C2结构域被认为是水溶性的外周蛋白，与脂质双层可逆结合。最近，证据表明其中一些结构域能够与肌醇磷脂1,2-二酰基相互作用-锡-甘油-3-[磷酸肌醇-4,5-二磷酸][PtdIns(4,5)P（P）2] (1–4)它能够直接参与多种功能，包括质膜上的细胞信号传递、膜交通和运输的调节、细胞骨架动力学和核事件(5,6). 尽管目前可用的C2域3D结构数量众多，但它们如何与不同的靶磷脂相互作用、它们在脂质双层中的精确空间位置以及它们在下游传递信号中的作用等问题仍有待探索。
经典PKC（cPKC）中C2结构域的主要作用是充当Ca2+-活化膜靶向基序(7,8). 这些C2域的3D结构由8条反向平行的β-链组成，组装成β-三明治结构，顶部和底部有柔性环(9–12). 该C2域显示2个功能区：Ca2+-结合区和多基簇。前者位于灵活的顶部回路中，结合2或3 Ca2+离子，取决于同工酶(10,11,13,14)，并与1,2-二酰基相互作用-锡-甘油-3-[磷酸-我-丝氨酸]（PtdSer）(11,15,16). 第二个区域是一个多基簇，位于由链β3和β4形成的C2域的凹面上。最近的研究表明，该区域可能与PtdIns特异结合(4,5)P（P）2以Ca为单位2+-依赖方式(1,17–21).
深入了解PtdIn的结构和功能基础(4,5)P（P）2-PKCα-C2结构域的依赖性膜靶向，我们确定了PKCαC2结构域的三元和四元复合物的3D结构，这些复合物在Ca存在下结晶2+和PtdIn(4,5)P（P）2或Ca2+，铂族锡(4,5)P（P）2和PtdSer。此外，通过对参与PtdIns的残基进行定点突变，在活细胞中验证了晶体学结果(4,5)P（P）2-C2域交互。值得注意的是，在磷脂酰肌醇相互作用中发现的大多数残基在拓扑I的C2结构域中高度保守，这是PtdIns特异调控C2结构域的膜对接的一般机制(4,5)P（P）2建议。
结果和讨论
铂族锡(4,5)P（P）2特异性结合到PKCα-C2域中的β3–β4凹槽。
了解cPKC的C2域如何与其2个目标相互作用：PtdSer和PtdIns(4,5)P（P）2重组PKCα-C2结构域得到了2种不同的晶体形式。一种在钙存在下结晶2+和PtdIn(4,5)P（P）2,另一个在钙的存在下结晶2+，铂族锡(4,5)P（P）2和PtdSer。最终的电子密度图证实了磷脂配体在两种结构中的存在(和表S1).
与PtdIns结合的PKCαC2结构域的结构(4,5)P（P）2. (A类)蛋白激酶CαC2 Ca2+-铂族锡(4,5)P（P）2三元络合物。(B类)蛋白激酶CαC2 Ca2+-PS-PtdIns公司(4,5)P（P）2第四纪杂岩。C2分子显示为蓝色。位于钙结合区域尖端的钙离子表示为绿色球体。磷酸根离子和磷脂分子被描绘成棒状。(C类)β3–β4凹槽视图，显示C2结构域和IP之间的相互作用三PtdIns头组(4,5)P（P）2C2残留物用蓝色棒状物表示并明确标记。InsP公司三分子在原子类型代码中以棒状显示。氢键显示为黑色虚线。省略|如果o个| − |如果c（c）|电子密度图以绿色显示在InsP周围，轮廓为3.0σ三分子。
3 Ca2+如前所述，在2个络合物中钙结合囊中发现的离子位于与钙位点Ca1、Ca2和Ca3相同的位置(16,22)和中图S1.在PKCαC2-Ca中2+-铂族锡(4,5)P（P）2结构上，该区域的额外电子密度的强峰值被解释为磷酸根离子的存在，完成了Ca1的配位(图S1A类). 在PKCαC2 Ca中2+-PtdSer-PtdIns公司(4,5)P（P）2结构中，一个更细长的密度出现在Ca1附近，这被解释为对应于PtdSer的部分有序磷丝氨酸头部基团(图S1B类).
在这两种配合物中，在C2结构域β3和β4链形成的凹面内，即β3–β4凹槽内，都发现了定义明确的额外电子密度。肌醇的存在清楚地解释了这些密度(1,4,5)-三磷酸盐（InsP三)PtdIns的头部组(4,5)P（P）2，占据了空腔( A类和B类). 当督察三PtdIns头组(4,5)P（P）2位于该区域，所有3个磷酸基团以及在较小程度上，多元醇部分与C2结构域相互作用(). 多基簇内4个保守赖氨酸中的3个与PtdIns相互作用(4,5)P（P）2：β3的Lys-197与肌醇环的磷酸5部分和羟基O6形成2个极性键，β4的Lys-209与部分暴露于溶剂中的磷酸1形成盐桥，Lys-211也来自β4，与磷酸4部分相互作用。此外，还有3个其他残基参与了相互作用：Tyr-195的羟基被氢键结合到磷酸盐4和5上。Asn-253的侧链与磷酸5部分形成弱氢键（距离3.51Å). 最后，位于附近的Trp-245也接触磷酸盐5(C类). 这些发现与之前获得的生化结果一致，因为消除钙结合区的突变只影响PtdSer结合(15,23,24)而消除由链β3和β4形成的凹陷区域的突变只改变了PtdIns(4,5)P（P）2相互作用(1,16,19). 此外，在其他外周膜蛋白中也观察到芳香残基和磷脂酰肌醇头部基团之间的相互作用，如一些pleckstrin同源结构域(25).
上述结果立即表明，InsP三分子也会以与PtdIn类似的方式与C2结构域结合(4,5)P（P）2分子。由于InsP的重要性三在涉及PKCα活化的信号转导途径中，我们检测了可溶性InsP的热力学三在饱和钙存在下，通过25°C等温滴定量热法与PKCα的C2结构域结合2+。绑定数据表明有1个绑定位置，但尚未完全被占用(n个=0.51±0.14），带K（K）D类19.8±1.7μM(图S2). 这些结果表明C2结构域对PtdIn的亲和力(4,5)P（P）2(K（K）D类参考中=1.8μM。19)高于可溶性InsP三或PtdSer(K（K）D类参考中=18μM。20)表明其他磷脂酰肌醇部分和/或PtdIn采用的取向(4,5)P（P）2膜中的分子可能有助于增加这种亲和力。
几项研究表明，未磷酸化的肌醇环垂直于双层表面(26)而肌醇C4和C5中的双重磷酸化诱导了向双层表面的弯曲(26,27). 该方向与此处所示晶体结构中的方向类似，因此与膜界面中C2域的完美对接相兼容，即PtdIns(4,5)P（P）2，目标分子。此外，这种定向也可以解释生化结果显示PtdIns(三,4,5)P（P）三也可以绑定（虽然亲和力较低）到此C2域(10,20,28)，因为肌醇环C3中的磷酸基团将指向不直接参与蛋白质相互作用的膜界面（参见C类和中提出的对接模型A类).
PKCα-C2结构域对接到膜表面。(A类)模型膜对应于具有坐标的POPC分子动力学模拟（蛋白质数据库ID代码人口128). 表示了膜双层的一半（细棒）。中的C2域表示为GRASP计算的势面(33)并由PyMol显示(网址：www.pymol.org). 钙2+离子显示为绿色球体。2种相互作用磷脂、PtdSer和PtdIns的头部基团(4,5)P（P）2（粗棒），用作对接模型的参考。(B类)PtdSer和PtdIns特写(4,5)P（P）2相互作用的表面。
芳香残基在PKCα质膜定位中的作用。
为了将晶体结构中测定的结合特性与Tyr-195和Trp-245在PKCα质膜定位上的功能联系起来，我们对融合到EGFP（PKCα-EGFP）的全长PKCα进行了定点突变。为了消除这些残基与PtdIns的相互作用(4,5)P（P）2分子中，产生了几个突变体：PKCαW245A-EGFP、PKCαY195S-EGFP、PKC a Y195S/W245A-GGFP、PKCαK209A/K211A/Y195S-EGFP和PKCαK2019A/K211A/Y195S/W245A-EGFP。使用的细胞系统是神经生长因子（NGF）分化的嗜铬细胞瘤细胞（PC12），该细胞受到细胞外ATP的刺激，诱导PKCα质膜移位(17).
当PKCαW245A-EGFP和PKCαY195S-EGFP突变体在与WT-PKCα相同的条件下在分化的PC12细胞中进行测试时，观察到表达这些结构的细胞中，分别只有31%和43%能够展示部分质膜。他们的t吨1/2未受到显著影响，但其半最大解离时间（HMDT）减少≈50%()表明Trp-245和Tyr-195在PKCα的膜对接中都很重要。当用离子霉素和1,2-二辛醇刺激细胞时-锡-甘油（DiC8），对刺激有较高数量的细胞反应，尽管膜/定位比与ATP刺激非常相似，并且移位的半衰期比相同条件下WT蛋白的半衰时间慢( A类和B类和)证明即使在钙饱和的情况下2+和二酰甘油浓度，突变蛋白不能正确定位在质膜上。PKCαY195S/W245A-EGFP双突变体也获得了非常相似的结果，该双突变体现在出现在遍布细胞液的囊泡中（仅34%），表明突变阻碍了PKCα在质膜中找到其靶点，钙和二酰甘油过量不能恢复其在膜中的正确定位( C类和D类和).
表1。
| 蛋白质 | 刺激
|
|---|
100μM ATP
| 离子霉素+100μg/mL DiC8
|
|---|
| N个细胞 | 膜定位，% | R（右）最大值, % | t吨1/2，秒 | HMDT，秒 | 膜定位，% | R（右）最大值, % | t吨1/2，秒 |
|---|
| WT PKCα-EGFP | 37 | 70 | 0.74 ± 0.13 | 12±3 | 130±28 | 100 | 0.83 ± 0.09 | 13±7 |
| PKCαW245A-EGFP | 19 | 31 | 0.52 ± 0.14 | 16 ± 4 | 57 ± 33 | 84 | 0.62 ± 0.11 | 38 ± 16 |
| PKCαY195S-EGFP | 23 | 43 | 0.63 ± 0.11 | 13 ± 4 | 69 ± 19 | 70 | 0.57 ± 0.12 | 57 ± 13 |
| PKCαY195S/W245A-EGFP | 29 | 34 | 0.45 ± 0.11 | 25±7 | 85 ± 30 | 55 | 0.49 ± 0.16 | 42 ± 19 |
| PKCαK209A/K211A-EGFP | 26 | 40 | 0.55 ± 0.12 | 22 ± 8 | 63 ± 29 | 50 | 0.40 ± 0.1 | 64 ± 25 |
| PKCαK197A/K199A-EGFP | 20 | 55 | 0.57 ± 0.14 | 18 ± 4 | 84 ± 27 | 50 | 0.30 ± 0.06 | 32 ± 15 |
| PKCαK209A/K211A/Y195S-EGFP | 31 | 45 | 0.52 ± 0.13 | 25±7 | 83 ± 28 | 36 | 0.32±0.08 | 39±29 |
| PKCαK209A/K211A/Y195S/W245A-EGFP | 28 | 42 | 0.42 ± 0.1 | 23 ± 7 | 86 ± 10 | 39 | 0.40 ± 0.12 | 59 ± 19 |
多基簇中芳香残基对PKCα膜定位的作用。(A类)表达PKCα-EGFP并用100μM ATP刺激的dPC12细胞的共焦图像。左侧和中间帧对应于ATP刺激后的0和60秒。记录300秒后，用2μM离子霉素和100μg/mL DiC8（右框）刺激PC12细胞。(B类)红色箭头表示R（右）最大值计算HMDT参数；绿色箭头表示t吨1/2计算了参数。剖面图代表了在分析的单元格中获得的结果(n个= 37). (C类和D类)在与WT蛋白相同的条件下，研究了PKCαY195S/W245A-EGFP突变体A类和B类(n个=29个单元格）。(E类)PC12细胞转染PKCα-EGFP（第1道）、C2α-ECFP（第2道）、C2-αW245A-ECFP。
由于位于β4链上的Lys残基与2个磷酸部分建立相互作用，我们研究了包括这些残基（Lys-209和Lys-211）、Tyr-195和Trp-245在内的三重和四重突变的影响，以探讨它们对酶定位的影响。观察到这两种突变体都降低了它们与质膜的结合能力，并且在细胞溶质上的小泡中也发现了这两种突变(和图S3).
结构和功能结果均表明，芳香族和阳离子残基参与了PtdIns(4,5)P（P）2通过与肌醇环的磷酸盐1、4和5的氧部分相互作用进行识别。考虑到形成该区域的残基突变不会影响表观钙2+C2域的亲和力(19,23)，观察到的对质膜定位的影响似乎主要来自这些突变体对PtdIns亲和力的降低(4,5)P（P）2.
通过消除PtdIns中的所有残基来阻断C2结构域的主要干扰活性(4,5)P（P）2绑定。
我们在先前的工作中证明，当PKCα的分离C2结构域在PC12细胞中过表达时，它作为一个显性负蛋白模块，抑制NGF和ATP在这些细胞中诱导的神经元分化(21). 在这里，我们测试了几个突变体对NGF和ATP诱导的神经元分化过程的影响，持续48小时。结果表明，C2αW245A增强的青色荧光蛋白（ECFP）、C2αY195A-ECFP、C2αX195A/W245A-ECFP和C2αK209A/K211A-ECFP-突变体部分恢复了神经元的分化(E类和表S2). 只有当这4个突变被纳入同一结构（C2αK209A/K211A/Y195S/W245A-ECFP）中时，才能获得神经元分化的完全恢复，这表明一旦这4个关键位点被消除，该结构域就缺乏结合PtdIns的能力(4,5)P（P）2在质膜中，因此不会干扰这一长期过程。请注意，通过用ATP刺激PC12细胞，对全长蛋白中的同一突变体进行的实验表明，PKCα仍然能够与质膜短暂相互作用，可能是因为仍然能够与PtdSer相互作用的钙结合区域的合作，但不能干扰分化过程。
β3–β4凹槽中的芳香族和阳离子残基在拓扑I的C2域中高度保守。
我们使用国家生物技术信息结构中心VAST-MMDB基于结构的序列比对，分析了cPKC C2域与拓扑I和II的其他C2域的相似性(29,30). 据观察，PKCα中的Tyr-195在所有蛋白中都非常保守(图S4). Lys-197、Lys-209和Asn-253在具有拓扑I的域中高度保守，Lys-211在具有拓扑Ⅰ的域中也同样保守，除了所分析的突触球蛋白的C2A域和DOC2γ的C2A区(图S4). 最后，Trp-245在拓扑I的大多数C2域中保守或被Leu、Cys或Tyr等残基取代。然而，拓扑II的C2域并没有保留PtdIn的大部分残基(4,5)P（P）2相互作用(图S4).
总之，这些结果表明，C2结构域一级序列中这些氨基酸残基的存在可以使我们预测潜在的PtdIns(4,5)P（P）2与以下一致序列的相互作用位点：Tyr X三赖氨酸Xn1个LysXLys X公司氮气Trp（酪氨酸/亮氨酸/半胱氨酸）X第三名Asn，其中Xn1个表示β3、β4和X之间的连接回路氮气对应于包含β5、β6及其连接环的段。这可能意味着氨基酸残基的数量在每个特定的C2结构域中可能不同(图S4).
由于Trp-245残基在这些C2结构域中的保守度较低，我们想知道在PKCα中该残基是否可以被亮氨酸或酪氨酸取代。据观察，Leu突变抑制了50%被分析细胞的质膜定位(图S5A类). 然而，Tyr的突变在测量的质膜定位参数中没有产生显著变化(图S5B类和C类)，表明在PKCα的情况下，Tyr的羟基能够与肌醇环中的磷酸5建立氢键。
基于结构的序列比对（VAST）获得的最高分数对应于突触结合蛋白I和VII、兔亲素3A和PI3KC2α的C2结构域。所有这些都被描述为绑定PtdIn(4,5)P（P）2(三,4,31,32)，并且他们保存了共识位点中的大多数残基(图S4). 当比较突触蛋白I-C2B和PKCα-C2的三维排列结构时( A类和B类)，前者保存了PtdIns的大部分必需残基(4,5)P（P）2绑定(A类). 然而，这些残基还没有在突触蛋白中进行研究(B类)，以及它们对神经元胞吐作用的贡献还有待进一步探索。
PKCα的C2结构域与拓扑I的其他C2结构域的结构重叠。所表示的区域包含与PtdIns直接接触的PKCαC2的所有残基(4,5)P（P）2（深蓝色）和synaptotagmin I-C2B的比较结构（浅蓝色和标记）中的等效残基(A类和B类)，兔亲和素3A C2A和C2B结构域(C类和D类)和PI3KC2αC2(E类).B类黄色条显示突触蛋白I-C2B中突变的Lys残基（2，35，36）；注意，Lys-311和Lys-326不是与PtdIn相互作用的保守残基的同源物(4,5)P（P）2在PKCα中，只有synaptotagmin I-C2B中的Lys-327与PKCα的Lys-211同源。
兔亲素3A的C2A和C2B结构域以及PI3KC2α的C2结构域也与PtdIns结合(4,5)P（P）2(三,4,32)具有不同的亲和力，并且它们保留了PKCα中描述的大多数残基( C–E类). 有趣的是，兔亲素3A的C2B结构域与PtdIns的结合亲和力很低(4,5)P（P）2(4)，当其3D结构与PKCα重叠时，可以观察到PKCα中的Tyr-195被rabphilin 3A-C2B中的Phe-579取代(D类). 这种细微的变化可能会阻碍Phe-579与PtdIn的磷酸盐4和5之间形成2 H键(4,5)P（P）2，从而解释了C2B结构域为什么表现出非常低的结合亲和力，并确认在该位置需要Tyr残基。
PKCα-C2结构域的膜对接模型。
cPKC是参与多种信号传递过程的激酶。这项工作的结果使我们能够确定控制PtdIn的分子决定簇(4,5)P（P）2-C2域相互作用，显示出与质膜的意外相互作用机制，因为芳香族和阳离子残基能够直接与PtdIn相互作用(4,5)P（P）2部分(). 这项工作的另一个相关发现是证明，至少PKCα的C2结构域与PtdSer和PtdIns特异性相互作用(4,5)P（P）2通过2个独立的图案()，这使得域可以通过2个点锚定在膜中，这对其在膜界面中的正常功能至关重要。最后，PtdIns的共识站点(4,5)P（P）2-确定了结合（多基区或β3–β4沟）。该位点不仅存在于cPKC的C2结构域中，也存在于拓扑I的许多其他C2结构域，如synaptotagmin、rabphilin 3A和PI3KC2α。由于这些其他蛋白质在神经元传递、囊泡融合或细胞信号传导中发挥着重要作用，需要进一步的研究来阐明PtdIn的作用(4,5)P（P）2在他们参与的细胞过程中。
