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.2017年11月16日；2（22）：e95978。
doi:10.1172/jci.insight.95978。

人肝肾模型阐明马兜铃酸肾毒性的机制

张士昱 1, 以利亚·J·韦伯 2, Viktoriya S Sidorenko公司 三, 阿伦卡·查普伦 2, 凯瑟琳·K·杨 2 4, 高春英 2, 青城毛 2, 丹尼·沈 2, 乔安妮·王 2, 托马斯·罗森奎斯特 三, 凯萨琳·G·迪克曼 三, 托马斯·诺伊曼 5, 亚瑟·P·格罗尔曼 三 6, 爱德华·J·凯利 2, 乔纳森·希梅尔法布 4, 大卫·L·伊顿 1
附属公司

人肝肾模型阐明马兜铃酸肾毒性的机制

张士昱等。 JCI洞察力. .

摘要

环境暴露对人类健康构成重大威胁。然而，由于伦理方面的考虑，研究人类受试者的毒理学机制往往很困难。植物源马兜铃酸是迄今为止发现的最有效的肾毒素和致癌物之一，但对其在人类体内的生物活性机制仍知之甚少。微生理系统（芯片上的器官）提供了一种利用人类细胞检测药物和环境化学品复杂、物种特异性毒理效应的方法。我们用微流控技术将芯片上的肾脏与芯片上的肝脏连接起来，以确定马兜铃酸I（AA-I）的生物活性和转运机制，马兜铃酸I是一种已确定的肾毒素和人类致癌物。我们证明，AA-I的人类肝细胞特异性代谢显著增加了其对人类肾近端小管上皮细胞的细胞毒性，包括形成马兜铃内酯加合物和释放肾损伤生物标记物。AA-I向肾毒性代谢物的肝生物转化涉及氮还原，然后是硫酸盐结合。在这里，我们确定，在人类组织系统中，肝脏NQO1生成的AA-I（AL-I-NOSO3）的阿里斯托拉坦产物的硫酸盐结合物是AA-I的肾毒性形式。这种结合物可以通过MRP膜转运蛋白从肝脏转运，然后通过一个或多个有机阴离子膜转运蛋白主动转运到肾组织。该集成微生理系统提供了一种用于研究器官-有机物相互作用的体外方法，其中一个组织对药物或其他外源物质的代谢可能会影响其对另一个组织的毒性，并代表了一种研究与环境和其他毒性暴露相关的化学毒性的实验方法。

关键词：细胞生物学；慢性肾脏疾病；分子病理学；肾脏学；毒素/药物/异种生物。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：Nortis公司总裁兼首席执行官T.Neumann对这项工作有经济利益，因为该公司的设备在开发这些“芯片上的组织”设备时被使用。

数字

图1
图1。完整的肝肾微生理系统模型。
(A类)单个肝脏和肾脏微生理系统（MPS）芯片。将近端小管上皮细胞注射到充满I型胶原（6 mg/ml）的MPS中，形成如前所述的管状结构（9，43）。用Matrigel（0.23 mg/ml）覆盖物将肝细胞接种到整个培养箱中。如方法所述，分别维持肝脏MPS和肾脏MPS。灰色圆点代表细胞。(B类)注射泵介导培养基通过MPS芯片流动。(C类)通过与C-Flex管道直接耦合实现肝肾MPS芯片的串行集成。
图2
图2。AA-I人肾毒性伴或不伴肝代谢。
(A类)AA-I治疗24小时后，MPS中培养的人类近端肾小管上皮细胞（PTEC）的代表性相位对比和LIVE/DEAD图像。(B类)图像的定量细胞毒性A类.n个=每个治疗组5-8个。(C类)0和10μM AA-I处理的PTEC中AL-I加合物的代表性免疫细胞化学染色，包括肝代谢或无肝代谢。n个= 3. (D类)人类MPS流出物中的KIM-1水平。n个=每个治疗组5-8个。所有实验均独立重复至少3次。比例尺：150μm。使用以下公式计算统计显著性吨通过多次比较修正了测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. 图表显示平均值±SD。
图3
图3。双香豆素减轻AA-I肾毒性。
双香豆素（10μM）和AA-I（25μM）共处理24小时后，在MPS中培养的人近端肾小管上皮细胞的代表性LIVE/DEAD染色。比例尺：150μm。定量结果表示为平均值±标准偏差。n个=每治疗5次。使用以下公式计算统计显著性吨测试***P（P）< 0.001.
图4
图4。AL-I-NOSO公司三（硫酸盐结合的AL-I代谢物）MPS中的人类肾毒性。
(A类)AL-I-NOSO后MPS中培养的近端肾小管上皮细胞（PTEC）的代表性LIVE/DEAD染色三治疗24小时。(B类)中图像的定量结果A类.n个=每个治疗组5-8个。统计显著性使用吨试验（不另说明。，P（P）= 0.769). 图表显示平均值±标准偏差(C类)10μM AL-I-NOSO中AL-I加合物的典型免疫细胞化学结果三-在无肝代谢或有肝代谢的MPS中治疗PTEC。n个= 3. 比例尺：150μm。
图5
图5。抑制AL-I-NOSO三丙磺舒（OAT抑制剂）的肾毒性。
(A类)丙磺舒（Pro，2 mM）和AL-I-NOSO作用于MPS中培养的人近端肾小管上皮细胞的代表性LIVE/DEAD染色三（25μM）共处理24小时。比例尺：150μm。(B类)中图像的定量肾毒性A类.n个=每次治疗5-6个。(C类)摄入0.5μM AL-I-NOSO三在OAT4转染的COS7细胞中与在2 mM丙磺舒存在下的模拟转染进行比较。n个= 4–5. (D类)摄入0.5μM AL-I-NOSO三在OAT1或OAT3转染的HEK细胞中与在2 mM丙磺舒存在下的模拟转染进行比较。n个= 3. 使用以下公式计算统计显著性吨测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. 定量结果表示为平均值±标准偏差。
图6
图6。AL-I-NOSO的膜转运三.
摄入0.5μM AL-I-NOSO三在含有或不含有100μM MK571的4 mM ATP或4 mM AMP的情况下，过度表达MRP3或MRP4的内外质膜囊泡。n个= 3. 使用以下公式计算统计显著性吨测试*P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.001. 定量结果表示为平均值±标准偏差。
图7
图7。AA-I代谢途径阐明了肝脏和肾脏的相互作用。
AA-I和AL-I-NOH、AL-I-NOSO的硫酸盐结合代谢产物三由肝酶形成，包括通过NQO1还原和与SULT结合。AL-I-NOSO公司三然后通过MRP3/4主动从肝脏转运，然后通过OAT转运蛋白进入肾脏。AL-I-NOSO公司三形成DNA和蛋白质加合物，导致肾毒性。（肝脏和肾脏也可能产生AA-I的无毒代谢物，特别是AA-Ia和AL-I及其结合物。）
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