美国生理学杂志肾生理学。2021年1月1日；320（1）：F87–F96。
肾保护作用状态1小鼠马兜铃酸肾病的缺失
，1中，* ，1中，* ，1 ，1和
1中，2,三 李兴生
2阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学细胞、发育和综合生物学系
丽莎·柯蒂斯
2阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学细胞、发育和综合生物学系
保罗·W·桑德斯
1阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学医学系肾脏科
2阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学细胞、发育和综合生物学系
三阿拉巴马州伯明翰退伍军人事务部医疗中心
1阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学医学系肾脏科
2阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学细胞、发育和综合生物学系
三阿拉巴马州伯明翰退伍军人事务部医疗中心
通讯作者。 *冯小伟和应振英对这项工作做出了同样的贡献。
2020年7月30日收到；2020年11月30日修订；2020年12月1日验收。
关键词：马兜铃酸、慢性肾脏疾病、整合素、肾纤维化、转化生长因子-β
摘要
受损的肾小管上皮刺激纤维化前环境，加速慢性肾脏病（CKD）患者的功能丧失。本研究检测信号转导子和转录激活子1（STAT1）在CKD模型马兜铃酸（AA）肾病肾功能进行性丧失中的作用。AA治疗的野生型（WT）同卵双胞胎的平均血清肌酐浓度增加，而状态1−/−小鼠受到保护。经AA治疗的WT小鼠近端小管中观察到肾损伤分子（KIM）-1顶端表达的局部增加，但在状态1−/−治疗组和两个对照组的小鼠。复合损伤评分是近端小管损伤的指标，在状态1−/−AA治疗小鼠。整合素-β表达增加6AA处理后，WT小鼠近端小管中的磷酸化Smad2/3以及间质胶原和纤维连接蛋白被观察到，但在AA处理后的WT小鼠中均被降低状态1−/−老鼠。数据表明，STAT1激活促进了AA肾病进展性肾损伤和间质纤维化的发展。
引言
慢性肾脏病（CKD）是一个严重的公共卫生问题，约占美国人口的14%（约4000万）(1)是美国第九大死因(2). 作为疾病负担的一个指标，CKD患者和需要肾脏替代治疗的患者的年度医疗保险总支出已超过1200亿美元，几乎占医疗保险总费用的34%(三). 认识到预防和治疗肾脏疾病的需求尚未得到满足，本研究重点关注肾小管萎缩和相关纤维化的机制，无论其潜在的疾病过程如何，这些都是CKD的不变发现(4)。
越来越多的研究工作认为，近端小管上皮细胞的损伤是导致CKD肾功能进行性丧失的纤维生成环境发展的近因(5——8). 一个潜在的焦点是信号转导子和转录激活子（STAT）家族，该家族由七种众所周知的转录调控蛋白组成，控制多种细胞过程。尽管序列同源，STAT蛋白指导不同的细胞因子/生长因子反应，并且不可互换(9——11). STAT1是干扰素-γ（IFNγ）和Toll样受体4（TLR4）炎症途径的重要介导者(12)在近端小管上皮中表达，可能被氧化应激激活(13，14). 对人类肾脏中年龄相关转录变化的检测表明，老化肾脏中的炎症与STAT1以及其他两种转录因子NF-κB和STAT3的表达增加有关(15). 在免疫球蛋白游离轻链（FLC）的代谢过程中，活性氧损伤近端小管上皮并激活STAT1。STAT1是一种精液信号分子，通过体内肾单位的这一部分和相关的肾小管间质纤维化产生促纤维化剂转化生长因子-β（TGF-β）(14). 因此，本研究旨在验证STAT1加重另一种CKD模型马兜铃酸（AA）肾病肾功能丧失的假设。
方法
动物和组织准备
杂合繁殖对状态1+/−小鼠取自B6.129S（Cg）衍生的小鼠群体-状态1tm1阀/已回交至少五代至C57BL/6J遗传背景的J小鼠（库存编号012606，Jackson实验室）。具有纯合缺失的小鼠的结肠状态1（称为状态1−/−小鼠）和窝友对照组（称为斯达+/+小鼠）通过杂交杂合子建立状态1+/−小鼠，使用先前描述的基于PCR的策略进行基因分型(14). 在整个研究过程中，菌落被保存在生菌设施中。所有动物研究均包括斯达+/+和状态1−/−使用动物生物安全三级实验室和装有高效微粒空气过滤器的Sealsafe笼子对小鼠和小鼠进行试验，工作人员穿戴个人防护装备。状态1−/−在这些条件下，小鼠生长正常，表型正常。
流行病学证据表明，与男性患者相比，女性患者AA肾病的临床进展较慢，随后对小鼠的研究证实了17β-雌二醇对AA肾病的肾脏保护作用(16). 虽然对AA有抵抗力，但雌性小鼠也会出现肾小管损伤和间质纤维化(17). 我们遵循了Gewin团队描述的协议(18)对雄性小鼠的研究有限。八岁男性状态1+/+和状态1−/−老鼠(n个=8–10/组）。为了制作CKD模型，马兜铃酸I（AA；A9451-50MG，密苏里州圣路易斯MilliporeSigma）溶解在磷酸盐缓冲盐水（PBS；Invitrogen，Carlsbad，CA）中。每天给动物腹腔注射这种溶液（2 PBS中的mg/kg体重、10ml/kg体重）或载体（PBS）第0天到4，于被安乐死第40天。尾静脉血液样本于第0天，5、和40监测血清肌酐浓度()。
实验方案的时间表和马兜铃酸（AA）治疗对血清肌酐浓度的影响。一个：在首次采集尾静脉血液后，状态1−/−和同窝野生型小鼠每天腹腔注射2 mg/kg AA或载体，持续5天。血又被吸上来了第5天研究结束时第40天当动物被安乐死并采集组织进行分析时。B类：每天注射AA后第5天研究表明，与车辆处理的小鼠相比，血清肌酐更高[F类(1, 22) = 10.92,P（P）=0.0032]在AA处理组中；STAT1和AA之间的相互作用测试不显著。签署人第40天，AA处理野生型小鼠组的平均血清肌酐浓度更高(*P（P）<0.0001）高于其他三组的平均肌酐水平；STAT1和AA之间的相互作用也很显著[F类(1, 35) = 28.67,P（P）< 0.0001].n个 = 每组8-12只动物。Bld，静脉切开术；STAT1、信号转导子和转录激活子1；WT，野生型。采用双向方差分析和Tukey多重比较检验。
实验结束时，用异氟醚麻醉小鼠，并在肾脏切除后实施安乐死。横切肾脏，将切片固定在10%中性缓冲福尔马林（分类号SF100-4，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）中过夜，并加工成石蜡包埋块。肾组织样品也在4°C的PBS中的4%多聚甲醛中固定过夜，并在4℃的20%蔗糖溶液中冷冻保存过夜，然后埋入tissue-Tek最佳切割温度复合物（Sakura Finetek）中。新鲜肾组织也在液氮中快速冷冻以进行Western blotting，并在RNALater缓冲液（类别号AM7020，Invitrogen，Thermo Fisher Scientific）中进行实时RT-PCR分析。UAB-UCSD George M.O'Brien肾脏和泌尿研究中心使用液相色谱-串联质谱法（Waters 2795 LC-MS/MS，Waters Corporation，Milford，MA）测定血清肌酐。
肾组织损伤、纤维化及免疫荧光显微镜分析
UAB比较病理实验室对埋藏的肾组织进行3µm厚的切片，并使用苏木精和伊红（H&E）进行染色。用光学显微镜（DMI6000 B型，莱卡，布法罗格罗夫，IL）在×40倍放大率下对染色切片进行成像和分析。形态学分析由一个盲法观察者使用每只动物的六到八张H&E染色切片图像进行。对每个高功率场（HPF）的细胞内固缩细胞核的数量进行定量。刷状边界的丢失和管型的出现，无论是蛋白性的还是细胞性的，都是以每HPF的小管横截面数来评估的。通过对三个损伤标记进行求和，得出复合损伤分数。为了量化肾小管间质纤维化，使用试剂盒（目录号IW-3012，NovaUltra Picro-Sirius红色染色试剂盒，IHC World，Woodstock，MD）用苦味酸红对3-µm厚的切片进行染色。用偏光显微镜（Leica）在×40倍放大率下对染色切片进行成像和分析。使用ImageJ（v.1.51，NIH）对每张图像的染色面积进行量化。
肾脏石蜡切片使用试剂盒（加利福尼亚州伯灵盖姆Vector Laboratories，目录号H-3300）进行标准抗原提取。切片中的非特异性染色通过将2%的正常马或山羊血清在PBS中孵育1小时来阻断 h、 然后在4°C下与特定初级抗体孵育过夜。抗体包括兔抗磷酸化（p-）Stat1（Tyr701)（编号9167S，Cell Signaling Technology，Danvers，MA）、兔抗Smad3（编号9523S，Cell-Signaling Technical）、鼠抗TIM-1/KIM-1/HAVCR（AF1817，R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州）、兔防p-Smad2（S465/467；编号18338，Cell信号技术）和兔抗整合素亚基β6（ITGB6）（ab233519，马萨诸塞州剑桥市）。使用安装介质中的DAPI标签对Nuclei进行鉴定（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories VectaShield的类别号H-1500）。每个实验的阴性对照包括用相应物种的IgG染色（Vector Laboratories的分类号I-1000，批号X0112，分类号I-5000，批号X0404，以及加利福尼亚州圣何塞BD PharMinen的分类号559478），无一级抗体。使用Vector TrueVIEW（SP-8400，Vector Laboratories）减少自体荧光。四棱莲花凝集素（LTL；FL-1321，Vector Laboratories，Burlingame，CA）用于识别皮质和外髓质中的近端小管。用于组织免疫荧光实验的二级抗体包括Alexa Fluor 594山羊抗兔（分类号A11072）、Alexa Fluor 488山羊抗兔（分类号A11070）和Alexa Fluor 594驴抗大鼠（分类号A21209），均来自马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔。染色切片通过荧光显微镜观察（型号BZ-X800，Keyence，Itasca，IL）。
mRNA表达的实时RT-PCR分析
用TRIzol（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）从肾皮质提取总RNA，并用DNAase I处理以去除基因组DNA，然后使用RNA纯化试剂盒（Cat.No.12183025，Invitrogen，Thermal Fisher科学）纯化。使用SuperScript IV RT Kit（目录号18091050，Invitrogen，Thermo Fisher Scientific）将不含DNA的RNA反向转录到cDNA。用SYBR Green PCR在LightCycler 480系统（印第安纳波利斯罗氏诊断公司）和特异性引物中扩增cDNA()40个循环。根据LightCycler 480软件生成的阈值周期计算稳态mRNA水平。每个mRNA的表达按照GAPDH标准化。
Western Blot分析
组织裂解物使用含有10 mM Tris·HCl，pH 7.4，100 毫米氯化钠，1 mM乙二胺四乙酸二乙酯，1 mM EGTA、0.5%脱氧胆酸钠、1%Triton X-100、10%甘油、0.1%十二烷基硫酸钠、20 mM焦磷酸钠，2 mM钠三VO（旁白）4, 1 mM氟化钠，1 mM PMSF和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（编号1861284，Thermo Scientific，Rockford，IL）。使用BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific Pierce protein Research Products，Rockford，IL）测定总蛋白质浓度。蛋白质提取物（20–60 µg）煮沸3次 在将电泳转移到Immobilon-FL膜（编号：IPFL00010，Millipore，Temecula，CA）上之前，在Laemmli缓冲液中放置min，并用7–12%的SDS-PAGE（加州Hercules Bio-Rad实验室）分离。在5%脱脂牛奶中封闭细胞膜，然后用抗体（稀释比例为1:1000）单独检测，该抗体可特异识别STAT1（编号9172S）和p-STAT1465/467和Ser423/425)（D27F4）（细胞信号技术）、ITGB6（ab233519）、纤维连接蛋白（ab2413）和GAPDH（ab8245，Abcam）。清洗后，将斑点培养1 用Alexa Fluor 680-或790-共轭AffiniPure二级抗体（1:10000稀释）在室温下放置h。使用Odyssey红外成像系统（Lincoln的Li-Cor Biosciences，NE）检测色带，并使用Image Studio软件（Lincolon的Li-Cor Biosciens，NE的Lincoln）进行密度测定。
统计
所有数据均表示为平均值±标准偏差。对于多组比较，使用Prism v.8.4.3进行单向方差分析（ANOVA）或双向方差分析，然后进行Tukey的多重比较测试。双向方差分析（Two-way ANOVA）确定两个因素如何影响反应，将结果变量的总体方差分为三个分量，外加一个残差（或误差）项。它计算出P（P）检验三个零假设的值：一种交互作用P（P）无效假设的值，即两个因素对响应没有交互作用，以及P（P）每个因素对反应没有影响的零假设值。P（P）值和关联的F类数字中提供了统计数据，并在适当的情况下通过后续的事后测试证明了其重要性。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
研究批准
这项研究是严格按照实验动物护理和使用指南美国国立卫生研究院。阿拉巴马大学伯明翰分校动物保护和使用委员会批准了该项目。
结果
STAT1参与CKD肾脏损伤和肾功能丧失
发件人第0天到第40天、同窝对照的平均血清肌酐浓度(状态1+/+)AA治疗的小鼠从0.076增加了八倍 ± 0.006至0.608 ± 0.109 mg/dL，且更大(P（P）<0.0001）高于其他三组的平均肌酐水平第40天(). STAT1和AA之间的相互作用也很显著[F类(1, 35) = 28.67,P（P）<0.0001]时第40天相反，从第0天到第40天，平均血清肌酐浓度（0.098 ± 0.004与0.121 ± 0.004 mg/dL；P（P）=0.975）在12个AA-治疗组中没有变化状态1−/−老鼠。
Ichimura等人(19)表明肾损伤分子（KIM）-1在正常肾脏中几乎不表达，但在损伤的近曲小管中增殖、去分化细胞中显著增加。在近端小管中观察到KIM-1顶端表达的局部增加，通过染色四棱莲花凝集素（LTL，绿色荧光）状态1+/+治疗组小鼠() (20). 相反，KIM-1在其他三个组中没有表达，包括状态1−/−AA处理组和同窝对照组的小鼠以及状态1−/−载体处理组中的小鼠。随着KIM-1的表达，状态1+/+接受AA治疗的小鼠也表现出肾小管损伤的局部区域扩张、管腔碎片和刷状缘丢失(). 如前所述(14)，一名盲法观察者在苏木精和伊红（H&E）染色的肾切片中量化了小管上皮细胞损伤(n个=每组6-8只动物），根据皮质切片中的致密核数量、刷状缘丢失和蛋白质/细胞铸型生成复合损伤分数。研究期结束时状态1+/+AA治疗的小鼠表现出比相应对照组的肾脏更高的平均复合损伤分数状态1+/+和状态1−/−老鼠。平均复合伤害分数状态1+/+AA-治疗组的小鼠也高于相应治疗组的复合损伤分数状态1−/−老鼠()。
在AA处理的野生型小鼠的近端小管中，KIM-1的顶端表达局部增加。KIM-1在正常肾脏中的表达较低，但在再生的近端上皮细胞中表达增加(17). 在CKD模型中，KIM-1（红色荧光）增加，通常与四棱莲花凝集素（LTL，绿色荧光），特别是在AA处理的野生型同卵双胞胎中。细胞核用DAPI（蓝色荧光）进行复染。偶尔在LTL染色较低或无LTL染色的小管中发现KIM-1，可能是因为LTL与分化的近端小管刷状缘结合(25). 其他组（包括AA-处理组）的组织切片中没有KIM-1表达状态1−/−老鼠(右下角)和车辆处理状态1−/−和同窝对照小鼠(顶部). 白色条=50 微米。AA，马兜铃酸；慢性肾病；KIM-1，肾损伤分子-1；信号转导子和转录激活子1。
在研究组小鼠中观察到的组织学变化。一个：接受AA的同窝对照小鼠也表现出局部损伤区域，伴有肾小管扩张、管腔碎片和刷状缘缺失(左下角). 这些变化在给药组中并不显著(顶部)和经AA-处理的状态1−/−老鼠(右下角). 黄色条=100 微米。B类：H&E染色肾组织的盲法分析(n个 = 每组6-8只动物）产生复合损伤评分，反映损伤标记物增加所显示的近端肾小管细胞损伤：凋亡小体或固缩核、刷状缘断裂或上皮屏障断裂，或肾小管腔内存在细胞铸型。肾脏状态1+/+AA治疗的小鼠表现出比相应对照组的肾脏更高的平均复合损伤分数状态1+/+和状态1−/−老鼠。综合伤害评分状态1+/+AA-治疗组的小鼠的复合损伤评分也高于相应AA-处理组的复合损伤分数状态1−/−老鼠。STAT1和AA之间的相互作用也很显著[F类(1, 24) = 6.662，P（P）= 0.0164]. *P（P）= 0.0139; ***P（P）<0.0003（双向方差分析与Tukey多重比较试验）。AA，马兜铃酸；H&E、苏木精和曙红；信号转导子和转录激活子1。
STAT1促进间质基质蛋白沉积
AA对野生型小鼠的治疗促进了p-STAT1（Tyr701)与接受溶媒或假药物治疗的野生型小鼠的肾裂解物进行比较(). 免疫荧光显微镜显示，AA处理的野生型小鼠LTL阳性小管中STAT1激活。正如预期，状态1−/−小鼠未表达p-STAT1（Tyr701)或STAT1(). 因为我们之前的研究显示整合素β的关键功能6STAT1激活期间TGF-β活性的调节(14)，对肾皮质的裂解物进行Western分析，也显示整合素-β的表达增加6在AA处理的野生型小鼠中(). 与蛋白质印迹分析一致，免疫荧光显微镜发现整合素-β线性表达6特别是在治疗组野生型小鼠的近端小管中()。
在AA处理的野生型小鼠肾皮质中STAT1被激活。一个：肾皮质裂解物的Western blot分析证实了STAT1在状态1−/−老鼠。实验治疗促进了野生型小鼠p-STAT1（Y701）的增加。STAT1的存在与实验治疗之间的相互作用也很显著[F类（1，12） = 46.30,P（P）< 0.0001). *P（P）<0.0001，与其他三组相比#P（P）<0.001，与以下两组相比状态1−/−每个实验中的小鼠(n个 = 每组4只；双向方差分析（使用Tukey的多重比较测试）。B类：与Western blot分析一致，免疫荧光图像（右图）明确检测到近端小管细胞质和细胞核（黄色箭头）中存在p-STAT1（Y701；红色荧光），并用LTL（绿色荧光）标记，以及用AA处理的野生型小鼠间质细胞(左下角). 在包括载体治疗组的组织切片中未观察到近端小管中存在p-STAT1（Y701）状态1−/−小鼠和AA-处理状态1−/−老鼠(正确的)在车辆处理的同窝对照小鼠中稀疏存在(左上角). 细胞核用DAPI（蓝色荧光）进行复染。白色条代表20 微米。AA，马兜铃酸；长期贷款，四棱莲花凝集素；信号转导子和转录激活子1。
AA处理野生型小鼠肾皮质中整合素β6增加。一个：肾皮质裂解物的西方分析显示，AA治疗后野生型小鼠的整合素β6表达增加。STAT1的存在与实验治疗之间的相互作用也很显著[F类（1，12） = 16.51,P（P）= 0.0016]. *P（P）<0.0001，与其他三组相比(n个 = 每组4只；双向方差分析（使用Tukey的多重比较测试）。B类：使用抗整合素β6（红色荧光）的免疫荧光实验检测到用AA治疗的野生型小鼠LTL标记（绿色荧光）近端小管基底外侧表面的线性染色（箭头）(左下角). 研究中其他组的组织切片中没有整合素β6染色。细胞核用DAPI（蓝色荧光）进行复染。白色条代表50 微米。AA，马兜铃酸；长期贷款，四棱莲花凝集素；信号转导子和转录激活子1。
为了确定TGF-β的活性是否增加，对p-Smad2/3（Ser465/467)四组均进行总Smad2/3和GAPDH测定。如前所述(14)，总Smad2/3的表达在状态1−/−因此，p-Smad2/3的表达受每个样本中总Smad2/3水平的影响。在治疗组中，来自野生型小鼠的肾皮质的裂解物中p-Smad2/3增加。与相应的状态1−/−小鼠，对照处理的野生型小鼠也显示出少量但显著的增加(P（P）<0.05），p-Smad2/3水平(). 免疫荧光显微镜显示p-Smad2（Ser465/467)与研究中的其他组相比，治疗组野生型小鼠近端小管中的细胞数量增加(). AA治疗组野生型小鼠的皮层组织证实I型胶原α稳态mRNA表达增加1(第1a1列)，III型胶原-α1(第3a1列)，IV型胶原-α5(第4a5列)，纤维连接蛋白(Fn1型)，转化生长因子-beta 1基因(Tgfb1型)、和状态1与…相比状态1−/−AA治疗组小鼠和溶媒治疗组小鼠(). 我们利用偏光显微镜下的苦味酸染色切片分析了间质纤维化，特别是胶原沉积的作用(21，22)。状态1−/−治疗组小鼠在野生型小鼠中未发现间质胶原沉积增加(和). Western blot分析也证实，AA-处理野生型小鼠肾皮质中的纤维连接蛋白增加，但AA-处理的小鼠肾脏中没有增加状态1−/−小鼠和两个车辆处理组()。
治疗组野生型小鼠肾皮质中p-Smad2/3（S465/7）的表达增加。一个：因为总Smad2/3的表达在状态1−/−老鼠，这是之前观察到的一项发现(14)p-Smad2/3的表达受每个样本中总Smad2/3水平的影响。肾皮质裂解物的Western blot分析显示，AA治疗后野生型小鼠中p-Smad2/3的表达增加。与相应对照组比较状态1−/−小鼠、车辆治疗和假治疗野生型小鼠也表现出增加(P（P）<0.007）p-Smad2/3水平。STAT1的存在与实验治疗之间的相互作用也很显著[F类（1，12） = 38.49,P（P）< 0.0001]. *P（P）<0.0001，与其他三组相比#P（P）<0.007，与以下两组相比状态1−/−实验中的小鼠(n个 = 每组4只；双向方差分析（使用Tukey的多重比较测试）。B类：使用抗p-Smad2抗体的免疫荧光显微镜检测到AA治疗后野生型小鼠近端小管中存在p-Smad1（红色荧光），这些小管用LTL（绿色荧光）标记，以及其他未识别的细胞(左下角). 在细胞核（黄色箭头）和细胞质中检测到p-Smad2。在组织切片中未检测到p-Smad2（S465/467）相关荧光状态1−/−老鼠(正确的)在车辆处理的同窝对照小鼠中很少检测到(左上角). 细胞核用DAPI（蓝色）复染。黄色条=20 微米。AA，马兜铃酸；长期贷款，四棱莲花凝集素；信号转导子和转录激活子1。
AA处理野生型小鼠肾皮质中Stat1、Tgfb1、Col1a1、Col3a1和Fn1 mRNA的稳定水平增加。在研究中，测定了四组小鼠肾皮质中的稳定mRNA水平(n个 = 5-9只小鼠/组）。AA治疗组野生型小鼠的皮层组织显示I型胶原α稳态mRNA增加1（Col1a1），III型胶原-α1（Col3a1）、纤维连接蛋白（Fn1）、转化生长因子-β1（Tgfb1）和Stat1，但不包括I型胶原-α5（Col4a5），与状态1−/−在每个实验中，AA治疗组小鼠和车辆治疗组小鼠。数据采用双向方差分析和Tukey多重比较检验进行分析。AA，马兜铃酸；Stat1，信号转导子和转录激活子1。
删除状态1阻止AA治疗后间质胶原沉积的发展。一个：苦味酸染色检测到四组（6-7只小鼠/组）肾脏切片间质中存在胶原蛋白（红色、绿色和黄色荧光）。每组的代表性图像如图G肾小球所示。用苏木精对细胞核进行复染。白色条=100 微米。B类：使用图像处理程序（ImageJ，v.1.51，NIH）对染色切片进行量化，并在×40放大倍数下检查偏振显微镜图像。STAT1的存在与实验治疗之间的相互作用是显著的[F类(1, 23) = 14.21,P（P）= 0.0010]. AA-处理过的幼崽中观察到的胶原蛋白沉积增加在AA-处理的幼仔中没有观察到状态1−/−老鼠*P（P）<0.0002，与其他三组相比（Tukey多重比较检验的双向方差分析）。AA，马兜铃酸；信号转导子和转录激活子1。
在治疗组中，野生型小鼠的肾皮质中纤连蛋白增加。一个：肾皮质裂解物的Western blot分析显示，AA治疗后野生型小鼠的纤维连接蛋白增加(n个 = 每组4只小鼠）。B类：STAT1的存在与实验治疗之间的相互作用是显著的[F类（1，12） = 8.103,P（P）= 0.0147]. 与对照组和状态1−/−治疗组小鼠、野生型小鼠在治疗组中表现出增加(*P（P）<0.05）纤维连接蛋白水平（Tukey多重比较试验的双向方差分析）。AA，马兜铃酸；信号转导子和转录激活子1。
讨论
最初在中草药制剂中作为减肥剂销售，流行病学研究随后发现AA可导致肾小管萎缩和间质纤维化导致进行性肾衰竭(23). 通过肝脏代谢产生的AA代谢物已被证明通过有机阴离子转运蛋白在近端小管中积累(24). AA与这些有毒代谢物一起，促进线粒体损伤、氧化应激和核苷酸结合域、富含亮氨酸重复序列的家族吡啶结构域3（NLRP3）炎症小体途径的激活(24——28). 近端肾小管功能改变导致细胞凋亡、炎症细胞因子和生长因子的释放以及胶原转录(6). 最终结果是肾小管萎缩和间质纤维化(6，25——28). 通过证明平均血清肌酐水平增加第40天野生型，但不是状态1−/−本研究发现STAT1直接参与了CKD AA模型的肾功能丧失。持续的STAT1激活，由701位酪氨酸残基的磷酸化表示(42)仅在AA处理的野生型小鼠中观察到肾小管损伤、整合素β6、p-Smad2/3、纤维连接蛋白和胶原间质沉积增加。总的来说状态1−/−AA诱导的肾小管损伤和纤维化显著。
AA-治疗组典型TGF-β途径的激活显著降低状态1−/−老鼠。虽然多种潜在途径可以启动TGF-β活性，但已证明整合素αvβ6可以促进TGF-(30——34). 与潜在相关肽上的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列结合，在潜在复合物中产生构象变化，从而激活TGF-β(32). 整合素β6是产生跨膜αvβ6异二聚体的限制性亚单位，在正常成人肾脏中几乎无法检测到，但它代表上皮细胞对损伤和炎症的反应(35). 阻断αvβ6依赖性TGF-β激活减轻单侧输尿管梗阻（UUO）患者间质纤维化的发展(31)以及其他肾脏疾病，包括某些免疫球蛋白游离轻链代谢引起的近端小管病变(14，30). 与这些研究一致，AA处理的是野生型小鼠，而不是AA处理的小鼠状态1−/−小鼠整合素β6出现局部增加()和p-Smad2/3()在近端小管中。Picrosius染色，胶原沉积的指示物(21，22)，表明AA处理野生型小鼠的间质胶原和纤维连接蛋白增加。因为在状态1−/−结果显示，STAT1依赖性过程导致近端小管整合素β6的表达、TGF-β的激活和间质基质蛋白沉积。综合研究结果不仅支持抑制STAT1的潜在细胞保护作用，而且特别支持在该模型中预防间质纤维化。
我们的研究结果与该领域的其他出版物一致，但以下有一个例外。最近对UUO期间近端小管特异性基因表达的分析表明，炎症前和纤维化前转录因子如干扰素调节因子1(红外1),Nfkb1号机组、和状态3成为肾纤维化进展的驱动因素(8). 因为STAT1必须上调IRF1(9)因此，我们目前的结果与这些发现是一致的。与本研究一致的是，两项关于糖尿病肾病的研究表明，人类肾脏标本和糖尿病小鼠肾脏近端小管中STAT1的激活增加与间质纤维化的发展有关(36，37). 由STAT1上调的IRF1的产生（23）促进了实验性缺血性急性肾损伤（AKI）早期发生的促炎反应；损失红外1改善了该模型中肾功能的丧失（单侧肾切除术后17例 剩余肾脏热缺血min）(38). 作者得出结论，IRF1的激活机制涉及活性氧物种的生成，活性氧物种也激活STAT1通路(13，14). Kemmner等人(39)在他们的缺血再灌注损伤模型中也显示出STAT1在限制肾小管损伤和炎症中的作用。然而，间质纤维化的半定量组织学证据出现在斯达+/+老鼠在状态1−/−老鼠(39). 这一结论与本研究的结论不同，其可能的解释是肾损伤方法的使用（30 右肾热缺血min），这比本研究中使用的肾损伤过程严重得多。虽然没有得出不同结论的确切原因，但除整合素β6外，多种纤维化重塑机制可能激活TGF-β(7，40)并产生肾小管间质纤维化的最终共同途径。
观点和意义
通过证明小鼠缺乏状态1−/−显示肾小管损伤和间质纤维化的病理生理学证据较少，这项新的研究证实了STAT1对AA诱导肾病结局的直接影响。STAT1抑制的细胞保护作用得到了近期出版物的支持，这些出版物证明STAT1在其他肾小管损伤动物模型中的激活和参与，包括单克隆免疫球蛋白游离轻链引起的近端小管病变(14)，缺血再灌注损伤(41)和顺铂诱导的细胞毒性(42). 随着STAT1的激活，整合素β6的表达随着TGF-β的激活而增加。因为TGF-β也促进整合素β6的转录(43)近端小管Smad信号的启动促进了潜在的局部正反馈回路，从而导致间质纤维化。这些发现证实了间质纤维化可能是CKD的一个活跃过程这一概念。一个警告是STAT1可能会增强DNA损伤引起的细胞凋亡(44). 尽管先前的研究表明AA诱导的细胞凋亡的主要机制涉及线粒体功能障碍和氧化应激(25——27)AA也会促进遗传毒性应激(45)，这可能有助于此过程。通过以下方式减轻这些影响状态1本研究未对删除进行探讨。尽管STAT1在近端小管中表达并被氧化应激激活(13，14)AA的主要靶点是近端小管(6，25——28)，STAT1也在肾小球中表达，并参与例如葡萄糖介导的足细胞损伤(46). 因此，我们论文的第二个局限性是我们对肾小管的关注，留下了STAT1在伴随性肾小球损伤中的额外作用的问题。Ruxolitinib是一种临床上可用的选择性JAK/STAT1抑制剂，已证明其对多发性骨髓瘤有效(47，48)以及FLC介导的体外近端小管激活和损伤(14). 很明显，CKD代表一种临床异质性最终共同途径，由多种病因途径启动和维持，因此，后续在其他CKD模型中对该发现的确认将为JAK1/2抑制剂的使用扩大到由激活STAT1通路的疾病导致的进行性CKD患者提供机会。
披露
提交人未声明任何利益冲突，无论是财务还是其他方面。
作者贡献
W.F.、L.M.C.和P.W.S.构思并设计了研究；W.F.、W-Z.Y.、X.L.、L.M.C.和P.W.S.进行了实验；W.F.、W-Z.Y.、X.L.、L.M.C.和P.W.S.分析数据；W.F.、W-Z.Y.、X.L.、L.M.C.和P.W.S.解释了实验结果；W.F.、W-Z.Y.、X.L.、L.M.C.和P.W.S.编制的数字；W.F.、W-Z.Y.、X.L.、L.M.C.和P.W.S.起草的手稿；W.F.、W-Z.Y.、X.L.、L.M.C.和P.W.S.编辑和修订了手稿；W.F.、W-Z.Y.、X.L.、L.M.C.和P.W.S.批准了手稿的最终版本。
参考文献
2苍鹭M。死亡：2017年的主要原因.国家生命统计代表
68: 1–77,2019. [公共医学][谷歌学者] 三。美国肾脏数据系统。2019年USRDS年度数据报告：美国肾脏疾病流行病学国家卫生研究院，国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所，马里兰州贝塞斯达，2019年。“此处报告的数据由美国肾脏数据系统（USRDS）提供。这些数据的解释和报告是作者的责任，绝不应视为美国政府的官方政策或解释”。[谷歌学者] 4Nath KA公司。肾小管间质变化是肾损伤进展的主要决定因素.美国肾脏病杂志
20: 1–17, 1992. doi:10.1016/S0272-6386（12）80312-X[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 5Chung KW、Dhillon P、Huang S、Sheng X、Shrestha R、Qiu C、Kaufman BA、Park J、Pei L、Baur J、Palmer M、Susztak K。线粒体损伤和STING通路激活导致肾脏炎症和纤维化.单元格元
30：784–799，2019.e785 doi:10.1016/j.cmet.2019.08.003。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 6Fragiadaki M、Witherden AS、Kaneko T、Sonnylal S、Pusey CD、Bou-Gharios G、Mason RM。间质纤维化与体内AA损伤肾小管上皮细胞COL1A2转录增加相关.基质生物
30: 396–403, 2011. doi:10.1016/j.matbio.2011.07.004。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 7Gewin LS公司。肾纤维化：近端小管的主要功能.基质生物
68-69: 248–262, 2018. doi:10.1016/j.matbio.2018.02.006。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 8Wu H、Lai CF、Chang-Paneso M、Humphreys BD。肾纤维化期间近端小管翻译图谱显示促炎性和长非编码RNA表达模式与性二型性.JASN公司
31: 23–38, 2020. doi:10.1681/ASN.2019040337。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 9Meraz MA、White JM、Sheehan KC、Bach EA、Rodig SJ、Dighe AS、Kaplan DH、Riley JK、Greenlund AC、Campbell D、Carver Moore K、DuBois RN、Clark R、Aguet M、Schreiber RD。小鼠Stat1基因的靶向破坏揭示了JAK-STAT信号通路中意外的生理特异性.单元格
84: 431–442, 1996. doi:10.1016/S0092-8674（00）81288-X[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 10罗林斯JS、罗斯勒KM、哈里森DA。JAK/STAT信号通路.细胞科学杂志
117: 1281–1283, 2004. doi:10.1242/jcs.00963。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 11Santos CI，Costa-Pereira AP公司。从细胞因子信号传递到癌症生物学的转录信号转导器和激活器.Biochim生物物理学报
1816: 38–49, 2011. doi:10.1016/j.bbcan.2011.03.003。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 12Sikorski K、Chmielewski S、Olejnik A、Wesoly JZ、Heemann U、Baumann M、Bluyssen H。STAT1作为血管功能障碍中IFNgamma和TLR4信号整合的中枢介导物.JAKSTAT公司
1: 241–249, 2012. doi:10.4161/jkst.22469。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 13Huang JS，Chung LY，Guh JY，Huang YJ，Hsu MS黄建杰，庄莉，古杰，黄建杰，许女士。抗氧化剂抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞肥大生长.美国生理学杂志肾脏生理学
293：F1072–F10822007年。doi:10.1152/ajprenal.00020.2007。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 14Ying WZ、Li X、Rangarajan S、Feng W、Curtis LM、Sanders PW。免疫球蛋白轻链产生促炎症和纤维化肾损伤.临床研究杂志
129: 2792–2806, 2019. doi:10.1172/JCI125517。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 15O'Brown ZK、Van Nostrand EL、Higgins JP、Kim SK。炎症转录因子NFkappaB、STAT1和STAT3驱动人类肾脏中与年龄相关的转录变化.PLoS基因
11：e1005734，2015年。doi:10.1371/journal.pgen.1005734。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 16史敏，马力，周力，傅萍。17-β-雌二醇对急性马兜铃酸肾病小鼠肾脏的保护作用.分子
21: 1391, 2016. doi:10.3390/分子21101391。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 17Lin CE、Chang WS、Lee JA、Chang TY、Huang YS、Hirasaki Y、Chen HS、Imai K、Chen SM。荧光衍生-液相色谱-串联质谱法分析马兜铃酸肾病小鼠肾脏中蛋白质的变化.生物色谱仪
32, 2018. doi:10.1002/bmc.4127。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 18Nlandu Khodo S、Neelisety S、Phillips M、Manolopoulou M、Bhave G、May L、Clark PE、Yang H、Fogo AB、Harris RC、Taketo MM、Lee E、Gewin LS。阻断TGF-β和β-catenin上皮细胞串扰加剧CKD.J Am Soc肾病
28: 3490–3503, 2017. doi:10.1681/ASN.2016121351。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 19Ichimura T、Bonvente JV、Bailly V、Wei H、Hession CA、Cate RL、Sanicola M。肾损伤分子-1（KIM-1）是一种假定的上皮细胞粘附分子，含有一个新的免疫球蛋白结构域，在损伤后肾细胞中上调.生物化学杂志
273: 4135–4142, 1998. doi:10.1074/jbc.273.7.4135。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 20Kusaba T、Lalli M、Kramann R、Kobayashi A、Humphreys BD。分化肾上皮细胞修复受损的近端小管.美国国家科学院程序
111: 1527–1532, 2014. [勘误表in《美国科学院院刊》111: 5754, 2014]. doi:10.1073/pnas.1310653110。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 21Lattouf R、Younes R、Lutomski D、Naaman N、Godeau G、Senni K、Changotade S。苦味酸红染色：评估正常和病理组织中胶原网络的有用工具.组织化学与细胞化学杂志
62：2014年第751–758页。doi:10.1369/0022155414545787。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 22Sund S、Grimm P、Reisaeter AV、Hovig T。计算机图像分析与半定量评分在评价移植肾纤维化和预后中的比较.肾拨号移植
19：2838-28452004年。doi:10.1093/ndt/gfh490。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 23Debelle FD、Vanherweghem JL、Nortier JL。马兜铃酸肾病：一个世界性问题.肾脏Int
74: 158–169, 2008. doi:10.1038/ki.2008.129。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 24Chang SY、Weber EJ、Sidorenko VS、Chapron A、Yeung CK、Gao C、Mao Q、Shen D、Wang J、Rosenquist TA、Dickman KG、Neumann T、Grollman AP、Kelly EJ、Himmelfarb J、Eaton DL。人肝肾模型阐明马兜铃酸肾毒性的机制.JCI洞察
2：e959782017年。doi:10.1172/jci.insight.95978。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 25刘X，吴杰，王杰，冯X，吴赫，黄R，樊J，于X，杨X。线粒体功能障碍与马兜铃酸I诱导肾近端小管上皮细胞凋亡有关.人类实验毒物
39: 673–682, 2020. doi:10.1177/0960327119897099。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 26Pozdzik AA、Salmon IJ、Debelle FD、Decaestecker C、Van den Branden C、Verbeelen D、Deschodt-Lanckman MM、Vanherweghem JL、Nortier JL。马兜铃酸诱导近端小管凋亡及上皮-间充质转化.肾脏Int
73: 595–607, 2008. doi:10.1038/sj.ki.5002714。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 27Quan Y、Jin L、Luo K、Jin J、Lim SW、Shin YJ、Ko EJ、Chung BH、Yang CW。含马兜铃酸中药对小鼠肾毒性的评价.韩国医学实习生杂志
35: 400–407, 2020. doi:10.3904/kjim.2018.280。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 28Yu M、Man YL、Chen MH、Wu LH、Zhou Y、Zhow XL、Chen N、Ma R、Sun LN。中华绒螯蟹抑制NLRP3炎症小体激活阻断马兜铃酸诱导的肾小管上皮细胞转分化.Hum细胞
33: 79–87, 2020. doi:10.1007/s13577-019-00306-9。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 29Verhoeven Y、Tilborghs S、Jacobs J、De Waele J、Quatannens D、Deben C、Prenen H、Pauwels P、Trinh XB、Wouters A、Smits ELJ、Lardon F、van Dam PA。靶向STAT家族成员治疗癌症的潜力和争议.赛明癌症生物学
60: 41–56, 2019. doi:10.1016/j.semcancer.2019.10.002。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 30Hahm K、Lukashev ME、Luo Y、Yang WJ、Dolinski BM、Weinreb PH、Simon KJ、Chun Wang L、Leone DR、Lobb RR、McCrann DJ、Allaire NE、Horan GS、Fogo A、Kalluri R、Shield CF 3rd、Sheppard D、Gardner HA、Violette SM。Alphavβ6整合素调节Alport小鼠肾纤维化和炎症.美国病理学杂志
170: 110–125, 2007. doi:10.2353/ajpath.2007.060158。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 31Ma LJ、Yang H、Gaspert A、Carlesso G、Barty MM、Davidson JM、Sheppard D、Fogo AB。β6（-/-）小鼠肾小管间质纤维化诱导的转化生长因子-β依赖和非依赖途径.美国病理学杂志
163：1261–12732003。doi:10.1016/S0002-9440（10）63486-4。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 32Munger JS、Huang X、Kawakatsu H、Griffiths MJ、Dalton SL、Wu J、Pittet JF、Kaminski N、Garat C、Matthay MA、Rifkin DB、Sheppard D。整合素αvβ6结合并激活潜在TGFβ1：调节肺部炎症和纤维化的机制.单元格
96：319-3281999年。doi:10.1016/S0092-8674（00）80545-0。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 33Pittet JF、Koh H、Fang X、Iles K、Christiaans S、Anjun N、Wagener BM、Park DW、Zmijewski JW、Matthay MA、Roux J。HMGB1通过IL-1β和α-β6整合素依赖性TGF-β1激活促进肺泡上皮修复.公共科学图书馆一号
8：e639072013年。[勘误表in公共科学图书馆一号. 2013;8(10). doi:10.1371/annotation/88f820f2-18dd-4d3b-8989-68f170b26b04]。doi:10.1371/journal.pone.0063907。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 34Puthawala K、Hadjiangelis N、Jacoby SC、Bayongan E、Zhao Z、Yang Z、Devitt ML、Horan GS、Weinreb PH、Lukashev ME、Violette SM、Grant KS、Colarossi C、Formenti SC、Munger JS。整合素α（v）β6是潜在转化生长因子β的激活剂，抑制整合素β6可预防辐射诱导的肺纤维化.美国呼吸急救医学杂志
177: 82–90, 2008. doi:10.1164/rccm.200706-806OC。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 35Breuss JM、Gallo J、DeLisser HM、Klimanskaya IV、Folkesson HG、Pittet JF、Nishimura SL、Aldape K、Landers DV、Carpenter W等。。β6整合素亚基在发育、肿瘤形成和组织修复中的表达提示其在上皮重塑中的作用.细胞科学杂志
108: 2241–2251, 1995. [公共医学][谷歌学者] 36黄F，王Q，郭F，赵Y，纪L，安T，宋Y，刘Y，何Y，秦G。FoxO1介导的STAT1抑制减轻糖尿病肾病肾小管间质纤维化和肾小管凋亡.EBioMedicine公司
48: 491–504, 2019. doi:10.1016/j.ebiom.2019.09.002。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 37Huang F、Zhao Y、Wang Q、Hillebrands JL、van den Born JJL、An T、Qin G。达帕格列嗪通过调节STAT1/TGFβ1信号减轻与1型糖尿病相关的肾小管间质纤维化.前内分泌（洛桑）
10: 441, 2019. doi:10.3389/fendo.2019.00441。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 38王毅、约翰·R、陈·J、理查德森·JA、谢尔顿·JM、贝内特·M、周晓杰、纳加米·GT、张毅、吴·QQ、卢·CY。IRF-1促进缺血性急性肾损伤后早期炎症反应.JASN公司
20: 1544–1555, 2009. doi:10.1681/ASN.200080843。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 39Kemmner S、Bachmann Q、Steiger S、Lorenz G、Honarpisheh M、Foresto-Neto O、Wang S、Carbajo-Lozoya J、Alt V、Schulte C、Chmielewski S、Bluyssen HAR、Heemann U、Baumann M、Lech M、Schmaderer C。STAT1调节巨噬细胞数量和表型，预防缺血再灌注损伤后肾纤维化.美国生理学杂志肾脏生理学
316：2019年第277至291层。doi:10.11152/ajprenal00004.2018。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 40Meng X-M，Nikolic-Paterson DJ，Lan HY。TGF-β：纤维化的主要调节因子.自然综述肾脏病学
12: 325–338, 2016. doi:10.1038/nrneph.2016.48。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 41谢LB，陈B，廖X，陈YF，杨R，何SR，裴LJ，蒋R。靶向miR-128-3p的LINC00963通过激活JAK2/STAT1通路促进急性肾损伤过程.细胞与分子医学杂志
24: 5555–5564, 2020. doi:10.1111/jcmm.15211。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 42Tsogbadrakh B、Ryu H、Ju KD、Lee J、Yun S、Yu KS、Kim HJ、Ahn C、Oh KH。AMPK激活剂AICAR通过JAK/STAT/SOCS途径保护顺铂诱导的急性肾损伤.生物化学-生物物理研究委员会
509: 680–686, 2019. doi:10.1016/j.bbrc.2018.12.159。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 43Tatler AL、Goodwin AT、Gbolahan O、Saini G、Porte J、John AE、Clifford RL、Violette SM、Weinreb PH、Parfrey H、Wolters PJ、Gauldie J、Kolb M、Jenkins G。TGF-β诱导的ITGB6基因转录扩增可能促进肺纤维化.公共科学图书馆一号
11：e01580472016年。doi:10.1371/journal.pone.0158047。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 44Townsend PA、Scarabelli TM、Davidson SM、Knight RA、Latchman DS、Stephanou A。STAT-1与p53相互作用增强DNA损伤诱导的凋亡.生物化学杂志
279: 5811–5820, 2004. doi:10.1074/jbc。M302637200[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 45Kathuria P、Singh P、Sharma P、Wetmore SD。通过模型跨损伤合成DNA聚合酶复制马兜铃酸I腺嘌呤加合物（ALI-N（6）-A）：从分子动力学模拟中诱导跨损伤突变的结构见解.化学研究毒物
33: 2573–2583, 2020. doi:10.1021/acs.chemrestox.0c00183。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 46王浩，张毅，夏福，张伟，陈鹏，杨刚。沉默Stat1通过Forkhead转录因子O1调节氧化应激反应对高糖诱导足细胞损伤的保护作用.BMC分子细胞生物学
20: 27, 2019. doi:10.1186/s12860-019-0209-0。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 47昆塔斯·卡达玛（Quintas-Cardama A）、瓦迪·K（Vaddi K）、刘·P（Liu P）、曼舒里·T（Manshouri T）、李·J（Li J）、舍尔·PA（Scherle PA）、考尔德·E（Caulder E）、文·X（Wen X）、李·Y（Li Y）、瓦尔茨·P（Waeltz P）、鲁帕尔·M（Rupar M）、伯恩·T（Burn T）、罗·Y（Lo Y），凯利。选择性JAK1/2抑制剂INCB018424的临床前特征：对骨髓增生性肿瘤的治疗意义.血液
115: 3109–3117, 2010. doi:10.1182/bloud-2009-04-214957。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 48Ramakrishnan V、Kimlinger T、Haug J、Timm M、Wellik L、Halling T、Pardanani A、Tefferi A、Rajkumar SV、Kumar S。TG101209是一种新型JAK2抑制剂，对多发性骨髓瘤具有显著的体外活性，并对CD45+骨髓瘤细胞表现出优先的细胞毒性.美国血液学杂志
85: 675–686, 2010. doi:10.1002/ajh.21785。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 
