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.2016年6月15日；35(12):1276-97.
doi:10.15252/embj.201593350。 Epub 2016年4月21日。

C9ORF72缺失会损害自噬，并与polyQ共济失调蛋白-2协同诱导运动神经元功能障碍和细胞死亡

Chantal Sellier公司 1, 玛丽亚·莱蒂齐亚·坎帕纳里 2, 卡米尔·朱莉·科尔比尔 三, 安吉琳·高切罗 三, 伊莎贝尔·科尔布·切内尔 三, 穆斯塔法·乌拉德·巴德尔加尼 三, 弗兰克·拉夫纳赫（Frank Ruffenach） 三, 阿德琳页面 三, 索拉娜·库拉 2, 江户卡巴什 2, 尼古拉斯·查利特·贝盖兰（Nicolas Charlet-Berguerand） 1
附属公司

C9ORF72缺失会损害自噬，并与polyQ共济失调蛋白-2协同诱导运动神经元功能障碍和细胞死亡

Chantal Sellier公司等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

C9ORF72基因内GGGCC重复序列的内含子扩增是肌萎缩侧索硬化和额颞叶痴呆（ALS-FTD）最常见的遗传原因。具有中等长度聚谷氨酰胺扩增的共济失调-2（共济失调2 Q30x）是该病的遗传修饰物。这里，我们发现C9ORF72与WDR41和SMCR8蛋白形成复合物，作为RAB8a和RAB39b的GDP/GTP交换因子，从而控制自噬流量。神经元中C9orf72的耗竭部分损害自噬并导致TDP-43和P62蛋白聚集体的积累，这是ALS-FTD的组织病理学特征SMCR8被TBK1磷酸化，TBK1的耗竭可以通过SMCR8的磷酸化突变体或组成活性RAB39b来挽救，这表明TBK1、SMCR8、，C9ORF72和RAB39b属于调节自噬的共同途径。虽然C9ORF72的缺失仅对神经元存活产生部分有害影响，但它与共济失调-2 Q30x毒性协同作用，导致运动神经元功能障碍和神经元细胞死亡。这些结果表明，C9ORF72功能的部分丧失本身并不是有害的，而是与Ataxin-2毒性协同作用，提示ALS-FTD的双重病理机制。

关键词：ALS‐FTD；c9或f72；自噬；神经变性。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。C9级无线电频率72与表面活性剂8和西部数据报告41是一个全球环境基金对于受监资产基础8和受监资产基础39

  1. 对从表达Flag‐HA标记的C9ORF72的N2A小鼠神经元细胞提取的蛋白质进行银染，并通过连续的反Flag和反HA亲和纯化步骤进行捕获。

  2. HA免疫沉淀蛋白和HEK293细胞裂解产物的免疫印迹分析，共表达HA标记的C9ORF72和/或标记的SMCR8和/或WDR41。

  3. 在杆状病毒感染的昆虫细胞中共表达的HIS‐C9ORF72、SMCR8和WDR41的镍-NTA亲和纯化考马斯蓝染色。

  4. HA免疫沉淀蛋白和HEK293细胞裂解物的免疫印迹分析，共表达HA标记的C9ORF72和HA标记的SMCR8与各种标记的Rab GTPases。

  5. 对照组内源性C9orf72、Wdr41、Rab8a、Rab39b、Rab5和Rab7的免疫印迹（仅IgG）或成年小鼠脑内内源性Smcr8免疫沉淀。

  6. α‐32GST标记的纯化RAB8a的放射性标记GDP释放是重组纯化C9ORF72单独或与SMCR8和WDR41复合物浓度增加的函数。

  7. 与（F）中相同的GDP释放试验，但使用重组纯化GST标记的RAB39b代替RAB8a。

  8. C9ORF72复合物作为Rab‐鸟嘌呤核苷酸交换因子的示意图。

数据信息：误差条表示SEM。实验重复3次(n个 = 3). 此数字的源数据可在线获取。
图EV1
图EV1。与C9相互作用的蛋白质的验证ORF公司72

  1. 蛋白质组分析发现内源性蛋白质的免疫印迹分析与N2A细胞中表达的对照或标记有Flag‐HA的C9ORF72相关。

  2. HA免疫沉淀蛋白和HEK293细胞裂解产物的免疫印迹分析，共表达HA标记的C9ORF72的长或短剪接变体与标记的SMCR8和WDR41。

  3. 共表达HA标记的C9ORF72和/或HA标记的SMCR8和/或HA标记的WDR41与Flag标记的HSC70的HEK293细胞的HA免疫沉淀蛋白和裂解物的免疫印迹分析。

  4. 左面板，HA免疫沉淀蛋白和HEK293细胞裂解物的免疫印迹分析，共表达HA标记的C9ORF72、HA标记的SMCR8或HA标记的WDR41与Flag标记的RAB8A。右面板，HA免疫沉淀蛋白和HEK293细胞裂解物的免疫印迹分析，共表达HA标记的C9ORF72、HA标记的SMCR8或HA标记的WDR41与Flag标记的RAB39b。

  5. HA免疫沉淀蛋白和HEK293细胞裂解产物的免疫印迹分析，这些细胞共表达HA标记的SMCR8和各种标记的Rab GTPase。

  6. Smcr8、Rab8a、Rab39b和Gapdh在小鼠成体组织和E18小鼠皮层神经元原代培养中内源性表达的免疫印迹分析。

  7. 32GST标记的纯化RAB8a、RAB39b、RAB29（也称为RAB7L1）和RAB32的放射性标记GDP释放，作为从杆状病毒感染昆虫细胞纯化的重组纯化HIS‐C9ORF72:SMCR8:WDR41复合物浓度增加的函数。误差条表示SEM，N个=3。

图EV2
图EV2。C9ORF72表达减少部分损害自噬

  1. HA免疫沉淀蛋白和HEK293细胞裂解产物的免疫印迹分析，共表达HA标记的C9ORF72、HA标记的SMCR8或HA标记的WDR41和Flag标记的P62。

  2. HA标记的C9ORF72、HA标记的SMCR8或HA标记的WDR41与标记的OPTN共表达的HEK293细胞的HA免疫沉淀蛋白和裂解物的免疫印迹分析。

  3. HA免疫沉淀蛋白和HEK293细胞裂解产物的免疫印迹分析，这些细胞共表达HA标记的RAB8a或HA标记的带有Flag标记P62的RAB39b。

  4. 与GFP‐RFP‐LC3B共转染的小鼠GT1‐7神经元细胞的代表性图像，控制siRNA或靶向内源性siRNAC9或72mRNA和Torin治疗或不治疗。

  5. 上面板，内源性LC3B（Map1lc3b）、C9orf72的免疫印迹分析，以及用对照siRNA或siRNA靶向转染的GT1‐7神经元细胞的Gapdh和actinC9或72mRNA和Torin和/或bafilomycin A处理或不处理。下面板，实时RT-qPCR定量内源性C9或72mRNA表达与卢比0mRNA。

  6. 左图为转染对照siRNA或靶向siRNA的GT1‐7神经细胞内源性P62（Sqstm1）的免疫荧光标记的代表性图像C9或72,Smcr8型，或第41周mRNA。右侧面板，P62骨料的量化。

  7. 左图为转染构建物（绿色）和内源性P62（Sqstm1，红色）的免疫荧光标记在转染对照siRNA或siRNA靶向的GT1‐7神经元细胞上的代表性合并图像C9或72以及表达对照GFP或HA标记的C9ORF72长或短亚型的质粒。右侧面板，P62骨料的量化。

数据信息：比例尺，10μm。用DAPI对细胞核进行复染。误差条表示SEM。学生的t吨测试***P（P） < 0.001,n个 = 3.
图2
图2。C9的减少表达ORF公司72部分损害自噬

  1. 左图为转染GFP‐RFP‐LC3B并转染表达对照shRNA或靶向shRNA的慢病毒的E18小鼠皮层神经元器官型培养的代表性图像C9或72mRNA和是否用托林处理。右图，LC3B点状物的定量。

  2. 上面板，内源性LC3B（Map1lc3b）、C9orf72和用表达控制shRNA或靶向shRNA的慢病毒转导的E18小鼠皮层神经元的控制肌动蛋白的免疫印迹分析C9或72mRNA和Torin处理或不处理。下面板，实时RT-qPCR定量内源性C9或72mRNA表达与卢比0mRNA。

  3. 左面板，内源性P62（Sqstm1）在E18小鼠皮层神经元器官型培养物上的免疫荧光标记的代表性图像，用表达对照shRNA或靶向shRNA的慢病毒颗粒转导C9或72右侧面板，P62骨料的量化。

  4. 左面板，转染siRNA靶向转染GT1‐7神经元细胞的转染构建物（绿色）和内源性P62（Sqstm1，红色）的免疫荧光标记的代表性图像C9或72以及表达对照GFP和HA标记的野生型或突变型RAB39b（CA、Q68L或CN、S22N）、RAB8a或RAB7的质粒。右侧面板，P62骨料的量化。

数据信息：比例尺，10μm。用DAPI对细胞核进行复染。误差条表示SEM。学生的t吨‐测试*P（P） < 0.05, ***P（P） < 0.001,n个 = 3. 此数字的源数据可在线获取。
图3
图3。表面活性剂8被磷酸化TBK（待定）1

  1. 共同表达HA标记C9ORF72和HA标记SMCR8的HEK293细胞的HA免疫沉淀蛋白和裂解物的免疫印迹分析，以及标记TBK1、NAP1、TANK或SINTBAD的标志物。

  2. HEK293中表达的免疫沉淀HA标记的C9ORF72、HA标记的SMCR8和HA标记的WDR41受到在体外γ‐存在下的TBK1激酶测定32P-放射性标记的ATP。蛋白质通过SDS-PAGE迁移分离，通过放射自显影术检测磷酸化（上面板），而通过Western blotting检测表达（下面板）。

  3. 质谱法鉴定SMCR8磷酸化位点在体外HIS标记的C9ORF72:SMCR8:WDR41复合物的TBK1激酶检测从杆状病毒感染的昆虫细胞中纯化。

  4. 上面板，转染构建物（绿色）和内源性P62（Sqstm1，红色）的免疫荧光标记的代表性图像，在转染了靶向3′UTR的siRNA的GT1‐7神经元细胞上Smcr8型表达对照GFP和HA标记的野生型或突变型SMCR8（TA、S402A和T796A；TD、S402D和T796 D；UD、S400D、S492D、S562D和T666D）的mRNA和质粒。下部面板，P62骨料的量化。

  5. 上面板，转染siRNA靶向转染GT1‐7神经元细胞的转染构建物（绿色）和内源性P62（Sqstm1，红色）的免疫荧光标记的代表性图像Tbk1型以及表达对照GFP和HA标记的野生型或突变型SMCR8或RAB39b的质粒。下部面板，P62骨料的量化。

数据信息：比例尺，10μm。用DAPI对细胞核进行复染。误差条表示SEM。学生的t吨‐测试*P（P） < 0.05, ***P（P） < 0.001,n个 = 3. 此数字的源数据可在线获取。
图EV3
图EV3。SMCR8被ULK1磷酸化

  1. 转染对照siRNA或靶向3′UTR的siRNA的GT1‐7细胞内源性Smcr8或Gapdh的免疫印迹分析Smcr8型.

  2. 转染对照siRNA或靶向siRNA的GT1‐7细胞内源性Tbk1或Gapdh的免疫印迹分析Tbk1型.

  3. 共同表达HA标记C9ORF72和/或HA标记SMCR8和/或带有Flag标记ULK1的HA标记WDR41的HEK293细胞的HA免疫沉淀蛋白和裂解物的免疫印迹分析。

  4. HA标记的C9ORF72、HA标记的SMCR8和HA标记的WDR41在HEK293中共同表达，免疫沉淀在体外γ‐存在下的ULK1激酶测定32P‐放射性标记ATP。通过SDS-PAGE凝胶上的迁移分离蛋白质，并通过放射自显影术检测磷酸化（上图），而通过Western blotting检测表达（下图）。

  5. 重组HIS标记的C9ORF72:SMCR8:WDR41复合物从杆状病毒感染的昆虫细胞中纯化后磷酸化在体外通过质谱鉴定ULK1和SMCR8磷酸化位点。

  6. 上面板，用对照siRNA或siRNA靶向转染的GT1‐7神经元细胞上内源性P62（Sqstm1，红色）免疫荧光标记的代表性图像Tbk1型或乌尔克1和Ulk2公司下面板，P62骨料的量化。

数据信息：误差条表示SEM，n个 = 3. 比例尺，10μm。细胞核用DAPI复染。
图4
图4。C9的减少表达ORF公司72促进了技术开发计划‐43

  1. 用表达对照shRNA或靶向shRNA的慢病毒转导的E18小鼠皮层神经元内源性Tdp‐43、C9orf72和对照Gapdh的免疫印迹分析C9或72mRNA。

  2. 左面板，内源性磷酸化Ser409/410‐Tdp‐43在E18小鼠皮层神经元原代培养物上的免疫荧光标记的代表性图像，用表达对照shRNA或shRNA靶向的慢病毒颗粒转导C9或72右面板，细胞质Tdp‐43聚集体的量化。

  3. 左面板，D169G突变GFP标记TDP‐43在转染HA标记对照或HA‐C9ORF72质粒的E18小鼠皮层神经元原代培养物上的免疫荧光标记的代表性图像。右侧面板，含TDP‐43细胞质聚集物的细胞定量。

数据信息：比例尺，10μm。用DAPI对细胞核进行复染。误差条表示SEM。学生的t吨‐测试***P（P） < 0.001,n个 = 3. 此数字的源数据可在线获取。
图EV4
图EV4。C9ORF72的减少表达促进TDP‐43的聚集
上面板，转染siRNA靶向转染GT1‐7神经元细胞的转染构建物（绿色）和内源性P62（Sqstm1，红色）的免疫荧光标记的代表性图像Tardbp公司以及表达对照GFP和HA标记的C9ORF72或野生型或突变型RAB8a或RAB39b的质粒。下部面板，P62骨料的量化。误差条表示SEM，n个 = 3.
图5
图5。C9的减少表达ORF公司72协同Ataxin‐2毒性
  1. A类

    左面板，共转染HA标记的E18小鼠皮层神经元器官型培养的代表性图像ATXN2型带有对照（Q22x）或中间（Q30x）polyQ大小，并用表达对照shRNA或shRNA靶向的慢病毒转导C9或72mRNA。右侧面板，Ataxin‐2聚集体的量化。比例尺，10μm。用DAPI对细胞核进行复染。

  2. B类

    与HA标记基因共转染的GT1‐7神经元细胞的细胞活力（四氮唑分析）ATXN2型带有控制（Q22x）或中间（Q30x）polyQ大小并控制siRNA或siRNA靶向C9或72mRNA。误差条表示SEM，n个 = 3.

  3. C类

    轻触斑马鱼受精后48小时幼体游泳轨迹的追踪。

  4. D–F型

    触摸诱发游泳距离（D）、平均速度（E）和达到的最大速度（F）的量化显示注射HA标记的斑马鱼的功能严重受损ATXN2型具有polyQ（Q30x）和反义吗啉寡核苷酸（AMO）的中间长度C9或72与对照组相比，HA标记ATXN2型（Q22x）或针对C9或72.

  5. G公司

    用抗-Sv2免疫组化显示的运动神经元的代表性图像显示，注射这两种药物的鱼出现严重的轴突病变ATXN2型Q30x和AMO对比C9或72与注射对照药物的斑马鱼相比ATXN2型Q22x或AMOC9或72独自一人。

  6. H（H）

    运动神经元轴突长度的量化表明，受精后48小时注射这两种药物的斑马鱼幼虫的轴突长度显著减少ATXN2型Q30x和AMO对比C9或72与对照组相比。

数据信息：误差条表示SEM。学生的t吨‐测试***P（P）<0.001（A、B）或单向方差分析**P（P）<0.01（D–F，H），n个 = 3.
图EV5
图EV5。C9ORF72表达减少可协同Ataxin-2毒性
  1. A类

    HA标记的GT1‐7神经细胞共转染的代表性图像ATXN2型控制（Q22x）或中间（Q30x）polyQ大小，并控制siRNA或靶向内源性siRNAC9或72mRNA。

  2. B、 C类

    内源性Gapdh或转染HA标记的Ataxin‐2的免疫印迹分析，带有GT1‐7细胞中polyQ的（B）对照（Q22x）长度或（C）中间（Q30x）长度。

  3. D类

    与GFP标记的突变SOD1、FUS、HTT或Ataxin‐3共转染的GT1‐7神经元细胞的代表性图像，并控制靶向内源性siRNA或siRNAC9或72mRNA。

  4. E类

    RT-qPCR定量内源性C9或72表达式相对于Gapdh公司mRNA不匹配或C9或72注射反义吗啉寡核苷酸（AMO）的斑马鱼。

  5. F类

    RT–qPCR定量外源HA标记ATXN2型polyQ相对于内源性的正常长度（Q22x）或中间长度（Q30x）Gapdh公司斑马鱼中注射对照或HA标记的ATXN2构建物以及与之匹配的AMO或AMO的mRNAC9或72.

  6. G公司

    轻触斑马鱼受精后48小时幼体游泳轨迹的追踪。

  7. H–J型

    量化触觉诱发游泳距离（H）、平均速度（I）和达到的最大速度（J）表明，单次注射HA标记物后没有损害ATXN2型带有控制（Q22x）或polyQ的中间长度（Q30x）。同样，注射不匹配的反义吗啉寡核苷酸（AMO）C9或72单独或带有HA标签ATXN2型Q22x或Q30x未显示功能改变。

数据信息：比例尺，10μm。用DAPI对细胞核进行复染。误差条指示SEM，n个 = 3.
图6
图6。C9的暂定模型ORF公司72功能

  1. C9ORF72与SMCR8和WDR41复合体作为RAB39b GTPase的GDP/GTP交换因子，与P62自噬受体相互作用。TBK1对SMCR8的磷酸化可能促进C9ORF72 GEF活性，并增强具有中间polyQ大小的蛋白质如TDP-43或Ataxin‐2的自噬周转。在缺乏C9ORF72的情况下，这些蛋白质的自噬清除率降低，具有中等长度polyQ的TDP‐43、P62或Ataxin‐2积累到细胞质聚集体中。

  2. 自噬受体（如P62或OPTN）作为中枢，将Rab GTPase与其GEF效应器和激酶调节器聚集在一起，在受损细胞器、蛋白质聚集体或细胞内病原体的位置准确启动自噬。

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参考文献

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