条SARS-CoV-2感染和BE-33注射后的体重（左）、肺和脾（右）。c（c）SARS-CoV-2感染和BE-33注射后小鼠肺不同部位的病毒RNA载量。d日肺部和脾脏的病变。感染后尸检时获得的受感染动物的腹侧肺和脾脏视图（左）（比例尺，2.5 毫米）。病理学评分在右边。e（电子）肺切片的H&E染色（比例尺，50 微米）。每张图片代表一组3只老鼠。（f）通过qRT-PCR分析评估各组左肺的细胞因子和趋化因子表达。n个 > 每组5只，按指示在不同时间处死小鼠*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001; 学生的t吨-测试。所有误差条均为SEM。
为了进一步评估BE-33的药物敏感性，对抑制剂的药代动力学（PK）特性和体内毒性进行了评估。如表所示给小鼠口服BE-33（10 mg/kg）和静脉注射（2.5 mg/kg）显示半衰期（T1/2)第4.45页和第5.67页 h、 以及较高的最大血浆浓度（C最大值 = 497 ± 80 ng/mL），中等清除率（CL = 31.1 ± 7.9 mL/min/kg），并且观察到51%的良好口服生物利用度（表). 此外，治疗后BE-33在肺部以非常高的浓度富集（1×105 ng/g），是其抗病毒IC的150倍50体外试验。BE-33在小鼠体内进行了毒性研究（表). 在5、10和50剂量水平下，对BE-33的剂量范围毒性进行了5天的研究 在C57BL/6小鼠中为mg/kg。所有动物每天通过尾静脉注射给药一次，并且每天至少进行一次临床观察。两种药物均未观察到明显毒性 mg/kg或10 mg/kg组。在体重达到50 与对照组相比，BE-33的mg/kg（表). 这些数据表明BE-33是一种很有希望的抗SARS-CoV-2感染的候选抗病毒药物。
表2
化合物BE-33在C57BL/6小鼠中的初步药代动力学（PK）评价一.
| 剂量 | 路线 | T型1/2（h） | T型最大值（h） | C类最大值（纳克/毫升） | AUC公司最后的（h*ng/mL） | AUC公司信息（_O）（h*ng/mL） | CL（毫升/分钟/千克） | 地铁信息（_O）（h） | Vss公司_光突发事件（毫升/千克） | F（%） |
|---|
| 10 毫克/千克 | 采购订单 | 4.45 ± 0.67 | 0.25 ± 0 | 497 ± 80 | 2699 ± 791 | 2776 ± 806 | – | 6.67 ± 0.47 | – | 51 |
| 2.5 毫克/千克 | 四 | 5.67 ± 1.09 | – | – | 1324 ± 330 | 1405 ± 393 | 31.10 ± 7.90 | 7.53 ± 1.90 | 13535 ± 1699 | – |
表3
| 管理 | 物种 | 剂量（mg/kg） | 动物数量 | 频率 | 结果 |
|---|
| 尾静脉注射 | C57BL/6型 | 5/10/50 | 5/组 | 重复剂量 | 在体重达到50 然而，与对照组相比，在50 mg/kg给药组，观察到运动活性显著下降。 |
讨论
SARS-CoV-2感染中2-E通道的生理相关性
综合证据支持2-E通道在SARS-CoV-2产生和发病机制中具有生理功能。首先，SARS-CoV-2感染的Vero E6和Calu-3细胞中2-E的mRNA水平能够在异源表达系统中诱导细胞死亡（图). 第二，降低2-E通道活性的显性阴性突变减弱了通道的致死性和SARS-CoV-2的产生（图). 最后但并非最不重要的是，通道抑制剂BE-33对2-E通道活性的药理学抑制大大降低了hACE-2小鼠模型中SARS-CoV-2病毒滴度和SARS-CoV-2感染的发病机制（图). 总之，这些结果表明2-E通道在SARS-CoV-2感染中具有更广泛的生理相关性。
新出现的证据表明，离子稳态不仅对宿主细胞的生存能力至关重要，而且也是病毒生命周期的一个组成部分。27，45特别是，病毒离子通道干扰宿主细胞的电化学梯度，并在感染细胞组装和释放成熟病毒颗粒中发挥重要作用。46病毒基因组中基因编码通道的缺失显著降低了病毒子代的形成和致病性。27除了单价钾和钠外，2-E通道还可渗透到二价钙和镁。钙被发现可以促进病毒进入宿主细胞，对埃博拉和SARS-CoV-2感染至关重要。47–49最近的一项研究发现，SARS-CoV-2不是使用传统的生物合成分泌途径，而是通过溶酶体胞吐向溶酶体出口，导致溶酶体脱酸。与我们的研究结果一致，2-E通道的结构支持N-末端和C-末端对半对pH变化敏感。29，502-E通道pH敏感性的生理相关性值得进一步研究。采用丙氨酸（A）扫描策略，建立离子通道功能、细胞死亡活性和病毒复制之间的关系。结果发现了几个有趣的观察结果。用丙氨酸取代残基Phe4或Thr11会削弱通道活性和杀伤细胞的能力。值得注意的是，突变体（2-E）混合物介导的单通道电流T11A型)和WT（2-E）通道倾向于突变通道电流，表明突变具有显性负作用。一直以来，我们发现在共同表达2-E的细胞中细胞死亡较少T11A型2-E，这不是由于蛋白质表达水平的降低。重要的是，在SARS-CoV-2感染模型中，显性阴性突变体2-E的表达T11A型显著抑制病毒复制，表明2-E通道活性对病毒生存和繁殖至关重要。尽管2-E通道如何调节跨膜离子稳态尚不清楚，但一般认为这种通道是病毒产生和成熟所必需的。37利用反向遗传学构建一种显性负突变或缺乏2-E基因的SARS-CoV-2工程病毒，将为验证2-E在病毒生命周期中的重要作用提供更多证据。
2-E通道攻击宿主细胞并作为攻击性毒力因子触发炎症
我们发现2-E蛋白可能作为SARS-CoV-2携带的“攻击性”毒力因子，导致强烈的炎症反应和细胞死亡，这可能解释临床加重和死亡。从形态学照片来看，2-E介导的细胞死亡最终导致细胞膜破裂，就像吹气球一样。在S蛋白和hACE-2相互作用介导的SARS-CoV-2膜与靶细胞膜融合后，在跨膜蛋白酶丝氨酸2（TMPRSS2）、Furin和Elastase等辅助因子的辅助下，2-E通道可以通过干扰其离子稳态立即启动毒力因子并削弱宿主细胞防御。16，51细胞死亡的两个执行者MLKL和GSDMD最近越来越受到关注，它们都通过离子失衡破坏质膜并导致细胞爆炸。30，31此外，已经证明细胞内钾的消耗是促进细胞因子分泌和加重细胞死亡的共同因素。30，52这些研究强调了离子通道在细胞死亡和炎症中的重要性。
根据临床报告，病毒复制和细胞溶解是新冠肺炎感染的首次发病。53随着疾病的进展，病毒复制减少与免疫球蛋白G（IgG）转化的开始有关。然而，ARDS期间的临床症状仍可能恶化，过度活跃的宿主反应会导致更严重的炎症、肺泡肺损伤和其他典型特征。这种恶化不能用控制病毒复制来解释。6，14，54此外，新冠肺炎患者的严重程度与电解质失衡有关，包括血清钾、钠和钙浓度降低。55然而，严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型感染中炎症激活和电解质紊乱的机制尚未揭示。如图所示，我们记录了由纯化的2-E蛋白介导的单通道电流，支持2-E作为可渗透钾、钠、钙和镁的离子通道。将2-E定义为离子通道可能有助于揭示低钾血症如何加重ARDS的致病机制。44由于2-E通道诱导细胞突然死亡，大量SARS-CoV-2颗粒、2-E和其他DAMP可以同时释放。巧合的是，一些新冠肺炎患者可能会从轻微症状迅速恶化为突发中风。56，57
抑制2-E通道是一种很有前途的抗病毒策略，其抑制剂BE-33是一种有前途的抗新冠肺炎候选药物
由于SARS-CoV-2缺乏有效的抗病毒药物，因此迫切需要开发新的新型冠状病毒治疗药物。可以设想几种方案来控制或预防新出现的新冠肺炎感染，包括疫苗、单克隆抗体、基于寡核苷酸的疗法、肽、干扰素疗法和小分子药物。58近年来，抗病毒药物的发现取得了积极进展，包括一种古老的药物达巴万新和一种有效的中和抗体BD-368-2。59，60然而，迄今为止，靶向RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）的雷德西韦是唯一批准用于新冠肺炎治疗的药物。1，61根据SARS-CoV和MERS-CoV的治疗经验，目前药物的研发主要针对两个方面。62首先是针对病毒本身，包括抑制病毒生命周期的各种底物、酶和病毒表面蛋白质。例如，霉酚酸、广谱抗病毒药物抑制核苷的合成，63洛匹那韦，3C样蛋白酶（3CLpro）抑制剂，可减少病毒复制，64多肽和单克隆抗体靶向病毒树突状蛋白。60，65，66控制炎症反应可能与抑制病毒增殖一样重要，因此另一种策略是靶向宿主细胞。2，12，67，68合理设计抗病毒药物组合是治疗新型冠状病毒肺炎的潜在策略，但缺乏确凿的临床证据。因此，寻找高效的治疗药物是当前的首要任务。
在当前的研究中，发现了一类在体内外都具有抗病毒活性的新型2-E通道抑制剂。在hACE-2小鼠感染模型中，BE-33抑制SARS-CoV-2的生成并限制肺部炎症。重要的是，在预防和治疗模型中，BE-33给药显著抑制了严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型感染引起的病毒复制和组织病理学损伤。鉴于其相对较高的安全性和良好的PK特性，我们的数据表明BE-33是一种有希望的抗新冠肺炎候选药物。据我们所知，很少有小分子在体内肺部的病毒载量和炎症方面表现出抗病毒活性。例如，在雪貂模型中，羟基氯喹和洛匹那韦/利托那韦都无法降低呼吸道组织中的病毒载量或滴度。69雷米西韦是FDA批准的抗病毒药物，广泛用于治疗新冠肺炎，但在恒河猴模型中不能降低呼吸道病毒载量。70相反，在感染后给药时，2-E通道抑制剂BE-33显著降低了感染肺部所有部位的病毒载量（图，右侧面板）。令人鼓舞的是，在最近的一些研究中，除BE-33外，一些旧药物，如达巴万新、plitidepsin、甲氟喹和灵芝（RF3），对病毒复制和肺损伤都显示出良好的预防作用。59，71，72IL-6和TNF-α血清水平被认为与病毒载量无关，可作为疾病严重程度和死亡的重要预测指标。69有趣的是，在使用通道抑制剂的小鼠中，IL-6水平显著降低。在缺乏有效的SARS-CoV-2抗病毒药物的情况下，BE-33在小鼠中观察到的良好治疗效果揭示了2-E通道抑制剂的潜力。到目前为止，还没有关于2-E突变的报道。此外，2-E蛋白在β-冠状病毒中高度保守，其中一些蛋白在我们的研究和其他研究中已被证实能够形成通道，这表明E通道可能代表广谱抗病毒药物靶点（补充信息，图第5章).22，28，34，73，74抑制病毒生命周期和调节功能失调免疫反应的治疗可能会协同阻止病理。鉴于2-E可以作为病毒膜上的离子通道，类似于它们在宿主细胞中的功能，我们建议2-E通道可能代表一类新的抗SARS-CoV-2的双功能靶点。
材料和方法
质粒和诱变
野生型SARS-CoV-2-E序列由北京基因组研究所（BGI，中国）合成。载体pET28a用于蛋白质纯化，载体pcDNA5和pcDNA3.1用于细胞存活测定和细胞成像。通过定点突变产生点突变，并通过测序确认。
细胞培养和治疗
HEK293、MCF-7、CaCO-2、Vero E6、HeLa、HepG2、SH-SY5Y、Calu-3细胞在添加10%胎牛血清（FBS、Gibco、USA）、2 mML（左）-谷氨酰胺和100单位/mL青霉素/链霉素（美国吉布科）。在上述培养基中添加1%NEAA（美国吉布科）用于A498细胞培养。此外，在McCoy’s 5中培养了HCT116和HT-29细胞 基本培养基（美国Gibco）、PC3和A549细胞在RPMI-1640基本培养基中生长（美国Hyclone），CHO细胞在补充上述内容的DMEM/F-12基本培养基上生长（美国Gipco）。16HBE细胞在KM（ScienceCell，USA）培养基中生长。为了进行细胞活性测定和western blot，细胞被转染了3200个 ng或200 根据该公司的说明，使用Lipo3000转染试剂将SARS-CoV-2-E质粒转染6孔或96孔（Thermo Fisher，美国）。为了进行细胞毒性试验，将Vero E6细胞接种在96周板中，每孔15000个细胞过夜。对于细胞保护试验，转染10天后添加化合物 h.对于抗病毒试验，用介质稀释化合物至适当浓度，体积为100 将μL添加到每个孔中，然后培养24 小时。
细胞活性和细胞毒性试验
使用CCK-8试剂盒（40203ES60，Yeasen，中国）测量细胞活力和细胞毒性。根据制造商的说明进行分析。测量450时的吸光度 nm，使用Thermo Scientific Microplate Reader（美国赛默飞世尔科学公司）。
Western blot分析和抗体
蛋白质在12%SDS-PAGE中解析，转移到PVDF膜（GE）上，并与抗HA Tag（C29F4）（3724，CST，USA）、GAPDH（30201ES20，Yeasen，China）、mCherry（ab125096，Abcam，UK）、α-Tublin（11224-1-AP，Proteintech，USA）、his（30404ES60，Yeasen，China）的一级抗体一起孵育。第二种抗体是过氧化物酶结合山羊抗狂犬病IgG（H+L）（33101ES60，中国耶森）和过氧化物酶亲和纯山羊抗小鼠IgG。
细胞死亡的流式细胞术
处理后，分离细胞，通过离心收集并重新悬浮在含有100 µg/mL碘化丙啶（PI）和Annexin V-FITC（1:20，V13242，Life，USA），并在室温下培养15 分钟。随后，400 添加μL的1×结合缓冲液，并将细胞保存在冰上。使用BD FACSCALIBUR 4（BD COMPANY，USA）通过流式细胞术分析细胞。不同标记细胞的百分比由FlowJo 7.6计算。
成像
采用两种方法检测细胞死亡形态。或者，细胞作为2个种子 × 1056孔板中每孔的细胞数（30720113，美国赛默飞世尔科学公司）。转染24天后 h、 使用Leica TCS-SP8 STED系统（Leica Microsystems，DE）以40×相位差物镜捕获细胞。显示的所有图像数据均代表至少三个随机选择的字段。或者，将Vero E6细胞接种为1 × 10424孔板中每孔的细胞数过夜。第二天，用2%FBS-DMEM代替培养基。然后在MOI添加SARS-CoV-2病毒 = 0.1，模拟无感染。48岁时 h和72 h、 在明亮的视野下，用荧光显微镜（日本奥林巴斯）从每口井捕捉到三幅图像。
酶联免疫吸附试验
对细胞培养上清和血清中的小鼠IL-6（VAL604，美国明尼苏达州研发中心）、小鼠TNF-α（VAL60，美国明尼苏达州R&D）、小鼠IL-10（VAL6，美国明诺苏达州研究与开发中心）、鼠IL-1α（VAL 601，美国明尼苏达州立研发中心），小鼠IFN-γ（VAL 607，美国明苏达州R&D），小鼠IL-2（abs520002，中国Absin）进行分析根据制造商的说明。
qRT-PCR分析
按照制造商的说明，使用Trizol（Invitrogen，美国）和所有总核酸分离试剂盒（Ambion Inc.，美国）从细胞和组织中提取总RNA。使用SYBR Green Master Mix（11184ES03，Yeasen，中国）进行了至少三次试验，以量化δCt和SEM（平均值标准误差）的平均值。用于定量的引物列于补充信息表S1（第一阶段）.
蛋白质纯化
编码全长SARS-CoV-2 E蛋白的基因（NCBI参考序列{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“YP_009724392.1”，“term_id”：“1796318600”，“term_text”：“YP_0097243 92.1”}}YP_009724392.1型，残基1–75）在BGI（中国）合成。为了表达全长SARS-CoV-2-E蛋白，在pET28a载体中2-E基因的C末端引入了一个6×His标记。将质粒转染到大肠杆菌表达融合蛋白的BL21（DE3）pLysS活性细胞（CD701-02，TransGen Biotech，中国）。单个菌落的DNA序列通过测序进行了验证（BGI，中国）。简单地说，这个单一的菌落从50年开始扩增 mL LB培养基，含50 μg/mL氨苄青霉素，细胞在37°C下生长，在220℃下振荡 转速。用发酵剂培养物接种10 L LB培养基，含50μg/mL氨苄西林。细胞在37岁时生长 °C，在220下摇晃 rpm，直到光学密度达到600 达到0.6–0.8 nm（OD600）。然后用0.5诱导蛋白质表达 mM IPTG（异丙基-b-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，10902ES60，中国耶森），22 16–18°C h.在4时通过离心收集细胞颗粒 °C和4000 20转/分 最小值，并重新悬浮在绑定缓冲区（150 mM氯化钠，20 mM三基，1 mM DTT，1%PMSF，1×鸡尾酒，pH 8.0）。用高压匀浆器在800–900下裂解重悬的细胞 3–8巴 4°C时最小值。细胞裂解物的可溶部分通过10000×离心从细胞碎片中分离克对于30 min，上清液通过0.22过滤 μM过滤器，用于去除颗粒。使用TBS缓冲液（150）对Ni-NTA树脂（20502ES60，Yeasen，中国）进行预平衡 mM氯化钠，20 mM Tris-base，pH 8.0）。将澄清的上清液加载到5 4 mL Ni-NTA树脂 h将2-E-6×His融合蛋白从大肠杆菌蛋白质。柱用10倍柱体积的咪唑浓度梯度在20 毫米，30 毫米，50 TBS中的mM。洗涤后，用300洗脱2-E融合蛋白 mM咪唑在TBS中。然后使用Superdex 75 Increase 10/300凝胶过滤色谱（29148721，GE Healthcare，USA）与TBS预平衡，通过凝胶过滤色谱纯化2-E融合蛋白。收集含有2-E蛋白的组分。最后，我们使用去除内毒素的琼脂糖树脂（20518ES10，Yeasen，中国）去除内毒素。75，76用TBS平衡琼脂糖树脂后，将纯化的蛋白质以0.25的速度加载到树脂上 收集洗脱液进行浓缩，并用于电生理记录、巨噬细胞免疫实验和动物模型。
LC-MS/MS分析
所有液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）实验均在由Easy-nano-LC系统和Q-Exactive HF质谱仪组成的在线装置上进行（Thermo，Bremen，Germany）。将肽装入内部填充柱（75μm×200 mm熔融石英柱，带有3μm ReproSil-Pur C18珠，Dr.Maisch GmbH，Ammerbuch，Germany），并以60分钟的梯度以300 nL/min的流速分离。溶剂a含有100%的H2O和0.1%甲酸，溶剂B含有100%的乙腈和0.1%的甲酸。喷雾电压设置为2500 V为正离子模式，离子转移管温度设置为275 摄氏度。MS1全扫描的分辨率设置为60000 m/z 200、AGC目标3e6和最大IT 20 毫秒，然后MS2扫描，分辨率为15000，m/z 200，AGC目标1e5，最大IT 100 ms。前体离子被高能碰撞离解（HCD）破坏。隔离窗口设置为1.6 m/z。归一化碰撞能量（NCE）设置为NCE 27%，动态排除时间为30 s.带电荷1、7、8和>的前体 排除了8例用于MS2分析。
使用MaxQuant分析MS原始数据(http://maxquant.org/, 1.6.7.0). 氧化蛋氨酸和蛋白质N-末端乙酰化被设定为可变修饰。选择胰蛋白酶/P或糜蛋白酶作为具有两种潜在缺失裂解的消化酶。肽和蛋白质的错误发现率（FDR）受到严格控制< 1%.
平面脂质双层记录
将纯化的蛋白质并入脂质双层以测试其功能。77所有脂质均购自Avanti（美国Avanti Polar lipids公司）。蛋白质被添加到顺式侧面和缓冲器包含500个 mM KCl英寸顺式/50 mM KCl英寸变速器，所有溶液缓冲5 mM HEPES，pH 6.35。使用华纳双层钳式放大器BC-535（华纳仪器公司，美国）在电压灯模式下记录膜电流，并在1-2下过滤 千赫。记录频率为10 千赫。使用pClamp 10.2软件（Molecular Devices，US）对电流进行数字化。数据以平均值±SEM表示。单通道电导和开路时间通过拟合高斯函数（槽宽=0.25 pA）或单指数或双指数方程。打开时间小于0.5–1.5 ms被忽略。使用能斯特方程和戈德曼-霍奇金-卡茨通量方程计算平衡势。
SPR分析
如前所述，使用Biacore T200仪器（GE Healthcare）通过SPR评估化合物与2-E蛋白的结合亲和力。78简单地说，2-E蛋白通过胺偶联方法以10的流速固定在CM5芯片表面 10μL/min mM醋酸钠缓冲液（pH 4.5）。传感器表面用7激活 注入50 mM N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和200的混合物 mM 1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺（EDC）。然后是50 注射μg/mL Tau蛋白以达到1400 RU左右的目标水平，并用1 M乙醇胺，pH 8.5。系列浓度（通常为1.5625 微米，3.125 微米，6.25 微米，12.5 微米，25 μM，50 100微米 200微米 μM）的化合物注入流动系统并分析90 s、 解离度为120 s.所有结合分析均在含有0.05%（v/v）吐温-20和1%二甲基亚砜的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进行，pH 7.4，25 摄氏度。在分析之前，进行了双参考减法，以消除体折射率变化、注入噪声和数据漂移。结合亲和力通过在Biacore评估软件（GE Healthcare）中拟合Langmuir 1:1结合模型来确定。
病毒抑制试验
SARS-CoV-2（nCoV-2019BetaCoV/武汉/WIV04/2019）保存于中国科学院武汉病毒学研究所。用Vero E6细胞进行繁殖和滴定，并在生物安全3级（BSL-3）设施中进行相关操作。对于病毒抑制试验，将Vero E6细胞接种在48-well板中，每孔50000个细胞过夜，首先用梯度稀释化合物预处理1 h、 然后添加SARS-CoV-2（MOI = 0.01）和孵育1 37小时 摄氏度。之后，将病毒-药物混合物完全清除，用PBS清洗细胞两次，然后添加含有化合物的新鲜培养基。24 h后，使用Mini-BEST viral RNA/DNA Extraction Kit（日本高原市）根据说明从细胞上清液中提取病毒RNA，然后使用Prime ScriptTM RT试剂盒和gDNA橡皮擦进行反向转录（日本高原市）。用Takara TB Green定量病毒基因组拷贝®使用一对靶向S基因的引物，通过标准曲线法在ABI 7500上预混Ex Taq™II（Takara，Japan）。正向引物：5′-CAATGGTTTAACAGGCACAGG-3′，反向引物：5'-CTCAAGTCTGTGGATCACG-3′。
动物模型
通过尾静脉注射纯化蛋白（25 mg/kg体重）。雄性C57BL/6小鼠从上海SLAC实验动物有限公司获得。所有动物程序均按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行，并遵循机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准和严格遵守的方案。
hACE-2小鼠由Jiekai Chen博士善意提供，并在ABSL-3中保持在特定的无色素（SPF）条件下，在14至18周时使用。所有动物都可以免费获得水和食物，并获得12 h光/暗循环。所有动物实验均按照中国科学院昆明动物研究所（KIZ）《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。中科院KIZ动物护理和生物安全机构委员会批准了ABSL-3中的工程（批准ID:SMKX--tz-20200415-03）。
动物模型的病毒滴定
SARS-CoV-2毒株（登录号：NMDCN0000HUI）由中国广东省疾病预防控制中心提供。该病毒在Vero E6细胞中繁殖和滴定，该细胞在添加10%FBS的DMEM中培养。病毒序列可在中国国家微生物数据中心（检索号：NMDCN0000HUI）获得。
小鼠感染和样品采集
hACE-2小鼠(n个 = 36）用异氟醚（RWD Life Science）麻醉，然后用2 × 106TCID公司50SARS-CoV-2在30年内 DMEM的μL。对于模拟对照组，小鼠鼻内注射30 μL DMEM。对所有小鼠进行观察，并在处死前每天监测其体重。在感染后的指定时间点从处死的小鼠中收集组织样本。简单地说，用异氟醚对小鼠进行深度麻醉并处死。收集不同的组织并将其储存在–80 °C冷冻柜或4%PFA，直至使用。
病毒负荷测量
简单地说，组织样本溶解在1 mL TRIzol™试剂（美国Thermo公司），然后根据制造商的方案进行RNA提取。提取的RNA用于使用雷鸟测量SARS-CoV-2的核蛋白N基因拷贝®按照制造商的协议探测一步qRT-PCR试剂盒（Toyobo）。结果以拷贝数/μg组织总RNA表示。qRT-PCR引物序列如下：正向引物：5′-GGGGAACTTCTTCCTGCTAGAAT-3′；反向引物：5′-CAGACATTTTTGCTCAAGCTG-3′。
组织学/免疫荧光
将病毒感染小鼠的组织固定在4%PFA中至少7天，然后按照标准程序将石蜡包埋并切割成3μm的切片。切片用H&E染色，并用光学显微镜检查。病理评分根据肺组织病变的程度进行评估，包括肺泡间隔增厚、出血、炎性细胞浸润和实变。半定量评估如下：当未观察到肺泡间隔增厚时，我们得0分；当肺泡间隔肥厚非常轻微且肺泡间隔加厚、出血和炎性细胞浸润面积小于10%时，我们得分为1分，当肺泡间隔增厚较轻且肺泡间隔增厚、出血和炎性细胞浸润面积为10%-25%时得分2，当肺泡间隔增厚较轻且肺泡间隔增厚、出血和炎性细胞浸润面积为25%-50%时得分3，当肺泡间隔增厚明显，肺泡间隔肥厚、出血、炎性细胞浸润和实变面积为50%～75%时，得分为4；当肺泡隔增厚非常明显，肺叶间隔增厚、出血和炎性细胞渗透面积为5，合并率大于75%。图像由徕卡DM 6B显微镜拍摄。
小鼠体内药代动力学
在体重16–20的雄性C57BL/6小鼠中进行了药代动力学研究 克(n个 = 3). 通过单次静脉注射获得药代动力学参数（2.5 mg/kg）或口服BE-33（10 mg/kg），溶于混合溶液（po:DMSO/0.5%HPMC（v/v = 5/95). iv：DMSO/EtOH/PEG300/0.9%NaCl（v/v/v/v = 5/5/40/50)). 在0.083采集肝素化血液样本 h、 0.25个 h、 0.5个 h、 1个 h、 2个 h、 4个 h、 8个 h、 和24 静脉给药后h，0.25 h、 0.5个 h、 1个 h、 2个 h、 4个 h、 6个 h、 8个 h、 和24 分别在口服给药后h。血浆通过离心分离并冷冻保存在-20 °C，直到后续分析。采用LC-MS/MS对样品进行生物分析。组织分布分析采用12只健康ICR雄性小鼠，体重20-25 g、 禁食12次 试验前h，自由饮水。0.25 h、 1个 h、 4个 h和16 口服给药后h，放血处死腹主动脉，每个时间点处死3只雄性小鼠。0.5 从每只动物身上采集mL全血，置于肝素化试管中，15000离心 5转/分 min，血浆被分离并冷冻保存在-20℃的冰箱中 摄氏度。处死动物后，解剖大脑、肝脏、肺、肾和十二指肠，并用冰生理盐水清洗残余血液。另2只雄性小鼠作为对照。通过LC-MS/MS测定血浆和组织中每种化合物的浓度。
BE-33 1周毒性研究
对体重20–25的SPF C57/BL6雄性小鼠进行毒性研究 g.进行为期一周的剂量范围毒性研究。C57/BL6小鼠被分为六组，其中包括一个载体组和五个静脉注射组（0.2 mL/min）组（每组3-6只小鼠），BE-33的剂量为5、10、50 mg/kg。对所有动物每天至少进行一次临床观察，观察时间至少为7天，观察其是否有中毒症状，包括体重、食物和饮水量、直肠温度和血液学。实验结束时，采集心、肝、脾、肺、肾和给药部位的样本。
