美国国家科学院院刊。2014年6月24日；111(25): 9241–9246.
p62通过稳定Twist1调节细胞增殖和迁移
，一 ，一 ，一 ，b条 ，b条 ，c（c） ，d日和a、，1
王宁（Ning Wang）
b条骨科手术和康复医学，以及
黄承民（Seungmin Hwang）
c（c）芝加哥大学病理学，伊利诺伊州芝加哥，60637；和
安德鲁·索伯恩
d日科罗拉多大学丹佛分校药理学系和科罗拉多州奥罗拉市健康科学中心，80045
以下部门一皮肤科医学，
b条骨科手术和康复医学，以及
c（c）芝加哥大学病理学，伊利诺伊州芝加哥，60637；和
d日科罗拉多大学丹佛分校药理学系和科罗拉多州奥罗拉健康科学中心，邮编80045
由德克萨斯州达拉斯市得克萨斯大学西南分校Beth Levine编辑，2014年5月14日批准（2013年12月9日收到审查）
作者贡献：L.Q.和Y.Y.H.设计了研究；L.Q.进行了研究；B.Z.、M.M.、N.W.、T.-C.H.、S.H.和A.T.贡献了新的试剂/分析工具；L.Q.和Y.Y.H.分析数据；L.Q.、S.H.和Y.Y.H.撰写了这篇论文。
- 补充资料
支持信息
GUID:EDBEEB4C-D2C2-4C45-BFE5-557FA85BAB07
指南：5D6ADE17-E17E-480E-8D16-AEB715F7C395
重要性
选择性自噬底物p62在自噬抑制后调节肿瘤发生中的炎症和氧化还原途径。在这里，我们通过p62与致癌转录因子Twist1的分子相互作用，阐明了p62在促进体外细胞增殖和迁移以及体内肿瘤生长和转移方面的关键作用。我们的研究结果表明，以p62和Twist1之间的相互作用为靶点具有癌症预防和治疗的潜力。
关键词：SQSTM1、黑色素瘤、皮肤癌、泛素化、蛋白酶体
摘要
选择性自噬底物p62是自噬与癌症之间的分子联系。抑制自噬导致p62积聚，从而促进肿瘤发生。在这里，我们证明自噬缺陷通过p62依赖性稳定致癌转录因子Twist1促进细胞增殖和迁移。p62与Twist1结合并抑制Twistl的降解。在小鼠中，p62上调以Twist1依赖性方式促进肿瘤细胞生长和转移。我们的研究结果表明，Twist1是p62调节细胞增殖和迁移的关键下游效应器，并表明靶向p62介导的Twistl稳定化是一种有希望的癌症预防和治疗策略。
大自噬（以下简称自噬）是一个分解代谢过程，通过这个过程，细胞蛋白质、细胞质和细胞器被捕获并靶向溶酶体中的蛋白水解降解(1，2). 自噬功能障碍与多种人类疾病有关，如神经退行性变、微生物感染、代谢性疾病、心血管疾病、衰老和癌症(2–4). 多结构域蛋白p62/A170/SQSTM1（以下简称“p62”）已被证明是一种选择性自噬底物和自噬衔接蛋白，在泛素化和自噬之间起着连接作用(5，6). 一些研究已经证明p62在肿瘤形成和/或进展中的致癌作用(7，8)通过调节NF-kappaB(9，10)和NRF2(11–13). 此外，Ras在肿瘤发生中诱导p62表达(10). 然而，关于其功能以及与其他关键细胞途径的相互作用，仍有许多待阐明。
转录因子Twist1是早期胚胎形态发生和癌症发展及转移的核心调节因子(14–17). 它诱导上皮（E）-钙粘蛋白介导的细胞-细胞粘附丧失，并促进上皮-间充质转化（EMT）(16)促进细胞增殖(17). Twist1是一种基本的螺旋-环-螺旋（bHLH）蛋白，在结构上与其他EMT因子（包括鼻涕虫和蜗牛）无关。最近的研究表明，Twist1是一种不稳定的蛋白质，由泛素-蛋白酶体系统通过F-box蛋白和E3泛素连接酶Ppa调节(18). 尽管取得了这些进展，但对Twist1的监管和功能作用仍知之甚少。在这里，我们证明p62可以稳定Twist1蛋白，从而在体外和小鼠中增加细胞增殖和迁移。
结果
自噬缺陷降低E-Cadherin表达并促进细胞迁移、侵袭和增殖。
自噬的两个显著特征是轻链3-I（LC3-I）转化为LC3-II和p62的选择性降解(19，20). 最初在酵母中鉴定的自噬相关基因（Atg）产物的多种哺乳动物同源物已被鉴定(三). 与野生型（WT）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）相比，Atg3、Atg5、Atg9和Atg12基因敲除（KO）的细胞阻断了LC3-I向LC3-II的转化并诱导p62积累，表明自噬不足(). 与WT细胞相比，所有自噬缺陷细胞中E-钙粘蛋白（细胞增殖和迁移的负调控因子）的表达均降低(). Matrigel侵袭试验表明，Atg3、Atg5、Atg9和Atg12 KO MEF细胞的侵袭活性远高于WT细胞(). 半径迁移实验表明，自噬缺陷促进了MEF细胞的迁移能力(). 此外，自噬缺陷增加了细胞增殖(). 与正常人皮肤相比，在高分化鳞状细胞癌（SCC WD）和低分化鳞癌（SCC-PD）中，p62上调，而E-cadherin下调(). 我们的数据表明，自噬缺陷增加了p62水平，降低了E-cadherin的表达，促进了细胞迁移、侵袭和增殖，并且p62水平与人类SCC中E-cadherin的表达呈负相关。
自噬缺陷降低E-cadherin的表达，促进细胞迁移、侵袭和增殖。(A类)WT和Atg3、Atg5、Atg9和Atg12 KO-MEF细胞中E-钙粘蛋白、p62、LC3-I/II和GAPDH的免疫印迹分析。(B类)Transwell法检测WT和Atg3、Atg5、Atg9和Atg12 KO MEF细胞的侵袭能力。对Transwell过滤器底部的迁移细胞进行染色，并在显微镜下观察。(C类)WT和Atg3、Atg5、Atg9和Atg12 KO MEF细胞迁移能力的放射迁移分析。(D类)CellTiter 96 WT和Atg3、Atg5、Atg9和Atg12 KO MEF细胞的水性非放射性细胞增殖试验（MTS）。结果来自三个独立实验[平均值±SD（误差线），n个= 3; *P（P）< 0.05; **P（P）<0.01，与WT组相比]。(E类)正常皮肤中p62和E-cadherin蛋白水平（棕色）的典型组织学和免疫组织化学分析(n个=14），高分化鳞状细胞癌（SCC WD）(n个=25）和分化较差的SCC（SCC PD）(n个= 10). 黑色方块表示放大倍数较高的区域。（比例尺，200μm和50μm用于左侧和赖特）
自噬缺陷通过自噬体和蛋白酶体抑制Twist1降解。
为了确定E-cadherin通过自噬调节的机制，我们首先使用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）和蛋白酶体抑制剂（MG132）来确定自噬抑制对E-cadherin蛋白质稳定性的影响。CHX和MG132均不影响WT或Atg5 KO细胞中E-cadherine的水平(图S1A类)表明自噬缺陷对E-cadherin的抑制发生在mRNA水平。与WT细胞相比，Atg5 KO MEF细胞E-cadherin mRNA水平降低(图S1B类)与WT-MEF细胞相比，Atg5 KO MEF细胞中WT E-cadherin启动子的转录活性也显著降低，但E-box突变的E-cadherin启动子转录活性没有显著降低(). 这些结果表明，自噬抑制在转录水平下调E-cadherin。
自噬缺陷通过自噬体和蛋白酶体途径延迟Twist1降解。(A类)利用WT和Atg5 KO MEF细胞中完整（E-cad WT-Luc）或突变（E-cad E-box Mut-Luc）E-box位点对E-cadherin启动子进行荧光素酶报告分析。(B类)WT和Atg5 KO MEF细胞中N-钙粘蛋白、Snail、Slug、ZEB1和Twist1的免疫印迹分析。(C类和D类)p62共定位的免疫荧光分析(C类)或LC3(D类)用载体或雷帕霉素（500 nM）处理6小时（比例尺，10μm）后，WT和Atg5 KO MEF细胞中出现Twist1。蓝色为DAPI核反染。(E类和如果)CHX（100μg/mL，E类)或MG132（10μM，如果)在指定的时间内。(G公司)WT和Atg7 cKO小鼠皮肤中p62、Twist1和GAPDH的免疫印迹分析。(小时)用Atg7重组的WT和Atg7 KO细胞中E-cadherin、p62、Twist1、LC3-I/II、Atg7和GAPDH的免疫印迹分析。这些结果来自三个独立的实验。
几种E-cadherin转录阻遏物已经被鉴定（蜗牛、Slug、ZEB1和Twist1），并显示通过与E-cadherin启动子近端E-box的相互作用发挥作用(21–23). 与WT细胞相比，我们发现只有Twist1上调，而蜗牛、Slug和ZEB1在Atg5 KO细胞中没有改变(). 自噬缺陷增加神经（N）-钙粘蛋白水平()以及转录因子TCF/淋巴增强因子（LEF）复合物的活性(图S1C类)E-cadherin负调控下游通路(24). 与WT MEF细胞相比，Twist1在自噬缺乏的细胞中上调，而在p62 KO MEF细胞中与WT细胞相比下调(图S1D类). 然而，自噬抑制对Twist1的mRNA水平没有影响(图S1E类). 此外，向WT细胞添加Twist1抑制E-cadherin的表达(图S1如果)，表明Twist1足以抑制E-cadherin的表达。在WT和Atg5 KO细胞中，Twist1和p62在有或无雷帕霉素处理的点状结构中共定位(). 最近的研究表明，Atg5 KO细胞中的p62阳性点可能是早期自噬结构(25). 相反，在雷帕霉素诱导的点状细胞中，Twist1仅与LC3共定位于WT细胞，而在Atg5 KO细胞中没有(). 类似于自噬对p53蛋白稳定性的调节(26)，自噬抑制增加了Twist1的蛋白质稳定性，但并没有完全阻止Twistl的降解()表明Twist1通过自噬和蛋白酶体等其他途径降解。MG132对蛋白酶体的抑制增加了WT细胞中Twist1的丰度，但在自噬缺陷细胞中没有增加(和图S1G公司). 这些结果表明，Twist1可以通过自噬和蛋白酶体途径降解。
为了确定自噬缺陷是否影响小鼠上皮组织体内Twist1水平，我们分析了野生型（WT、K14Core、Atg7+/+)和皮肤特异性Atg7条件敲除（K14Cre；Atg7弗洛克斯，附件7 cKO）。与WT表皮相比，Atg7 cKO表皮中p62和Twist1均上调，同时E-cadherin表达降低(和图S1小时). Atg7在Atg7 KO细胞中的重组恢复了自噬，增加了E-cadherin的表达，降低了p62和Twist1的丰度().
p62调节自噬型和缺陷型细胞中的Twist1蛋白水平。
为了通过自噬抑制来确定p62在Twist1上调中的作用，我们评估了p62敲除和添加的效果。p62敲除降低WT和自噬缺陷细胞中Twist1蛋白水平(). 向WT或Atg5 KO细胞中添加p62增加了Twist1水平()，表明p62对Twist1稳定性的直接影响。p62 KO细胞中p62的重组恢复了Twist1的丰度(). p62的添加增加了293T细胞中Twist1蛋白的稳定性()，而它对Twist2的稳定性没有影响(图S2A类)，bHLH蛋白Twist亚家族的另一成员，在发育和癌症中调节基因表达(17). 这些发现表明，p62通过阻止其蛋白酶体降解至少部分稳定了Twist1。
自噬缺陷通过p62积累稳定Twist1。(A类)用载体和靶向p62和Twist1的siRNA转染WT和Atg5 KO细胞，对E-cadherin、p62、Twistl 1和GAPDH进行免疫印迹分析。(B类)转染载体和靶向p62和Twist1的shRNA的WT和Atg5 KO细胞中E-cadherin、p62、Twistl 1和GAPDH的免疫印迹分析。(C类)转染载体和p62的WT和Atg5 KO细胞中p62、Twist1和GAPDH的免疫印迹分析。(D类)对WT、p62-KO细胞和用p62重组的p62-KO细胞中的p62、Twist1和GAPDH进行免疫印迹分析。(E类)用Myc-Twist1和HA-p62转染293T细胞48小时，然后用CHX（100μg/mL）处理指定时间，对HA、Myc和GAPDH进行免疫印迹分析。这些结果来自三个独立的实验。
p62通过其泛素相关域绑定到Twist1。
为了确定p62在Twist1稳定中的作用，我们首先评估了p62是否与多泛素化Twistl结合，这对于通过自噬体-溶酶体系统选择性降解很重要。使用免疫沉淀（IP）分析，我们发现在WT和Atg5 KO MEF细胞中内源性p62与泛素化Twist1结合（在98和188 kDa之间），而非泛素化的Twist2（28 kDa）没有结合(). GST下拉测定还显示重组p62与泛素化的Twist1结合，但与非泛素化的Twist1不结合(). 内源性扭曲1绑定到p62(). p62与Twist1的这种相互作用可能是直接或间接的。与WT细胞相比，Twist1在Atg5 KO细胞中结合更多的p62，这可能是由于自噬缺陷细胞中p62的可用性增加，但结合更少的Rad23B()在通过其泛素样（UBL）和泛素相关（UBA）结构域将蛋白酶体底物传递到蛋白酶体中至关重要(27–29). 添加Rad23B降低了WT和Atg5 KO细胞中的Twist1蛋白水平()，表明Twist1的稳定性至少部分受到其与Rad23B或p62结合的竞争性调节。
p62通过其UBA域绑定到Twist1。(A类)免疫沉淀后使用WT和Atg5 KO MEF细胞中匹配的IgG和抗p62抗体对Twist1和p62进行免疫印迹分析。(B类)GST-p62与WT和Atg5 KO MEF细胞Twist1结合的GST下拉试验。(C类)免疫沉淀后使用对照种匹配的IgG和WT和Atg5 KO MEF细胞中的抗Twist1抗体对Twistl 1、p62和Rad23B进行免疫印迹分析。(D类)转染载体控制或Myc-Flag-Rad23B的WT和Atg5 KO MEF细胞中Twist1、Rad23B和GAPDH的免疫印迹分析。(E类)p62和Twist1缺失构建体的示意图。(如果)免疫沉淀后，使用WT和Atg5 KO MEF细胞中匹配的IgG和抗Myc（Myc-Twist1）抗体对总细胞裂解物（输入）或HA（HA-Ub和HA-p62）中的HA（HA-p62。免疫沉淀法检测转染Myc-Twist1和HA-p62组合、Myc-Twist1和HA-p62-ΔUBA组合以及HA-p62和Myc-Twist1-ΔWR组合48h的293T细胞中p62或p62-△UBA与Twist1-或Twist1-△WR的结合。结果来自三个独立的实验。分子量（单位：千道尔顿）标记为.
测试Twist1的Twist box（WR）域的作用，这是爪蟾Twist1泛素化和降解(18)，我们生成了一个WR缺失Myc-Twist1-ΔWR构造(). 使用CHX和MG132，我们发现WR缺失稳定了哺乳动物Twist1(图S2B类–D类). 免疫沉淀分析表明，Twist1的多泛素化和与p62的结合需要WR结构域().
p62已被证明通过其UBA结构域与多泛素化蛋白结合(30). 为了确定p62的UBA结构域在Twist1结合中的作用，我们产生了一个UBA缺失HA-p62-ΔUBA构建体(). 免疫沉淀分析表明，多泛素化Twist1和p62之间的结合需要UBA结构域(). 综上所述，我们的研究结果表明，p62与多泛素化的Twist1结合，Twistl的WR结构域和p62的UBA结构域是Twist-1和p62相互作用所必需的。
扭曲1赖氨酸175对扭曲1泛素化、降解和与p62结合至关重要。
我们已经证明了Twist1多泛素化所需的Twist1WR域(18)对于Twist1与p62的交互至关重要(). 然而，在Twist1WR结构域中没有赖氨酸位点(图S3A类). 为了确定Twist1泛素化的关键赖氨酸位点，我们生成了单个赖氨酸突变结构（赖氨酸到精氨酸，K→R） 所有赖氨酸(图S3A类). 与WT和其他Twist1突变体相比，K175R Twistl突变体显示出更高的蛋白质水平，类似于WR缺失(). K175R突变也增加了Twist1蛋白的稳定性(和图S3B类)表明赖氨酸175对Twist1降解至关重要。免疫沉淀分析表明，与野生型Twist1相比，K175R突变抑制了Twist-1多泛素化()表明K175位点对Twist1多泛素化至关重要。
Twist1赖氨酸175对Twist1泛素化、降解和与p62结合至关重要。(A类)转染载体（Con）、Myc-Twist1（K）的293T细胞中Myc和GAPDH的免疫印迹分析→R） 突变构造。(B类)对转染Myc-Twist1、Myc-Twist1-ΔWR或Myc-Twist1-K175R 48 h，然后用CHX（100μg/mL）处理指定时间的293T细胞中的Myc和GAPDH进行免疫印迹分析。(C类)在免疫沉淀（IP）后使用抗HA抗体和抗Myc抗体对泛素化Twist1（HA）和HA-p62进行免疫印迹分析，并在293T细胞中使用转染HA-Ub的Myc，以及Myc-Twist1-ΔWR或Myc-Twist1-K175R与HA-p62的组合。(D类)雷帕霉素（500 nM）处理6小时（比例尺，10μm）后，用Myc-Twist1、Myc-Twast1-ΔWR或Myc-Twest1-K175R转染的WT MEF细胞中p62和Myc共定位的免疫荧光分析。蓝色为DAPI核反染。(E类)对转染Myc-Twist1、Myc-Twist1和HA-p62的组合、Myc-Tist1-ΔWR、Myc-Wist1-K175R或Myc-Twest1-K175 R和HA-p61的组合的WT MEF细胞中E-cadherin、HA和Myc的免疫印迹分析。(如果)p62通过自噬和蛋白酶体调节Twist1的示意图。这些结果来自三个独立的实验。
K175R突变和WR缺失均取消了Twist1与p62的结合(). K175R突变和WR缺失也阻止了Twist1与p62的共定位()，因为Twist1突变体的多泛素化和与p62的结合被阻断(). 与Myc-Twist1相比，Myc-Twist1-K175R突变体的蛋白质丰度增加，E-cadherin的抑制增强(). p62在Myc-Twist1存在的情况下增加了Myc-Twist1水平并增强了E-钙粘蛋白的抑制，而在Myc-Twist1-K175R存在的情况下不影响E-钙粘蛋白的表达(). 相反，虽然WR缺失增加了Twist1的丰度，但并没有影响E-cadherin水平(). 此故障可能是由于Twist1功能的WR域要求(31). 这些数据表明，K175对Twist1泛素化、降解以及与p62的相互作用至关重要().
虽然K175对Twist1的多泛素化和稳定性至关重要，但Twistl中的其他赖氨酸残基也可能发挥作用。因此，我们评估了其他赖氨酸突变对Twist1稳定性的影响。与K175突变相比，所有K73、K76和K77位点或K137位点连同K175位点的突变进一步抑制了Twist1的降解，表明K73、K76、K77和K137位点对Twistl的降解也很重要(图S3C类). 单突变分析表明，K76、K77或K137位点的突变增加了Twist1的稳定性，而不仅仅是K73位点的突变(图S3D类).
p62通过调节Twist1促进小鼠肿瘤细胞生长和转移。
为了确定p62/Twist1轴在癌症中的功能意义，我们评估了p62在体外肿瘤细胞增殖和迁移以及小鼠异种移植瘤生长和转移中的作用。在不表达内源性Twist1的A431 SCC细胞中，p62的添加对E-钙粘蛋白水平、细胞增殖或细胞迁移没有影响(). 当添加外源性Twist1时，p62增加了Twist-1的水平，降低了E-cadherin的表达，并使E-cadherin与β-catenin在质膜上的共定位，这是E-cadherin-loss-induced cell migration的重要过程(32)增加细胞增殖和迁移(和图S4A类). 使用肿瘤生长和转移的异种小鼠模型，我们发现在没有Twist1的情况下，p62对肿瘤生长没有影响()或转移（未检测到对照或p62添加的A431细胞的转移）。然而，在存在Twist1的情况下，p62增加了肿瘤的生长和转移().
p62通过Twist1促进小鼠肿瘤细胞生长和转移。(A类)对转染载体HA-p62、Twist1或p62和Twistl组合的A431 SCC细胞中的p62、Twist1和GAPDH进行免疫印迹分析。(B类)在转染载体p62、Twist1或p62和Twistl组合的A431细胞中，利用完整（E-cad WT-Luc）或突变（E-cad Mut-Luc）E-box位点对E-cadherin启动子进行荧光素酶报告分析。(C类)转染载体控制（Con）、Twist1、p62或p62和Twistl组合的A431细胞迁移能力的伤口愈合试验。(D类)MTS检测转染载体控制（Con）、p62、Twist1或p62和Twistl组合的A431细胞的增殖，并将其作为转染后天数的函数。(E类)平均体积（mm三)皮下注射后不同周内A431-Con、A431-p62、A431-Twist1和A431-Tuist1-p62肿瘤的死亡率。(如果)注射后14周，已建立的A431-Twist1和A431-Tuist1-p62肺转移瘤中每只小鼠的平均肺肿瘤结节数。(G公司)用载体或HA-p62转染的A375黑色素瘤细胞中HA、Twist1和GAPDH的免疫印迹分析。(小时)平均体积（mm三)皮下注射后不同周A375-Con和A375-p62肿瘤的数量。(我)用靶向Atg7（shAtg7）或p62（shp62）的载体或shRNA转染A375黑色素瘤细胞，对p62、Twist1、Atg7和GAPDH进行免疫印迹分析。(J型)平均体积（mm三)皮下注射后不同周A375-Con、A375-shp62和A375-shAtg7肿瘤的死亡率。(K（K）)EGF（10 ng/mL）和TGF-β（10 ng/mL）（EGF/TGF-β）联合治疗0、6、24或48小时后，用载体（shCon）或shp62转染的HaCaT人上皮细胞中E-钙粘蛋白、N-钙粘素、Twist1、p62和GAPDH的免疫印迹分析(L（左）)转染shCon或shp62的HaCaT人上皮细胞经载体或EGF/TGF-β治疗48小时后Twist1的实时RT-PCR分析(M（M）)用载体或EGF/TGF-β处理48小时后，实时RT-PCR分析HaCaT人上皮细胞中的p62。结果来自三个独立实验[平均值±SD（误差线），n个= 3; *P（P）< 0.05; 与WT-Con电池相比(B类);#P（P）< 0.05; 与WT E-cadherin启动子相比(B类); *P（P）< 0.05; 与Con、A431-p62和A431-Twist1组相比(E类); 和**P（P）< 0.01; 与A431-Twist1组相比(如果)].
组织学和免疫组织化学分析表明，与对照组和仅Twist1组相比，p62/Twistl添加导致E-cadherin表达缺失，Ki67阳性细胞数量增加，肿瘤边界丢失，而与对照组相比，单独p62没有影响(图S4B类). 在表达内源性Twist1的人类A375黑色素瘤细胞中，添加p62可增加Twistl水平()和裸鼠肿瘤生长()而p62的敲倒降低了Twist1的水平()和裸鼠肿瘤生长(). 通过Atg7敲除抑制A375黑色素瘤细胞的自噬增加了裸鼠体内Twist1和p62的水平以及肿瘤生长(). 这些结果表明，p62对Twist1的调节增强了小鼠体内外肿瘤细胞的增殖和迁移。
为了研究p62介导的Twist1稳定化在EMT中的作用，EMT是一个对形态发生和癌症进展至关重要的过程，我们用EGF和TGF-β处理了表达低水平内源性Twist-1的对照和p62敲低的人类上皮细胞系HaCaT细胞48小时(33). 在对照（Con）HaCaT细胞中，EGF/TGF-β诱导EMT，降低E-钙粘蛋白表达，增加N-钙粘蛋白的蛋白水平以及p62和Twist1的蛋白和mRNA水平(和图S4C类). 似乎EGF/TGF-β在Twist1上调之前诱导p62表达(). p62蛋白丢失在48小时上调的机制()需要进一步调查；一种可能的机制是TGF-β诱导自噬(34). p62诱导是Twist1蛋白和EMT上调的必要条件，因为p62的敲低抑制了Twistl蛋白上调和E-钙粘蛋白抑制，并延迟了EGF/TGF-β诱导的EMT(和图S4C类). 然而，p62敲除对Twist1 mRNA水平没有影响(). 这些数据表明，在EGF/TGF-β诱导的EMT中，Twist1蛋白上调和E-cadherin下调需要p62。
讨论
在本研究中，我们证明p62通过稳定Twist1促进E-cadherin的丢失、体外细胞增殖和迁移以及体内肿瘤的生长和转移。在具有自噬能力的细胞中，Twist1可以通过自噬和蛋白酶体降解。然而，在自噬缺陷细胞中，自噬体对Twist1的降解被阻断，而积累的p62与泛素化的Twistl结合，从而通过蛋白酶体抑制Twist-1的降解(). p62的积累抑制了Twist1与Rad23B的结合，这可能是一种靶向Twist1-蛋白酶体进行降解的传递蛋白(27–29) (). 因此，p62水平的增加导致晚期人类皮肤鳞状细胞癌中细胞-细胞粘附介质E-cadherin的丢失。我们在这里的发现阐明了选择性自噬底物p62在肿瘤促进和进展中的关键作用。
Twist1的翻译后修饰及其对肿瘤生长和转移的影响尚不清楚。在健康成人组织中基本上检测不到，但在多种人类癌症中发现上调(35–39). 最近的一项研究表明，转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231中含有死亡效应域的DNA-结合蛋白（DEDD）的异位表达可通过自噬-溶酶体降解系统诱导自噬并增加两种主要致癌转录因子Snail和Twist的降解(40). 此外，p62已被证明与泛素化蛋白质结合以传递这些蛋白质，如Tau蛋白(41)蛋白酶体降解(30). 相反，我们的研究表明，p62通过自噬和蛋白酶体抑制Twist1蛋白降解，而不会影响蜗牛。在自噬缺陷细胞中，p62的上调与泛素化的Twist1结合，以减少Twist-1与Rad23B的结合，从而通过蛋白酶体抑制Twist1-降解。这种差异可能是由于(我)研究了不同的细胞类型或自噬调节(ii（ii）)对蛋白质底物的依赖，包括Twist1。事实上，以前的研究表明，p62与泛素化p53结合，从而通过减少p53与蛋白酶体穿梭蛋白p97的结合，至少部分地抑制其蛋白酶体降解(26). 未来的实验将阐明p62在调节不同蛋白质稳定性方面的不同作用。
p62与多泛素化Twist1相互作用对Twist1转录活性的影响可能涉及多种机制。p62与多泛素化Twist1的相互作用可以通过这两种形式的Twistl之间的平衡增加非泛素化的Twist 1的丰度。p62–Twist1相互作用也可能调节泛素化Twistl的转录活性。需要进一步研究以阐明p62调节Twist1活性的确切机制。
除K175外，其他赖氨酸（包括K76、K77和K137）也在Twist1降解中发挥作用，这表明其他调控途径通过促进一种或两种以上赖氨酸的组合修饰来调节Twistl的稳定性和功能。此外，我们发现p62的UBA域是与Twist1绑定和p62/Twistl交互所必需的。Twist1与包含UBA结构域的p62和Rad23B结合的潜在不同后果可能是由于p62和Rad23B的不同结构，并且是特定于衬底或Twistl的。
最近的报告表明p62在几种人类癌症中具有致癌作用(42–44). 在人类皮肤SCC中，我们发现p62的积累与E-钙粘蛋白的丰度呈负相关(). 以前的报告表明，p62在癌症发病机制中促进NF-kappaB和NRF2通路的激活(9–13). 此外，选择性自噬的抑制已被证明会导致自噬体中RhoA的螯合和多种细胞过程的失调，包括细胞运动(45，46). 我们的研究结果表明，p62在体内外细胞增殖和迁移中的致癌作用可以通过调节Twist1介导。
除了在自噬抑制后p62介导的Twist1稳定外，还需要p62来上调EGF/TGF-β诱导的Twist 1蛋白。p62/Twist1轴在Ras驱动的癌症中也可能发挥重要作用，包括肺癌和胰腺癌，因为Ras诱导p62表达(10). 未来的实验将证明p62/Twist1相互作用在癌症进展和形态发生中的重要性。除了Twist1外，最近的研究表明选择性自噬也调节涉及p62的RhoA信号(45，46). 我们实验室正在进行进一步的研究，以利用临床相关的基因小鼠模型证明自噬/p62/Twist1在肿瘤发生和肿瘤进展中的重要性。
总之，我们已经证明，自噬适配器p62通过稳定致癌蛋白Twist1，在体外促进细胞增殖和迁移，并增加小鼠的肿瘤生长和转移。我们的研究结果表明，通过与p62的相互作用对Twist1进行稳定化干预可能是一种有希望的癌症预防和治疗策略。
实验程序
经芝加哥大学机构审查委员会批准后，对所有人体标本进行了研究。所有动物程序均已获得芝加哥大学动物护理和使用委员会的批准。WT、Atg5 KO MEF细胞[取自Noboru Mizushima（东京大学）]、Atg3 KO、Atg 7 KO、Attg9 KO、Atg12 KO、p62 KO、对照和Atg14 cKO MEF-细胞、多西环素诱导的Atg12敲除（KD）4T1细胞（小鼠乳腺上皮肿瘤细胞）、HeLa（人类宫颈癌细胞）、HEK-293T（人类胚胎肾细胞）、，使用A431（人类鳞癌细胞）、HaCaT（人类角质形成细胞和上皮细胞，由Norbert Fusenig（德国海德堡德国癌症研究中心（DKFZ））善意提供）和A375（人类无色素黑色素瘤细胞）。所有方法的详细说明见SI实验程序.
致谢
我们感谢Deborah Lang博士和Kay Macleod博士的有益建议，感谢Noboru Mizushima博士热情提供WT和Atg5 KO MEF，感谢Tony Firuli博士提供Myc-Twist1 pcDNA3.1和Flag-Twist1 pcDNA3.1，感谢Kimmelman博士提供pLKO.1 shAtg7（人类），感谢Masaaki Komatsu博士提供Atg7弗洛克斯老鼠，Terri Li负责免疫组化，Ann Motten博士负责批判性阅读手稿。这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）/美国国家环境健康科学研究所（National Institute on Environmental Health Sciences）ES016936（致Y.Y.H.）拨款、美国癌症学会（American Cancer Society）拨款RSG-13-078-01（致Y.H.）、芝加哥大学癌症研究中心（P30 CA014599）、CTSA（NIH UL1RR024999）、，和芝加哥大学皮肤病学之友捐赠基金。
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