iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution

doi:10.3791/2638

.2011年4月30日：（50）：2638。

doi:10.3791/2638。

iCLIP——蛋白质-RNA相互作用与单个核苷酸分辨率的转录全图谱

朱利安·科尼格¹, 凯西·扎尔纳克, 格雷戈·罗特, 托马斯·柯克, 梅利斯·凯伊奇, 布拉兹·祖潘, 丹尼尔·透纳, 尼古拉斯·卢斯科姆, 杰内·乌莱

附属公司

PMID： 21559008
预防性维修识别码：项目经理3169244
内政部： 10.3791/2638

iCLIP——蛋白质-RNA相互作用与单个核苷酸分辨率的转录全图谱

朱利安·科尼格等。 J签证费用. 2011.

.2011年4月30日：（50）：2638。

doi:10.3791/2638。

作者

朱利安·科尼格¹, 凯西·扎尔纳克, 格雷戈·罗特, 托马斯·柯克, 梅利斯·凯伊奇, 布拉兹·祖潘, 丹尼尔·透纳, 尼古拉斯·卢斯科姆, 杰内·乌莱

附属

¹医学研究委员会分子生物学实验室。

PMID： 21559008
预防性维修识别码：项目经理3169244
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摘要

转录物上RNA结合蛋白（RBP）的独特组成和空间排列指导转录后调控的各个方面。因此，在分子水平上理解转录调控的一个重要步骤是获得RBP结合位点的位置信息。蛋白质与RNA的相互作用可以用生物化学方法研究，但这些方法不能解决天然细胞环境中的RNA结合问题。最初尝试研究细胞环境中的蛋白-RNA复合物，采用亲和纯化或免疫沉淀结合差异显示或微阵列分析（RIP-CHIP）。这些方法易于识别间接或非生理性相互作用。为了提高特异性和位置分辨率，引入了一种称为CLIP（UV交联和免疫沉淀）的策略。CLIP结合了蛋白质和RNA分子的UV交联和严格的纯化方案，包括变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。与高通量测序技术相结合，CLIP已被证明是在全基因组范围内研究蛋白质-RNA相互作用的强大工具（称为HITS-CLIP或CLIP-seq）。最近，PAR-CLIP被引入，它使用光活性核糖核苷类似物进行交联。尽管获得的数据具有高度的特异性，但CLIP实验通常会生成序列复杂度有限的cDNA文库。这部分是由于共纯化RNA的数量有限，以及文库制备所需的两个低效RNA连接反应。此外，引物延伸分析表明，许多cDNA在交联核苷酸处过早截断。在标准CLIP文库制备协议中，此类截短的cDNA会丢失。我们最近开发了iCLIP（个体核苷酸解析CLIP），它通过用更有效的分子内cDNA循环取代其中一个低效的分子间RNA连接步骤来捕获截断的cDNA（图1）。重要的是，对截短的cDNA进行测序可以深入了解核苷酸分辨率下交联位点的位置。我们成功应用iCLIP在全基因组范围内研究hnRNP C颗粒组织，并评估其在剪接调控中的作用。

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