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临床试验
.2014年6月24日；111(25):9241-6.
doi:10.1073/pnas.1322913111。 Epub 2014年6月9日。

p62通过稳定Twist1调节细胞增殖和迁移

雷强 1, 赵宝忠 1, 梅明 1, 王宁（Ning Wang） 2, 同川河 2, 黄承民（Seungmin Hwang） 三, 安德鲁·索伯恩 4, 何玉英 5
附属公司
临床试验

p62通过稳定Twist1调节细胞增殖和迁移

雷强等。 美国国家科学院程序. .

缩回

摘要

选择性自噬底物p62是自噬与癌症之间的分子联系。抑制自噬导致p62积聚，从而促进肿瘤发生。在这里，我们证明自噬缺陷通过p62依赖性稳定致癌转录因子Twist1促进细胞增殖和迁移。p62与Twist1结合并抑制Twistl的降解。在小鼠中，p62上调以Twist1依赖性方式促进肿瘤细胞生长和转移。我们的研究结果表明，Twist1是p62调节细胞增殖和迁移的关键下游效应器，并表明靶向p62介导的Twistl稳定化是一种有希望的癌症预防和治疗策略。

关键词：SQSTM1；黑色素瘤；蛋白酶体；皮肤癌；无处不在。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
自噬缺陷降低E-cadherin的表达，促进细胞迁移、侵袭和增殖。(A类)WT和Atg3、Atg5、Atg9和Atg12 KO MEF细胞中E-cadherin、p62、LC3-I/II和GAPDH的免疫印迹分析。(B)Transwell法检测WT和Atg3、Atg5、Atg9和Atg12 KO MEF细胞的侵袭能力。对Transwell过滤器底部的迁移细胞进行染色，并在显微镜下观察。(C类)WT和Atg3、Atg5、Atg9和Atg12 KO MEF细胞迁移能力的放射迁移分析。(D类)CellTiter 96 WT和Atg3、Atg5、Atg9和Atg12 KO MEF细胞的水性非放射性细胞增殖试验（MTS）。结果来自三个独立实验[平均值±SD（误差线），n个= 3; *P（P）< 0.05; **P（P）<0.01，与WT组相比]。(E类)正常皮肤中p62和E-cadherin蛋白水平（棕色）的典型组织学和免疫组织化学分析(n个=14），高分化鳞状细胞癌（SCC WD）(n个=25）和分化较差的SCC（SCC PD）(n个= 10). 黑色方块表示放大倍数较高的区域。（比例尺，200μm和50μm用于左侧和赖特）
图2。
图2。
自噬缺陷通过自噬体和蛋白酶体途径延迟Twist1降解。(A类)利用WT和Atg5 KO MEF细胞中完整（E-cad WT-Luc）或突变（E-cad E-box Mut-Luc）E-box位点对E-cadherin启动子进行荧光素酶报告分析。(B)WT和Atg5 KO MEF细胞中N-钙粘蛋白、Snail、Slug、ZEB1和Twist1的免疫印迹分析。(C类和D类)p62共定位的免疫荧光分析(C类)或LC3(D类)用载体或雷帕霉素（500 nM）处理6小时（比例尺，10μm）后，WT和Atg5 KO MEF细胞中出现Twist1。蓝色为DAPI核反染。(E类和F类)CHX（100μg/mL，E类)或MG132（10μM，F类)在指定的时间内。(G公司)WT和Atg7 cKO小鼠皮肤中p62、Twist1和GAPDH的免疫印迹分析。(H（H）)用Atg7重组的WT和Atg7 KO细胞中E-cadherin、p62、Twist1、LC3-I/II、Atg7和GAPDH的免疫印迹分析。这些结果来自三个独立的实验。
图3。
图3。
自噬缺陷通过p62积累稳定Twist1。(A类)用载体和靶向p62和Twist1的siRNA转染WT和Atg5 KO细胞，对E-cadherin、p62、Twistl 1和GAPDH进行免疫印迹分析。(B)用载体和shRNA靶向p62和Twist1转染的WT和Atg5 KO细胞中E-钙粘蛋白、p62、Twist1和GAPDH的免疫印迹分析。(C类)转染载体和p62的WT和Atg5 KO细胞中p62、Twist1和GAPDH的免疫印迹分析。(D类)对WT、p62-KO细胞和用p62重建的p62-KO细胞中的p62、Twist1和GAPDH进行免疫印迹分析。(E类)用Myc-Twist1和HA-p62转染293T细胞48小时，然后用CHX（100μg/mL）处理指定时间，对HA、Myc和GAPDH进行免疫印迹分析。这些结果来自三个独立的实验。
图4。
图4。
p62通过其UBA域绑定到Twist1。(A类)免疫沉淀后使用WT和Atg5 KO MEF细胞中匹配的IgG和抗p62抗体对Twist1和p62进行免疫印迹分析。(B)GST-p62与WT和Atg5 KO MEF细胞Twist1结合的GST下拉试验。(C类)免疫沉淀后使用对照种匹配的IgG和WT和Atg5 KO MEF细胞中的抗Twist1抗体对Twistl 1、p62和Rad23B进行免疫印迹分析。(D类)转染载体控制或Myc-Flag-Rad23B的WT和Atg5 KO MEF细胞中Twist1、Rad23B和GAPDH的免疫印迹分析。(E类)p62和Twist1删除构造的示意图。(F类)免疫沉淀后，使用WT和Atg5 KO MEF细胞中匹配的IgG和抗Myc（Myc-Twist1）抗体对总细胞裂解物（输入）或HA（HA-Ub和HA-p62）中的HA（HA-p62。免疫沉淀法检测转染Myc-Twist1和HA-p62组合、Myc-Twist1和HA-p62-ΔUBA组合以及HA-p62和Myc-Twist1-ΔWR组合48h的293T细胞中p62或p62-△UBA与Twist1-或Twist1-△WR的结合。结果来自三个独立的实验。分子量（千道尔顿）如图4所示A类–C类和F类.
图5。
图5。
Twist1赖氨酸175对Twistl泛素化、降解和与p62结合至关重要。(A类)转染载体（Con）、Myc-Twist1（K）的293T细胞中Myc和GAPDH的免疫印迹分析→R） 突变构造。(B)对转染Myc-Twist1、Myc-Twist1-ΔWR或Myc-Twist1-K175R 48 h，然后用CHX（100μg/mL）处理指定时间的293T细胞中的Myc和GAPDH进行免疫印迹分析。(C类)在用抗Myc抗体进行免疫沉淀（IP）后，使用抗HA抗体对泛素化Twist1（HA）和HA-p62进行免疫印迹分析，并在用HA-Ub以及Myc-Twist1、Myc-Twist1-ΔWR或Myc-Twist1-K175R与HA-p62的组合转染的293T细胞中对Myc进行免疫印迹分析。(D类)雷帕霉素（500 nM）处理6小时（比例尺，10μm）后，用Myc-Twist1、Myc-Twast1-ΔWR或Myc-Twest1-K175R转染的WT MEF细胞中p62和Myc共定位的免疫荧光分析。蓝色为DAPI核反染。(E类)对转染Myc-Twist1、Myc-Twist1和HA-p62的组合、Myc-Tist1-ΔWR、Myc-Wist1-K175R或Myc-Twest1-K175 R和HA-p61的组合的WT MEF细胞中E-cadherin、HA和Myc的免疫印迹分析。(F类)p62通过自噬和蛋白酶体调节Twist1的示意图。这些结果来自三个独立的实验。
图6。
图6。
p62通过Twist1促进小鼠肿瘤细胞生长和转移。(A类)对转染载体HA-p62、Twist1或p62和Twistl组合的A431 SCC细胞中的p62、Twist1和GAPDH进行免疫印迹分析。(B)在转染载体p62、Twist1或p62和Twistl组合的A431细胞中，利用完整（E-cad WT-Luc）或突变（E-cad Mut-Luc）E-box位点对E-cadherin启动子进行荧光素酶报告分析。(C类)转染载体控制（Con）、Twist1、p62或p62和Twistl组合的A431细胞迁移能力的伤口愈合试验。(D类)MTS检测转染载体控制（Con）、p62、Twist1或p62和Twistl组合的A431细胞的增殖，并将其作为转染后天数的函数。(E类)平均体积（mm三)皮下注射后不同周内A431-Con、A431-p62、A431-Twist1和A431-Tuist1-p62肿瘤的死亡率。(F类)注射后14周，已建立的A431-Twist1和A431-Tuist1-p62肺转移瘤中每只小鼠的平均肺肿瘤结节数。(G公司)用载体或HA-p62转染的A375黑色素瘤细胞中HA、Twist1和GAPDH的免疫印迹分析。(H（H）)平均体积（mm三)皮下注射后不同周A375-Con和A375-p62肿瘤的数量。(我)用靶向Atg7（shAtg7）或p62（shp62）的载体或shRNA转染A375黑色素瘤细胞，对p62、Twist1、Atg7和GAPDH进行免疫印迹分析。(J)平均体积（mm三)皮下注射后不同周A375-Con、A375-shp62和A375-shAtg7肿瘤的死亡率。(K（K）)EGF（10 ng/mL）和TGF-β（10 ng/mL）（EGF/TGF-β）联合治疗0、6、24或48小时后，用载体（shCon）或shp62转染的HaCaT人上皮细胞中E-钙粘蛋白、N-钙粘素、Twist1、p62和GAPDH的免疫印迹分析(L（左）)转染shCon或shp62的HaCaT人上皮细胞经载体或EGF/TGF-β治疗48小时后Twist1的实时RT-PCR分析(M（M）)用载体或EGF/TGF-β处理48小时后，实时RT-PCR分析HaCaT人上皮细胞中的p62。结果来自三个独立实验[平均值±SD（误差线），n个= 3; *P（P）< 0.05; 与WT-Con电池相比(B);#P（P）< 0.05; 与WT E-cadherin启动子相比(B); *P（P）< 0.05; 与Con、A431-p62和A431-Twist1组相比(E类); 和**P（P）< 0.01; 与A431-Twist1组相比(F类)].
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