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.2023年2月；11（1）：e01041。
doi:10.1002/prp2.1041。

黄曲霉素通过激活PI3K-Akt-mTOR通路抑制自噬抑制胶质瘤细胞增殖和致瘤性

陈华清 1 2, 桐珠 1 2, 黄晓杰 1 2, 徐文双 1 2, 泽民帝 1 2, 马宇阳 1 2, 闵雪 1, 四星毕 2 三, 沈玉君 1 2, 余永强 三, 沈玉仙 1 2, 冯丽杰 1 2
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黄曲霉素通过激活PI3K-Akt-mTOR通路抑制自噬抑制胶质瘤细胞增殖和致瘤性

陈华清等。 药物研究展望. 2023年2月.

摘要

胶质瘤是成人中最常见的侵袭性原发性脑肿瘤，发病率和死亡率都很高。快速增殖和弥散迁移是胶质瘤治疗成功的主要障碍。黄芩素是从鸡尾草中提取的倍半萜内酯，对多种恶性肿瘤具有显著的抗肿瘤作用。在本研究中，我们报道了黄原抑素以时间和浓度依赖性的方式抑制胶质瘤细胞增殖和诱导凋亡，并伴有自噬抑制，显示LC3点状荧光和LC3II/I比率显著降低，Beclin 1水平降低，p62积累增加。值得注意的是，用黄原抑素治疗胶质瘤细胞导致PI3K-Akt-mTOR信号通路明显激活，如mTOR和Akt磷酸化增加所示，ULK1磷酸化降低，这对调节自噬很重要。此外，自噬诱导剂（雷帕霉素或Torin1）或PI3K-mTOR抑制剂NVP-BEZ235可显著逆转黄原素介导的胶质瘤细胞凋亡。综上所述，这些发现表明，黄原抑素在胶质瘤中的抗增殖和促凋亡作用很可能是通过激活PI3K-Akt-mTOR通路来抑制自噬，这表明它是一种潜在的抗胶质瘤治疗策略。

关键词：自噬；胶质瘤；mTOR；致瘤性；黄嘌呤。

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数字

图1
图1
黄原酸抑制胶质瘤细胞的增殖和集落形成，但增加细胞凋亡。（A，B）SRB分析显示C6细胞在指定浓度下与黄原抑素孵育12小时后增殖 h（A）或黄嘌呤（10μM）用于不同时间段（B）。DMSO被用作车辆控制。TMZ（100 μM）作为阳性对照。（C） DAB染色的代表性图像显示用二甲基亚砜、黄原胶（10μM）或TMZ（100 μM）用于12 h.（D）左边的免疫印迹分析显示了C6细胞在存在或不存在黄嘌呤的情况下PCNA的蛋白水平。对，PCNA蛋白水平的定量分析。（E） 用二甲基亚砜、黄嘌呤（1、5、10μM）或TMZ（100）处理的C6细胞集落形成分析的代表性图像 μM）用于7 天。（F） 定量数据显示，黄嘌呤或TMZ处理可减少C6细胞的集落形成。（G） 左图，经二甲基亚砜、黄嘌呤（1、5、10、15）处理的C6细胞中PARP（c‐PARP）裂解形式的免疫印迹 μM）或TMZ（100 μM）用于12 h.正确，c‐PARP蛋白水平的定量分析。所有定量数据均表示为平均值 ± 至少3个独立实验的SEM。*第页 < .05,**第页 < .01,***对 < .001与对照。比例尺=50 微米。控制；Xn，黄原抑素。
图2
图2
黄原抑素抑制胶质瘤细胞中自噬体的形成。（A，B）C6细胞中针对自噬（LC3，p62，Beclin 1，ATG 5，ATG 7）和凋亡相关蛋白（裂解caspase‐3）的代表性免疫印迹，与指示浓度的黄原抑素孵育12小时 h（A）或10μM黄原抑素，达到指定的时间（B）。托林1（20 nM，6 h）用于诱导自噬，而bafilomycin A1（Baf A1，20 nM，6 h）用于抑制自噬。TMZ（100 μM）作为阳性对照。（C） A和B免疫反应性印迹的密度分析。（D，E）典型的共聚焦显微镜图像显示，经黄嘌呤（10μM）处理12小时的C6细胞中的LC3和P62免疫荧光 Baf A1（20）存在或不存在时的h nM）。方框区域的放大图像显示LC3点（红色）（D）和p62聚集（红色）。DAPI染色细胞核。（F） 这些图表示D和E中LC3和p62点的相对密度。所有定量数据均表示为平均值 ± 至少3个独立实验的SEM*第页 < .05, **第页 < .01, ***第页 < .001与对照。# 第页 < .05，与黄嘌呤组比较。比例尺=10μm。Xn、黄原胶。
图3
图3
黄原抑素通过PI3K/Akt/mTOR途径抑制胶质瘤中的自噬（A）免疫印迹显示，在与指定浓度的黄原抑素酶孵育12小时的C6细胞中，Akt、mTOR、ULK1、p38、ERK1/2和JNK的磷酸化蛋白水平 h（左）或10μM黄嘌呤不同时间（右）。P62水平被用作自噬抑制的指标。（B） 条形图表示对a（C）中免疫反应性印迹的密度分析。左边是用黄嘌呤（10，20，40）治疗的裸鼠异种移植瘤中指示蛋白的免疫印迹的代表性图像 mg/kg）或TMZ（5mg/kg）。右侧，左侧面板中p62、LC3、Beclin 1、磷酸化AKT、磷酸化mTOR、磷酸化ULK1、磷酸化p38、磷酸化ERK1/2和磷酸化JNK的定量分析。所有定量数据均表示为平均值 ± 至少3个独立实验的SEM*第页 < .05, **第页 < .01, ***第页 < .001与对照。缩写：Xn，黄色素。Con，控制。
图4
图4
自噬诱导可部分逆转黄嘌呤诱导的胶质瘤细胞死亡。（A） C6细胞中与自噬（Beclin 1，p62，LC3，phosphator‐mTOR）和细胞凋亡（裂解caspase‐3）有关的选定蛋白质的代表性免疫印迹图像，与10μM黄嘌呤孵育12 在存在或不存在自噬诱导物Rapa（10μM）或Torin1（20 nM）。GAPDH被用作负荷控制。（B） 通过斑点密度测定法测定p62、LC3、Beclin 1、p‐mTOR和裂解caspase‐3的相对密度。（C） SRB分析显示了用黄嘌呤（15）处理的C6细胞的活性 μM）、Rapa（10μM）或Torin1（20 nM），如12所示 h.（D）TUNEL染色用于显示用黄原胶处理的C6细胞的凋亡（15 μM）用于12 h、 有或没有Rapa（10μM），Torin1（20 nM）。（E） D中TUNEL阳性C6细胞的定量分析。所有定量数据均表示为平均值 ± 三个独立实验的SEM。*第页 < .05,**第页 < .01,***对 < .001与对照。 # 第页 < .05, ## 第页 < .01, ### 第页<。001，与黄嘌呤组比较。比例尺=50 微米。控制；Xn，黄原抑素。
图5
图5
PI3K和mTOR抑制剂NVP‐BEZ235联合使用可部分改善黄原抑素对胶质瘤细胞的抗增殖作用。（A） SRB分析显示，经黄嘌呤（10μM）、NVP‐BEZ235（250 μM），或黄嘌呤和NVP‐BEZ235的组合用于48 h.（B）显示NVP‐BEZ235协同效应的代表性图像（250 μM）和黄嘌呤（10μM）对C6细胞集落形成的影响，以及集落数量的量化(n个 = 3). （C） 用指示浓度的黄嘌呤和/或NVP‐BEZ235处理C6细胞12小时后的TUNEL染色 h.还展示了TUNEL阳性细胞的定量分析。（D） 免疫印迹结果显示，在与黄嘌呤（10μM）和/或NVP‐BEZ235（250 μM）用于12 h.条形图表示免疫反应斑点的密度分析。所有定量数据均表示为平均值 ± 至少3个独立实验的SEM。*第页 < .05,**对 < .01和***第页 < .001.比例尺=50 微米。缩写：Xn，黄色素。Con，控制。
图6
图6
黄原抑素通过抑制自噬抑制胶质瘤细胞增殖和致瘤性的示意图。Xanthatin激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，该通路通过失调Beclin 1和ATG对自噬体的形成发挥抑制作用。自噬诱导剂或双重PI3K和mTOR抑制剂诱导的自噬可部分改善黄嘌呤的抗肿瘤作用。PAS，自噬前体结构。
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