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方法分子生物学。作者手稿；2017年11月7日PMC提供。
以最终编辑形式发布为：
方法分子生物学。2016; 1421: 137–151.
数字对象标识：10.1007/978-1-4939-3591-8_12
预防性维修识别码：项目编号：5673679
美国国立卫生研究院：NIHMS916519
PMID：26965263

使用CLIP-Seq对RNA-蛋白质相互作用的基因组全谱分析

谢丽尔·斯托克和西卡·郑
版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

紫外交联免疫沉淀（CLIP）是一种越来越流行的研究组织和细胞中蛋白质与RNA相互作用的技术。整个细胞或组织受到紫外线照射，在RNA和密切接触的蛋白质之间产生共价键。在部分核糖核酸酶消化后，针对RNA结合蛋白（RBP）或蛋白质表位标签的抗体用于免疫沉淀蛋白质-RNA复合物。经过严格清洗和凝胶分离后，RBP–RNA复合物被切除。RBP经蛋白酶消化后可纯化结合RNA。RNA的逆转录和cDNA文库的高通量测序目前常用于全基因组范围内识别蛋白质结合RNA。紫外线照射可导致交联位点的cDNA截短和/或突变，这使测序文库与参考基因组的比对和交联位点的鉴定变得复杂。同时，由于蛋白质的不完全消化，交联RBP的一个或多个氨基酸可以继续附着在其结合RNA上。因此，逆转录酶可能无法读取交联位点，并产生以交联核苷酸结尾的cDNA。这是利用一种不同的CLIP方法来确定核苷酸分辨率下的交联位点。这种方法，单个核苷酸解析CLIP（iCLIP）循环cDNA以捕获截断的cDNA，并提高将测序适配器连接到文库的效率。在这里，我们描述了iCLIP的详细过程。

关键词：紫外线交联免疫沉淀、RNA结合蛋白、免疫沉淀、RBP-RNA复合物、iCLIP

1引言

RNA–蛋白质相互作用在转录后调控中起着重要作用[1]. 目前，不同的方法研究不同分辨率的RNA-RBP相互作用。电泳迁移率变化分析（EMSA）是一种简单而敏感的技术，用于识别RNA-RBP相互作用，其基础是观察到RNA-RBP复合物在天然凝胶中的迁移速度慢于单独的RNA。EMSA有许多局限性，包括（1）电泳过程中可能出现复杂的拆卸和组装，（2）确定相互作用核苷酸的序列分辨率差，以及（3）体内细胞上下文丢失[2]. 传统的RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）可以定量识别细胞提取物中与RBP结合的RNA靶点。使用靶向RBP的抗体免疫沉淀内源性RNA-蛋白质复合物，然后通过微阵列或高通量测序纯化和分析结合RNA。当额外的RBP与检测的RBP共同免疫沉淀时（例如作为更大RNP复合体的一部分），RIP无法区分间接结合的RNA[三]. 细胞裂解物中混杂的蛋白质–RNA结合也是假阳性的重要来源。

为了规避先前开发的方法的局限性，开发了交联免疫沉淀（CLIP）。使用紫外线照射结合免疫沉淀法的交联RNA-蛋白质复合物使我们能够在体内以高分辨率和特异性绘制与RNA结合蛋白结合的RNA序列[4——9]. RNA-RBP复合物通过紫外线辐射交联，用RNase部分消化，并通过免疫沉淀纯化；然后在蛋白酶消化后提取RNA，连接到适配器，反转录到cDNA，并测序。Kirk Jensen和Jenej Ule于2003年首次将CLIP应用于脑内RNA结合蛋白Nova的研究[4]. 他们能够识别340个与Noval交联的新RNA标签，其中18个位于替代外显子两侧，表明Noval在替代剪接中的作用[4]. 此后，已经开发了各种CLIP方法，以将RNA-蛋白结合的分辨率提高到接近核苷酸的水平，从而不仅可以鉴定特定的结合位点，还可以鉴定RNA-蛋白结合的特定基序或模式[6]。

CLIP实验通常具有有限的产率，部分原因是使用UV 254nm的低效交联。为了提高RNA回收率，Thomas Tuschl的团队开发了可光活化的核糖核苷增强交联和免疫沉淀（PAR-CLIP）。PAR-CLIP用光活化核苷（如4-硫代尿苷（4-SU）和6-硫代鸟嘌呤核苷（6-SG））标记活细胞，这些核苷在365nm紫外线照射前并入新生RNA[8,10]. 当交联时，4-SU或6-SG的加入分别导致U到C和G到A突变，使研究人员能够使用突变分析来识别交联位点并过滤噪声。提高交联效率和分辨率是PAR-CLIP的优点。然而，PAR-CLIP依赖于代谢标记，这对体内应用有固有的偏见和困难。

由Ule小组开发的CLIP或iCLIP的第三种变体允许在近核苷酸水平上识别交联位点(图1) [11]. 与其他在反转录前将适配器连接到RNA的CLIP方法不同，iCLIP在反转录后引入循环步骤，将可切割的5′端适配器连接到cDNA的3′端[12]. 由于逆转录酶通常停在交联位点，不一定延伸到其他CLIP方法使用的3′适配器，因此循环化允许iCLIP捕获这些截断的cDNA。可切割的5′端适配器包括随机条形码，以消除PCR伪影。iCLIP成功用于全球识别与HNRPNPC、TDP-43、FUS和TIA1/TIAL1结合的RNA[12——15]。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms916519f1.jpg

iCLIP的示意图。RNA结合蛋白（RBP）和RNA在体内使用紫外线辐射共价结合（步骤1）。然后将潜在的RBP–RNA复合物一起纯化（步骤2-5）。L3连接子适配器连接到3′端，允许逆转录的序列特异性启动，5′被放射性标记（步骤6和7）。使用SDS-PAGE和湿膜转移从游离RNA中纯化RBP–RNA复合物（步骤8）。使用蛋白酶K从膜中回收复合物（步骤9）。反转录截断剩余的多肽并引入两个可切割的适配区和一个条形码（步骤10）。使用Urea-PAGE进行大小选择，在cDNA循环之前去除RT引物（步骤11-13）。线性化生成PCR扩增模板（步骤14和15）。高通量测序生成条形码序列紧邻输入cDNA最后一个核苷酸之前的读取（步骤16）。该核苷酸是交联核苷酸上游的一个位置，可以高分辨率识别RBP–RNA结合位点

尽管CLIP具有强大的功能，但在分析任何CLIP结果时都应谨慎，尤其是由于序列相关的UV交联偏差。RBP是多功能的。为了了解它们的完整功能，需要其他基因组方法与CLIP结合，以全面确定其功能相关的RNA靶点。

2材料

除非另有说明，否则在室温下用超纯无菌水制备所有试剂。除非另有规定，否则应在室温下储存储备溶液和缓冲液。

2.1缓冲器组件

  1. TE缓冲液：1 M Tris–HCl pH 8.0，0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）pH 8.02O。
  2. 溶解缓冲液：50 mM Tris–HCl pH 7.4，100 mM NaCl，1%Igepal CA-630，0.1%SDS，0.5%脱氧胆酸钠，当天添加1/100体积的蛋白酶抑制剂鸡尾酒套装III。对于组织，使用1/1000抗酶（请参见注释1).
  3. 高盐洗涤：50 mM Tris–HCl pH 7.4，1 M NaCl，1 mM EDTA，1%Igepal CA-630，0.1%SDS，0.5%脱氧胆酸钠。
  4. PNK缓冲液：20 mM Tris–HCl，pH 7.4，10 mM MgCl20.2%吐温-20。
  5. 5×PNK pH 6.5缓冲液：350 mM Tris–HCl pH 6.5，50 mM MgCl2，5mM二硫苏糖醇（DTT）。冷冻缓冲液的等分试样。避免冻融(看见注释2).
  6. 6 4×连接缓冲液：200 mM Tris–HCl pH 7.8，40 mM MgCl2，4 mM二硫苏糖醇，冷冻等分缓冲液。避免冻融。
  7. PK缓冲液：100 mM Tris–HCl，pH 7.4，50 mM NaCl，10 mM EDTA。
  8. PK缓冲液+7 M尿素：10 mM Tris–HCl pH 7.4，50 mM NaCl，10 mM EDTA，7 M尿素。

2.2紫外线交联和免疫沉淀

  1. Stratalinker UV交联剂（加利福尼亚州拉霍拉市Stratagene）。
  2. 4-硫脲（西格玛，密苏里州圣路易斯）（请参见注释三).
  3. Protein G Dynabeads（生命科技，加利福尼亚州卡尔斯巴德）。
  4. Protein A Dynabeads（生命科技）。
  5. 蛋白酶抑制剂鸡尾酒套装III（Calbiochem/Merck）。
  6. 反堕胎（生命技术）。
  7. RNase I（生命技术）。
  8. Turbo DNase（生命技术）。
  9. T4 PNK加上10×PNK缓冲液（NEB、Ipswich、MA）。
  10. RNasin（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。
  11. Proteus澄清微型旋转柱（德克萨斯州休斯顿Generon）。
  12. T4 RNA连接酶I（NEB）。
  13. 预denylated适配器L3-App（IDT，rAppAGATCGGAA-CAGCGTTCAG/ddC/）。
  14. ATP[γ-32P] （马萨诸塞州沃尔瑟姆珀金·埃尔默）。

2.3免疫印迹成分

  1. 4–12%NuPAGE凝胶（生命科技）。
  2. 电泳室（生命科技）。
  3. Novex湿转印设备（生命科技）。
  4. LDS-4×样品缓冲器（生命技术）。
  5. 预染色蛋白质标记物（宾夕法尼亚州匹兹堡的发酵剂）。
  6. 硝化纤维膜（VWR、Radnor、PA）。
  7. Protran BA85。
  8. XCell II吸墨剂海绵垫（Life Technologies）。
  9. 20×传输缓冲器（生命科技）。
  10. 20×MOPS-SDS运行缓冲器（生命科技）。
  11. 沃特曼滤纸（GE Healthcare，宾夕法尼亚州匹兹堡）。
  12. 电影。

2.4 RNA分离成分

  1. 蛋白酶K（Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆）。
  2. 19G注射器针头。
  3. 苯酚/氯仿pH 6.7（西格玛）（请参见注释4).
  4. 锁相凝胶重管（VWR）。
  5. 甘蓝（琥珀色）。
  6. 3 M醋酸钠pH 5.5（生命科技）。
  7. 热混合器（Eppendorf）。

2.5逆转录

  1. PCR试管。
  2. dNTP（Promega）。
  3. 上标III（生命科技）。
  4. 5×一线缓冲器（生命科技）。
  5. DTT（生命技术）。
  6. 1 M HEPES pH值7.3（Thermo Scientific）。
  7. TE缓冲器。
    • R#片段序列（N表示任何核苷酸）。
    • Rt1剪辑：/5Phos/NNAACCNNNAGATCGGAAG AGCGTGgatcCTGAACCGC
    • Rt2clip:/5Phos/NNACAANNAGATCGGAAG AGCGTGgatcCTGAACCGC
    • Rt3clip:/5Phos/NNATTGNNAGATCGAGAGAGAGG AGCGTGatcCTGAACCGC
    • Rt4剪辑：/5Phos/NNAGGTNNNAGATCGGAAG AGCGTGgatcCTGAACCGC
    • Rt6剪辑：/5Phos/NNCCGGNNNAGATCGGAAG AGCGTGgatcCTGAACCGC
    • Rt7剪辑：/5Phos/NNCTAANNNAGATCGGAAG AGCGTGgatcCTGAACCGC
    • Rt8剪辑：/5Phos/NNCATTNNNAGATCGGAAGAGAGAG AGCGTGatcCTGAACCGC
    • Rt9剪辑：/5Phos/NNGCCANNNAGATCGGAAG AGCGTGatcCTGAACCGC
    • Rt11clip:/5Phos/NNGGTTNNAGATCGGAAG AGCGTGgatcCTGAACCGC
    • Rt12clip:/5Phos/NNGTGGNNNAGATCGGAAG AGCGTGgatcCTGAACCGC
    • Rt13clip:/5Phos/NNTCCGNNNAGATCGAAG AGCGTGgatcCTGAACCGC
    • Rt14剪辑：/5Phos/NNTGCCNNNAGATCGGAAG AGCGTGgatcCTGAACCGC
    • Rt15clip:/5Phos/NNTATTNNAGATCGGAAGAGAGAGG AGCGTGatcCTGAACCGC
    • Rt16剪辑：/5Phos/NNTTAANNNAGATCGGAAGCGAGAGCGTGatc CTGAACCGC

2.6 cDNA分离

  1. 2×TBE-尿素装载缓冲器（生命科技）。
  2. 6%TBE-尿素（预制凝胶）（生命科技）。
  3. 低分子量标记（NEB）。
  4. TBE Running buffer（生命科技）。
  5. SYBR Green II（生命技术）。
  6. 玻璃预滤器（沃特曼）。
  7. 重锁相凝胶（VWR）。
  8. Costar SpinX柱（纽约州康宁市康宁公司）。

2.7 5′端结扎术

  1. 10×CircLineBuffer（英国剑桥Cambio）。
  2. CircLigase II（坎比奥）。
  3. 切割：GTTCAGGATCCACGACGCTCTTCaaaa[8]。
  4. 氯化锰2（坎比奥）。
  5. Bam HI（宾夕法尼亚州匹兹堡Fermentas）。
  6. 快速消化缓冲液（宾夕法尼亚州匹兹堡的发酵剂）。

2.8 PCR扩增

  1. Accruprime Supermix I（生命技术）。
  2. SYBR green I（生命科技）。
  3. P5Solexa:AATGATACGGCGACCGATCTACCTC TTTCCCTACACGCGCTTCCGATCT[4,11]。
  4. P3Solexa:CAAGCAGACGGVATACGAGATCGGTCTC GGCATCCTCTGAACCTCTTCCGATCT公司[4,11]。

2.9 qPCR定量

  1. Accuprime Supermix I（生命科技）。
  2. PhiX控制库（RNAseq/ChIPseq）（加利福尼亚州圣地亚哥Illumina）。
  3. 铂金Taq Mastermix（加州卡尔斯巴德生命科技公司）。
  4. DLP公司
    • [6FAM]（飞行管理模块）
    • CCCTACACGACCTCTTCCGATCT
    • 【TAMRA】[11]。
  5. 底漆1
    • AATGATACGGCGACCGATCA公司[11]。
  6. 底漆2
    • CAAGCAAGACGCATACGAGAC公司[11]。

2.10 String-Urea iCLIP协议的缓冲区

  1. 尿素裂解缓冲液：50 mM Tris–HCl pH 7.4，6 M尿素，1%十二烷基硫酸钠，25%多溴联苯。
  2. T-20缓冲液：50 mM Tris–HCl pH 7.4、150 mM NaCl、0.5%吐温20和0.1 mM EDTA。

2.11严格的区域iCLIP

  1. Dynabeads抗体偶联试剂盒（Life Technologies）。
  2. 核糖核酸酶抑制剂中的超酶（生命技术）。
  3. NuPAGE样品还原剂（Life Technologies）。
  4. NuPAGE抗氧化剂（生命科技）。
  5. 线性丙烯酰胺（生命科技）。

3方法

3.1 UV-C交联

  1. 在10厘米的培养皿中培养贴壁细胞后，取出培养基，添加6毫升冰镇PBS并放在冰上。
  2. 取下盖子，用150 mJ/cm照射电池2（需要针对不同的蛋白质进行优化）在Stratalinker 2400中在254nm处（请参见注释5).
  3. （可选）将未经辐照的细胞作为交联的阴性对照。
  4. 用细胞提升器刮去细胞，并将细胞悬浮液转移到三个2mL的微管中。800×离心机克在4°C下放置1分钟，使细胞颗粒化，然后去除上清液。
  5. 在干冰上快速冷冻细胞颗粒储存在−80°C下，直到再次使用.

3.2 4-硫脲标记和UV-A交联（UV-C的替代品）

  1. 将50μL 4SU（原液浓度100 mM 4SU）添加到10 cm的细胞培养板中，该培养板位于添加FBS、PenStrep的10 mL DMEM中，以获得最终浓度为500μM 4SU。
  2. 或者添加10μL 4-硫代尿苷（储备浓度：100 mM），以获得最终浓度100μM 4SU（请参见注释6).
  3. 用4-硫代尿苷在500μM下培养细胞60分钟，或在100μM下孵育8小时：然后检查细胞的活力。将未与4SU孵育的细胞作为阴性对照。
  4. 吸取培养基，向10 cm培养板中生长的细胞中添加6 mL冰镇PBS。取下盖子并放在冰上。
  5. 用2×400 mJ/cm一次照射两次2在Stratalinker 2400中使用365 nm灯泡。
  6. 用细胞提升器刮去细胞。
  7. 将细胞悬液转移到三个2 mL微管中。800×离心机克在4°C下放置1分钟，使细胞颗粒化，然后去除上清液。
  8. 在干冰上快速冷冻细胞颗粒储存在−80°C下，直到再次使用.

3.3免疫沉淀珠的制备

  1. 每次实验向新鲜的微管中添加100μL蛋白G发电机珠。
  2. 用900μL裂解缓冲液（不含蛋白酶抑制剂）洗涤珠子两次。
  3. 每次实验用2-10μg抗体在100μL裂解缓冲液中重新悬浮小球（请参见注释7).
  4. 在室温下旋转管子30–60分钟。
  5. 用900μL裂解缓冲液清洗3次，并保留在最后一次清洗中，直到准备好进行免疫沉淀。

3.4细胞裂解和部分RNA消化

  1. 将细胞颗粒重新悬浮在1mL裂解缓冲液中（含1:100蛋白酶抑制剂鸡尾酒套装III），并转移到1.5mL微管中。为两个实验样品和适当的对照准备足够的裂解物（请参见笔记8和9).
  2. 样品的超声处理（注：可选）。
  3. 选项1：使用探头声波仪在冰上对样品进行声波检测。探针应距离管子底部约0.5 cm，不要接触管子侧面，以避免起泡。以5 dB的频率发出两次10 s的声音。通过超声波H清洁探针2O样品处理前后。
  4. 选项2：使用Biolruptor plus进行五个循环，在低强度下交替开启30秒或关闭30秒。
  5. 在PBS中制备两份RNase I稀释液。高RNase I为1:50，低RNAseI为1:250。这需要仔细优化（请参见注释10).
  6. 向细胞裂解物中加入10μL低或高RNAse I稀释液和2μL Turbo DNase，并立即将样品置于37°C下，以1100 rpm振荡3分钟。随后立即转移到冰上>3分钟。
  7. 22000×离心10分钟克并在4°C下清除裂解液。仔细收集上清液。
  8. 可选：将500μL裂解液装入Proteus澄清微型旋转柱。22000×离心1分钟克温度为4°C。将流通的液体转移到新的管道中，并放置在冰上。对其余的裂解液重复上述步骤，并合并各部分。

3.5免疫沉淀

  1. 将裂解液添加到珠子中，并在4°C下旋转1小时或过夜。
  2. 放在磁铁上，丢弃上清液，用高盐清洗三次（在4°C下旋转第三次清洗至少1分钟）（请参见注释11).
  3. 用PNK缓冲液冲洗两次，然后放在1mL PNK缓冲溶液中，继续进行3′端脱磷酸步骤。

3.6 RNA 3′端去磷酸化

  1. 丢弃上清液，并将珠子重新悬浮在20μL以下混合物中：4μL 5×PNK pH 6.5缓冲液、0.5μL PNK、0.5μL RNasin和15μL H2O。
  2. 在温度为37°C、转速为1100 rpm的热混合器中培养20分钟。
  3. 用PNK缓冲液清洗。
  4. 用高盐水洗（在冷藏室中旋转清洗至少1分钟）。
  5. 用PNK缓冲液清洗两次。

3.7 L3适配器连接

  1. 小心去除上清液，并将珠子重新悬浮在20μL以下混合物中：8μL H2O、 5μL 4×结扎缓冲液、1μL RNA连接酶、0.5μL RNasin、1.5μL预腺苷酸适配器L3-App（20μM）和4μL PEG400。
  2. 我在16°C的温度下以1100 rpm的速度在热混合器中通过夜。
  3. 添加500μL PNK缓冲液。
  4. 用高盐缓冲液洗涤两次，每次洗涤在冷藏室中旋转5分钟，用PNK缓冲液洗涤二次。

3.8 RNA 5′末端标记

  1. 去除上清液，并在4μL热PNK混合物中重新悬浮珠子：0.2μL PNK，0.4μLγ-[32P] -ATP、0.4μL 10×PNK缓冲液和3μL H2O。
  2. 在温度为37°C、转速为1100 rpm的热混合器中培养5分钟。丢弃上清液。
  3. 去除作为放射性废物的上清液，添加20μL 1×NuPAGE负载缓冲液（请参见注释12).
  4. 在70°C的热混合器上培养10分钟。
  5. 放在磁铁上沉淀珠子，收集上清液并将其装在凝胶上。

3.9 SDS-PAGE和硝化纤维素转移

  1. 将样品装入4–12%NuPAGE Bis-Tris凝胶中。同时加载5μL预先保存的蛋白质大小标记。使用500 mL 1×MOPS流动缓冲液。
  2. 在180 V下运行凝胶50分钟。
  3. 切断染料的前端，将其作为放射性固体废物丢弃。
  4. 使用Novex湿式转移装置将蛋白质–RNA复合物从凝胶转移到硝化纤维膜。
  5. 在30 V电压下传输1小时并过夜。
  6. 转移后，在PBS缓冲液中冲洗膜，然后用纱布包裹膜，并在−80°C的温度下将其暴露于膜中。暴露30分钟、1小时和过夜。

3.10 RNA分离

  1. 在低核糖核酸酶状态下会看到涂片，而不是在高核糖核酶状态下。使用自射线照片作为切割膜相应区域（通常比预期分子量高20–60 kDa）的掩模，从低RNase条件下分离蛋白质–RNA复合物。切成许多块，放入1.5毫升的微管中（请参见注释13).
  2. 在200μL PK缓冲液中加入10μL蛋白酶K，确保所有片段都浸没。将样品在37°C下以1100 rpm的转速摇晃20分钟。
  3. 添加200μL PK缓冲液+7 M尿素，并在37°C下以1100 rpm的转速孵育20分钟。
  4. 收集溶液，并将其与400μL苯酚/氯仿（pH 6.7）一起添加到2 mL锁相凝胶重管中（见注释 14).
  5. 在30°C下以1100 rpm摇晃培养5分钟。在全速和室温下旋转5分钟，分离相位。
  6. 将水层转移到新管中。注意不要用吸管接触凝胶基质。可选：再次旋转1分钟，转移到新的试管中。
  7. 通过添加0.75μL乙醇蓝和40μL 3 M醋酸钠（pH 5.5）沉淀。然后混合并添加1 mL 100%乙醇，再次混合并在−20°C下放置过夜。
  8. 在4°C下以15000 rpm离心20分钟。取出上清液，用0.9 mL 80%乙醇清洗颗粒，并旋转5分钟（请参见注释15).
  9. 5μL H中的再悬浮颗粒2O并转移至PCR管。

3.11逆转录

  1. 向再悬浮颗粒中添加1μL引物Rt#夹子（0.5 pmol/μL）和1μL dNTP混合物（10 mM）。对于每个实验或复制，使用包含单个条形码序列的不同Rclip引物（请参见注释16).
  2. 在70°C下培养5分钟。冷却至25°C。保持在25°C，直到加入RT混合物。
  3. 将RT混合物添加到再悬浮颗粒中：7μL H2O、 4μL 5×第一链缓冲液、1μL 0.1 M DTT、0.5μL RNasin和0.5μL上标III。
  4. 运行RT程序：25°C持续5分钟，43°C持续20分钟，50°C持续40分钟，80°C保持5分钟，4°C保持。
  5. 添加1.65μL 1 M NaOH，并在98°C下培养20分钟。然后添加20μL 1 M HEPES-NaOH（pH 7.3），以消除强标记样品的放射性，并防止RNA干扰后续反应。
  6. 添加350μL TE缓冲液、0.75μL乙醇蓝和40μL 3 M醋酸钠（pH 5.5）。混合，然后添加1 mL 100%乙醇。再次混合并在−20°C下沉淀过夜。

3.12 cDNA的凝胶纯化

  1. 在4°C下以15000 rpm离心15分钟。去除上清液，并用500μL 80%乙醇洗涤沉淀。再次离心，去除上清液，并在6μL H中重新悬浮颗粒2O。
  2. 向cDNA中添加6μL 2×TBE-尿素负载缓冲液。推荐：向DNA大小标记添加6μL加载缓冲液。
  3. 加载前，将样品加热至80°C 5分钟。可选：每个样品之间留出一条车道，以避免交叉污染。
  4. 制备800 mL 1×TBE流动缓冲液，用200 mL填充上室，用600 mL填充下室。在加载12μL每个样品之前，用P1000移液管将剩余的尿素从微孔中冲洗出来。将标记加载到最后一条车道。
  5. 将6%的TBE-尿素凝胶在180 V下运行40分钟，直到下层染料（深蓝色）接近底部。
  6. 切断含有尺寸标记的最后一行，并将其在20 mL TBE缓冲液中与2μL SYBR绿色II轻轻摇动培养10分钟。用TBE清洗一次，然后用100%比例的紫外线透照法进行可视化，并作为面罩指导从凝胶的其余部分中切除cDNA。
  7. 完整的L3-App和引物序列总共占cDNA的52 nt。切割三条带：70–80 nt、80–100 nt和100–150 nt。
  8. 向每个凝胶片中添加400μL TE，并用1 mL注射器柱塞压碎凝胶片。
  9. 在37°C下以1100 rpm的速度摇动培养1小时，放置在干冰上2分钟，然后在37°C.下以1100rpm的速度放置1小时。将液体部分转移到Costar SpinX柱，在其中放置两个1厘米的玻璃预滤器。
  10. 全速离心1分钟。收集溶液并将其与400μL DNA苯酚/氯仿一起添加到2 mL锁相凝胶重管中。
  11. 在30°C下以1100 rpm的转速摇晃培养5分钟。在室温下全速旋转5分钟，分离相位。
  12. 将水层转移到新管中。再次离心1分钟，然后转移到新管中。
  13. 添加1μL乙醇蓝和40μL 3 M醋酸钠，pH 5.5，混合。然后添加1 mL 100%乙醇。再次混合并在−20°C下沉淀过夜。

3.13引物与cDNA 5′端的连接

  1. 离心沉淀，使cDNA颗粒化。用500μL 80%乙醇清洗颗粒。在8μL结扎混合物（6.5μL H）中再悬浮颗粒2O、 0.8μL 10×CircLigase缓冲液II，0.4μL 50 mM MnCl2，0.3μL环连接酶II）。
  2. 转移PCR管并在60°C下培养1小时。
  3. 添加30μL退火混合物：6μL H2O、 3μL快速消化缓冲液，1μL 10μM Cut_oligo。使用程序95°C退火寡核苷酸2分钟，从95°C开始连续20 s循环，并将1°C降至25°C，保持在25°C。
  4. 添加2μLl BamHI并在37°C下孵育30分钟，然后在80°C下孵化5分钟。
  5. 添加350μL TE、0.75μL乙醇蓝和40μL 3 M醋酸钠（pH 5.5），并混合。然后加入1 mL 100%乙醇。再次混合并在−20°C下沉淀过夜。

3.14聚合酶链式反应扩增

  1. 离心沉淀并用500μL 80%EtOH清洗。21μL H中的再悬浮2O。
  2. 制备PCR混合物：1μL cDNA、0.25μL引物、5μL Accuprime Supermix I和3.75μL H2O。
  3. 运行PCR反应：94℃2 min，[94℃15 s，65℃30 s，68℃30 s]25–35个循环，68℃3 min，25℃保持。
  4. 将8μL PCR产物与2μL 5×TBE加载缓冲液混合，加载到6%TBE凝胶上，并用SYBR绿色I染色（请参见注释16).

3.15 qPCR定量

  1. 在96-well板中设置系列稀释液（1:10至1:10000）。Rclip引物中的条形码允许多路复用。
  2. 制备主混合物：10μL Invitrogen Platinum qPCR Supermix w/ROX、0.5μL DLP oligo、0.6μL Primer 1（10μM）、0.6微升Primer 2（10μM）和6.3微升H2O.在qPCR板中每孔加入18μL。
  3. 从系列稀释液中添加2μL模板，并用胶膜密封板。
  4. 运行以下qPCR程序（正常设置，检测器FAM-TAMRA，被动参考ROX）：54°C 2 min，94°C 10 min，[94°C 15 s，62°C 1 min，72°C 30 s]40个循环。
  5. 在对数刻度上绘制标准溶液的浓度与Ct值的关系图，并在图上画一条线。使用标准线，通过Ct值获得未知样品的浓度。
  6. 将iCLIP库稀释至10 nM，提交10μL进行测序，并保存剩余的样品。

3.16高通量排序

  1. 可以使用标准Illumina协议对库进行排序。建议使用50-nt单端管路。

致谢

这项工作得到了NIH拨款R00 MH 096807的支持。

脚注

1不含蛋白酶抑制剂的溶解缓冲液可以提前制作。然而，应在使用当天添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒III或抗酶。

2高浓度DTT会降低IP效率，因此使用较低的DTT来提高蛋白质复合物的回收率。

三与4-硫代尿苷的交联允许与UV-A光进行交联，如光活化核糖核酸增强CLIP（PAR-CLIP）所示。添加是可选的，用于增强某些蛋白质的交联。4-硫脲是光敏的，添加后应立即将细胞放回培养箱中。

4在pH值为6.7的条件下使用苯酚/氯仿，以减少苯酚阶段的DNA-RNA杂交。

5交联取决于你正在使用的蛋白质和使用的方法，应该进行优化。然而，增加交联剂量可能通过破坏RNA而扭曲文库制备。

6光反应性核苷对细胞有毒。您应该在使用前确定最佳的孵化时间。

7抗体的添加量取决于质量和纯度，需要在使用前进行优化。

8使用Nanodrop 2000c或Bradford分析法测量蛋白质浓度。将样品标准化至最低浓度。建议使用2 mg/mL蛋白质。

9建议的控制措施包括细胞中无RBP、无交联或IP期间无抗体。

10在裂解缓冲液中用0.1%SDS长时间孵育后，RNase I已显示失活。

11从上清液中保存15μL，以监测贫化效率。

12SDS-PAGE凝胶在运行过程中会改变其pH值，这可能导致RNA的碱性水解。当与适当的缓冲液一起使用时，NuPAGE系统将pH值保持在7左右。

13要确定蛋白-RNA的特异性，您需要检查高RNase I状态。放射性波段应高于MW约5kDa。阴性对照应无波段。低核糖核酸酶I的带应该是弥散的。RNA通常约为20 kDa。建议将蛋白质的分子量降低到预期值以上15–80 kDa。

14尽量不要打乱小球。如果你打乱了小球，重复旋转。在工作台上静置3分钟，打开盖子晾干。

15在对照组和实验样品上使用不同的Rtclip引物（Rt1clip–Rt16clip）。每个Rtclip包含一个4 nt条形码序列，该序列因两个核苷酸的不同而不同，以确保突变不会将一个条形码转换为另一个条形码。条形码使用户能够消除PCR伪影，并控制多路复用过程中的交叉污染。

16建议在指定的工作台上进行cDNA工作。避免将PCR中的cDNA带到使用iCLIP RNA的区域。

工具书类

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