实验-治疗-医学。2017年9月；14(3): 2721–2727.
Tim-3沉默对成纤维细胞样滑膜细胞活力和脂多糖诱导的炎症反应的影响
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吴锐（Rui Wu）
中国四川省成都市四川省人民医院四川省医学科学院风湿病免疫科，邮编610072
李龙
四川省医学科学院风湿免疫科，四川省人民医院，四川省成都市，邮编610072
陈奇奇（Qiqi Chen）
中国四川省成都市四川省人民医院四川省医学科学院风湿病免疫科，邮编610072
吴晓丹
中国四川省成都市四川省人民医院四川省医学科学院风湿病免疫科，邮编610072
京珠
中国四川省成都市四川省人民医院四川省医学科学院风湿病免疫科，邮编610072
滨州
中国四川省成都市四川省人民医院四川省医学科学院风湿病免疫科，邮编610072
贾诚
中国四川省成都市四川省人民医院四川省医学科学院风湿病免疫科，邮编610072
中国四川省成都市四川省人民医院四川省医学科学院风湿病免疫科，邮编610072
2016年8月16日收到；2017年5月16日接受。
摘要
本研究的目的是研究Tim-3沉默对成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）中细胞活性和脂多糖（LPS）诱导的炎症反应的影响。采用western blot分析和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测类风湿关节炎（RA）患者和正常对照者FLS中T细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域分子（Tim）-3的表达。使用脂质体转染小干扰RNA®2000减少Tim-3的表达。转染后，LPS刺激FLS。采用MTT分析、RT-PCR和western blot分析分别测定细胞活力、Toll样受体4（TLR4）信号通路相关蛋白表达和炎症细胞因子释放。本研究结果表明，与健康对照组相比，RA患者FLS中Tim-3的表达增加。转染Tim-3 siRNA显著降低RA患者FLS中Tim-3的表达。值得注意的是，Tim-3沉默降低了FLS细胞的活性。LPS刺激后，FLS中的细胞活力和TLR4、髓样分化蛋白基因88（MyD88）和核因子-κB（NF-κB）p65的表达增强。相比之下，Tim-3沉默减弱了LPS诱导的细胞增殖以及TLR4、MyD88和NF-κB p65的表达。此外，LPS显著增加上清液中的细胞因子水平，包括肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ和白细胞介素-6（P<0.01）。相比之下，Tim-3沉默显著降低了LPS诱导的细胞因子释放（P<0.01）。然而，Tim-3沉默不影响未经LPS处理的细胞中TLR4、MyD88和NF-κB p65的表达以及细胞因子的释放。因此，本研究结果表明，Tim-3沉默可降低RA中FLS的活性，并减轻LPS诱导的炎症反应。
关键词：T细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域分子-3、类风湿关节炎、成纤维细胞样滑膜细胞、Toll样受体4
引言
类风湿关节炎（RA）是一种自身免疫性疾病，其主要特征是滑膜的增生性和破坏性炎症(1,2). 复发性滑膜炎导致关节结构和功能的丧失。RA不仅发病率高（发达国家成年人为0.5-1%），而且死亡率也很高（全球约30000人）(三). T辅助细胞介导的免疫反应和炎性细胞因子在RA的发展中起着关键作用。具体而言，Th 1细胞在滑液中高度活化，能够分泌大量炎性细胞因子，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素（IL）-6，这些细胞因子会损伤关节滑膜和骨骼(4–6). 成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）是滑膜细胞中最重要的类型之一。在病理因素的刺激下，FLS释放各种细胞因子以促进关节破坏(7).
Toll样受体（Toll like receptor，TLR）是一种固有免疫受体，可被脂多糖（LPS）等配体激活(8). 下游信号通路包括招募骨髓髓样分化蛋白基因88（MyD88）和激活肿瘤坏死因子-κB（NF-κB）p65信号通路，调节炎性细胞因子的表达并促进免疫反应(9,10). 先前的研究表明，类风湿关节炎中TLR4信号通路被激活，TLR4通路的激活与类风湿关节病的发病和发展密切相关(11–13).
T细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域分子（Tim）基因家族于2001年首次鉴定(14). 该基因家族位于人类5号染色体上，目前已鉴定出3种不同的亚型：Tim-1、Tim-2和Tim-3(15). Tim-3被认为是Th1细胞的特异性表面标志物，能够调节Th1细胞免疫反应，参与系统性红斑狼疮、再生障碍性贫血和其他自身免疫性疾病(16,17). 此外，Tim-3在分化簇（CD）4中高度表达+T细胞以及类风湿性关节炎患者的滑膜组织(17–19). Tim-3与TLR4信号通路密切相关，并通过调节该信号通路参与多种免疫疾病(20,21). 本研究假设Tim-3可能通过介导TLR4信号通路参与RA的发生和发展。为了验证这一假设，选择FLS作为细胞模型，以证明Tim-3沉默对FLS细胞活性和LPS诱导的炎症反应的影响。
材料和方法
细胞培养
滑膜组织取自2015年6月至2016年6月期间在四川省人民医院（中国四川省）进行膝关节置换手术的20名风湿性疾病患者。20名患者中，5名男性，15名女性，平均年龄53岁。所有RA患者均根据美国风湿病学会分类标准进行诊断(22). 正常滑膜组织取自10名健康对照组（5名男性和5名女性患者，平均年龄38岁），这些对照组于2015年6月至2016年6月期间因意外事故在骨科截肢，但没有患类风湿疾病。每个患者都获得了知情同意，实验方案得到了四川省人民医院伦理委员会的批准。
在无菌条件下用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗滑膜组织，并去除脂肪组织。分别用胰蛋白酶和胶原酶切割和消化滑膜组织30分钟和3小时。通过离心（987×g，室温下4分钟）获得细胞悬液，并在Dulbecco改良的Eagle's培养基（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA）中培养，该培养基提供10%的胎牛血清（Hyclone；GE Healthcare Life Sciences，Logan，UT，USA，100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素在37°C含有5%CO的培养箱中2第二代或第三代FLS用于后续实验。
逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）
使用TRIzol试剂盒（中国上海宝盛科技创新有限公司）从FLS中提取RNA。通过分光光度计（中国上海精密仪器有限公司）评估光密度（OD）280/OD260，确认RNA的纯度。根据制造商的协议（目录号RR055A；Takara Biomedical Technology Co.，Ltd.，Beijing，China），使用一步逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，并在25µl PCR反应系统（HiFiScript cDNA；目录号YJ2569；CW Biotech，Beiching，China）中扩增用于PCR（UItraSYBR混合物；CW Biotech），用DNA聚合酶（目录号EP0041；Thermo Fisher Scientific，Inc.）处理如下：94°C下变性45秒，59°C下退火45秒，72°C下延伸60秒，35个周期，如前所述(23). 用于Tim-3、TLR4、MyD88、NF-κB p65和GAPDH的引物序列见PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色进行检测，条带密度通过ImageJ Software v1.48u（美国马萨诸塞州贝塞斯达国立卫生研究院）进行分析。
表一。
Tim-3、TLR4、MyD88、NF-κB p65和GAPDH的引物。
| 基因 | 方向 | 引物序列（5′-3′） | 长度，bp |
|---|
| 时间-3 | 福沃德 | CCAGAGACTGTAATCAT公司 | 749 |
| 反向 | ATGATTAACAGTCTCTGG公司 | |
| TLR4型 | 福沃德 | GAGCCGTTGGTTATCTTGA公司 | 166 |
| 反向 | ctcccattcagggtaggtgtt公司 | |
| 我的D88 | 福沃德 | CTTTATCTGCATACTGCCCAAC公司 | 230 |
| 反向 | CAAACTGTGTCTGGAAGTCACA公司 | |
| NF-κB p65 | 福沃德 | TGCGAATGGAGCGACACG公司 | 122 |
| 反向 | CACCCTTGCTGCTCACCGAGGCC公司 | |
| GAPDH公司 | 福沃德 | AGCCACATCGCTCAGACA公司 | 314 |
| 反向 | TGGACTCCACGACGTACT公司 | |
用siRNA转染FLS
FLS（3×105/ml）在37°C的96个平板中培养。当细胞达到50%融合时，使用Lipofectamine转染siRNA Tim-3和对照siRNA（中国上海基因制药有限公司）®2000（上海积马实业有限公司，中国上海）。转染后6 h，向细胞中添加1µg/ml LPS（中国上海阿拉丁生化科技有限公司）。
MTT分析
如前所述，转染48 h后通过MTT分析（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA）检测细胞活力(17). 将紫色formazan晶体溶解在二甲基亚砜中，并使用微孔板阅读器（Thermo Fisher Scientific，Inc.）在560 nm的波长下测量吸光度。
蛋白质印迹分析
转染后，收集FLS，并在48小时后提取蛋白进行western blot分析，如前所述(23). 抗体，包括抗Tim-3（目录号ab185703）、抗TLR4（目录号ab13556）、抗MyD88（目录号ab2068）、抗NF-κB p65（目录号ab 207297；均为1:1000；英国剑桥Abcam）和抗GAPDH（1:1000；目录号AG019，贝约泰生物技术研究所），在4°C下以1:100的稀释度培养过夜。用0.1%PBST（0.1%吐温-20）洗涤后，在室温下用抗小鼠免疫球蛋白（Ig）G或抗兔IgG辣根过氧化物酶结合二级抗体（1:100；目录号分别为ab131368和ab191866；Abcam）探测膜2 h。ECL试剂盒（目录号RPN2133；GE Healthcare Life Sciences，Chalfont，UK）用于辅助染色。使用ChemiDocTM XRS（Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA）对印迹进行扫描，并使用Quantity One分析软件v1.4.6（Bio-Read Laboratory，Inc.）分析灰密度。
酶联免疫吸附试验
转染48小时后收集上清液完成ELISA。TNF-α（目录号ab181421）、IFN-γ（目录号ab46025）和IL-6（目录号ab46027；所有Abcam）水平根据特定检测试剂盒的说明进行测定。
统计分析
所有实验至少重复三次，数据以平均值±标准偏差表示。使用SPSS 17.0版进行统计分析（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）。采用Student t检验分析差异，P<0.05被认为代表显著差异。
结果
RA FLS中Tim-3的表达增加
评估Tim-3 mRNA和蛋白的表达。RA FLS中Tim-3蛋白的表达显著上调(). 此外，与对照组相比，RA FLS中Tim-3 mRNA的水平显著增加(). 这些结果表明Tim-3可能是RA治疗的靶点。
RA和NC患者成纤维细胞样滑膜细胞中Tim-3的表达。（A） 蛋白质和（B）mRNA的表达。Tim-3，T细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域分子-3；类风湿关节炎；NC，正常控制。
Tim-3沉默减弱LPS诱导的Tim-3表达
Tim-3的siRNA旨在减少Tim-3表达。如所示siRNA显著降低Tim-3蛋白和mRNA的表达（P<0.01；).
Tim-3沉默可降低成纤维细胞样滑膜细胞中Tim-3的表达。（A） Tim-3蛋白和GAPDH的代表性印迹，（B）定量，（C）Tim-3 mRNA和GAPDH的代表性条带，（D）定量**与siRNA NC相比P<0.01。数据以平均值±标准偏差表示。Tim-3，T细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域分子-3；NC，正常控制；控制；小干扰RNA。
本研究还分析了Tim-3沉默对LPS诱导的Tim-3表达的影响。如所示LPS处理显著增加Tim-3蛋白和mRNA的表达（P<0.01；). Tim-3沉默不仅显著降低RA FLS中Tim-3的表达（P<0.01），而且显著降低LPS诱导的Tim-3表达（P<0.05；). 证实Tim-3沉默显著降低了LPS诱导的Tim-3 mRNA和蛋白表达的增加（P<0.01；).
Tim-3沉默降低了LPS治疗和未治疗的成纤维细胞样滑膜细胞中Tim-3的表达。（A） Tim-3蛋白表达的代表性印迹（B）定量，（C）Tim-3 mRNA表达的代表带（D）定量**P<0.01。数据表示为平均值±标准偏差。Tim-3，T细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域分子-3；脂多糖；NC，正常控制；小干扰RNA。
Tim-3沉默降低RA患者FLS的活性
与对照组相比，Tim-3沉默显著降低FLS的存活率（P<0.01；). 然而，LPS处理也显著提高了转染对照siRNA和Tim-3 siRNA的FLS的细胞活力（P<0.01）。此外，与对照siRNA相比，Tim-3沉默显著减弱了LPS处理诱导的细胞活力增加（P<0.01；).
各组的OD表明有和无LPS治疗的成纤维细胞样滑膜细胞的活性**P<0.01。数据表示为平均值±标准偏差。OD，光密度；NC，正常控制；Tim-3 T细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域分子-3；脂多糖；小干扰RNA。
Tim-3沉默降低TLR4、MyD88和NF-κB p65的表达
评估Tim-3沉默对炎症相关基因表达的影响。LPS处理显著增加TLR4、MyD88和NF-κB p65 mRNA和蛋白的表达（P<0.01；). 此外，Tim-3沉默在mRNA和蛋白水平上减弱了LPS诱导的这些基因表达的增加（P<0.01；). 相反，与未经LPS处理的对照siRNA相比，Tim-3 siRNA转染的FLS中TLR4、MyD88和NF-κB p65 mRNA和蛋白的表达没有显著差异().
Tim-3沉默可减弱LPS诱导的TLR4、MyD88和NF-κB p65表达增加。（A） TLR4、MyD88、NF-κB p65（A）蛋白和（B）mRNA表达的代表性印迹。TLR4在（C）蛋白和（D）mRNA水平表达的量化数据。MyD88在（E）蛋白和（F）mRNA水平表达的量化数据。（G）蛋白和（H）mRNA水平NF-κB p65表达的量化数据**P<0.01。数据表示为平均值±标准偏差。Tim-3，T细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域分子-3；脂多糖；TLR4，Toll样受体4；MyD88，髓系分化蛋白基因88；核因子-κB；NC，正常控制；小干扰RNA。
Tim-3沉默降低TNF-αINF-γ和IL-6水平
本研究测定了FLS中TNF-α、IFN-γ和IL-6的水平，确定LPS治疗显著增加FLS中的TNF-β、IFN-β和IL-6水平（P<0.01；). Tim-3沉默对未经LPS治疗的FLS中细胞因子的释放无显著影响，但显著降低LPS治疗FLS中的细胞因子释放（P<0.01；).
Tim-3沉默可降低LPS诱导的血清（A）TNF-α、（B）IFN-γ和（C）IL-6水平升高**P<0.01。数据表示为平均值±标准偏差。Tim-3，T细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域分子-3；脂多糖；肿瘤坏死因子-α；干扰素γ、干扰素-γ、IL-6、白细胞介素-6；NC，正常控制；小干扰RNA。
讨论
RA是一种以滑膜炎症为特征的自身免疫性疾病，其特征是滑膜细胞过度增殖和侵袭，以及产生侵袭性血管翳(1,2). 光盘4+RA患者滑膜组织中的T细胞被激活，分泌大量炎性因子，刺激滑膜增殖和血管侵入，最终导致骨和软骨破坏(4–6). FLS是参与RA发展的有效细胞之一，也是滑膜细胞的主要成分，具有“肿瘤样”侵袭活性(24). 在缺氧环境中，Th1炎症细胞刺激FLS，激活参与RA发病和发展的多种信号通路(19). 因此，本研究选择FLS作为靶细胞。目前的研究比较了RA患者和正常对照组FLS中Tim-3的表达。用LPS刺激FLS细胞，随后研究Tim-3的功能。
目前的研究使用western blot分析和RT-PCR检测RA患者FLS中Tim-3的表达。与以往研究一致(18,19)本研究结果表明，RA患者FLS中Tim-3的表达显著高于对照组。设计特定的siRNA来降低Tim-3的表达。虽然siRNA成功地降低了Tim-3的表达，但即使在转染Tim-3 siRNA的细胞中，在LPS刺激后Tim-3表达也会增加。目前的研究结果与Yang的结果一致等(20)，表明LPS增加了脓毒症小鼠巨噬细胞中Tim-3的表达。
Tim-3是Tim家族的一种跨膜蛋白。Tim-3的胞外区域包含可变结构域和粘蛋白结构域，可能在活性Th1细胞中表达，但在Th2细胞中不表达(19). Tim-3也表达于先天免疫细胞的表面，包括CD4+T细胞，CD8+T细胞、单核细胞、B细胞和自然杀伤细胞(19). 通常，Tim-3信号通路的异常与过敏性、自身免疫性和病毒感染性疾病有关，包括哮喘、系统性红斑狼疮、RA和再生障碍性贫血(16,17). Tim-3通过负调节Th1来抑制炎症反应，从而潜在地调节免疫反应。已经证明Tim-3在CD中高度表达4+RA患者的T细胞与类风湿因子呈正相关(19). 此外，Lee等(18)表明RA患者滑膜组织中Tim-3 mRNA的水平高于健康对照组。综上所述，这些结果表明Tim-3在RA患者的Th1和滑膜细胞中表达。此外，Tim-3的过度表达可能促进肿瘤细胞和巨噬细胞的活化和增殖(25–27). 本研究还进行了MTT分析，以检测Tim-3 siRNA对脂多糖诱导的FLS增殖的影响。结果表明，LPS提高了RA患者FLS的生存能力。相比之下，Tim-3沉默降低了LPS诱导和对照细胞的细胞活力。
目前的研究还测量了不同组TLR4、MyD88和NF-κB p65的表达。本研究结果表明，LPS刺激TLR4、MyD88和NF-κB p65的表达。TLR属于I型跨膜蛋白家族，迄今已鉴定出13种类型(28). 在这些亚型中，有10种表现出功能活性，这可能影响不同类型的病原体相关分子模式（PAMP），从而调节各种生物效应(29). 这一点很重要，因为大多数生物活动与不同的免疫相关疾病密切相关。TLR4是最早发现的TLR，能够与包括脂多糖、甘露糖、结核和结核分枝杆菌在内的PAMP以及内源性配体结合(30). LPS是一种常见的配体(31). 在目前的研究中，确定LPS能够激活TLR4并招募MyD88来激活NF-κB信号通路。这些数据与以前的研究一致，这些研究表明TLR4和NF-κB在RA中被激活(11,32). 因此，TLR4可能成为RA的治疗靶点。除了炎症相关的信号通路外，目前的研究还测量了细胞因子水平。与TLR4信号通路一致，LPS刺激TNF-α、IFN-γ和IL-6的表达，Tim-3沉默显著减弱了这些表达。
总之，本研究比较了Tim-3在正常FLS和RA FLS中的表达。RA患者FLS中Tim-3的表达增加。Tim-3沉默可降低FLS活性并减轻LPS诱导的炎症反应。这些数据表明Tim-3可能是RA的治疗靶点。
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