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.2012年3月至4月；3(2):159-77.
doi:10.1002/wrna.1103。 Epub 2011年12月27日。

利用PAR-CLIP识别RNA-蛋白质相互作用网络

曼纽尔·阿斯卡诺 1, 马库斯·哈夫纳, 帕沃尔·塞坎, 斯蒂芬·格斯特伯格（Stefanie Gerstberger）, 汤玛士·涂许尔
附属公司
审查

利用PAR-CLIP识别RNA-蛋白质相互作用网络

曼纽尔·阿斯卡诺等。 Wiley Interdiscip Rev RNA. 2012年3月至4月.

摘要

所有信使核糖核酸分子都受到一定程度的转录后基因调控（PTGR），涉及剪接、切割和多聚腺苷酸化、编辑、转运、稳定性和翻译的序列依赖性调节。最近引入的深测序技术使新方法得以发展，用于广泛绘制RNA-结合蛋白（RBP）及其RNA靶位点之间的相互作用位点。在这篇文章中，我们回顾了适用于大规模鉴定靶RNA结合位点和相应RNA识别元件的交联和免疫沉淀（CLIP）方法。CLIP方法有可能在单个实验中检测数十万个结合位点，尽管信号与噪声的分离可能具有挑战性。因此，每种CLIP方法都制定了不同的策略来区分真实目标和背景。我们重点研究光活化核糖核苷增强型CLIP，它依赖于细胞内将光活化核糖核苷类似物并入新生转录物，并在交联后产生特征序列变化，从而促进信号与噪声的分离。通过对成熟和初级mRNA转录物中结合位点的位置和分布的精确了解，可以对受检RBP的细胞定位和调节功能进行关键性研究。当与其他测量转录物和蛋白质丰度的全系统方法相结合时，转录组中高分辨率RBP结合位点图的生成将拓宽我们对PTGR的理解，从而为干扰这些过程的遗传疾病的治疗提供新的策略。

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数字

图1
图1
RNA结合蛋白（RBP）及其RNA-结合域（RBD）。（a） 显示了约400种人类蛋白质中最常见的RBD。域名符合Pfam命名法。包含一种以上RBD的RBP将被多次计数。（b） 进一步解决了RBP的域组成问题。顶部面板显示RBP中相同RBD的单一与重复出现。中间面板解析RBP中RBD的组合，底部面板指示有多少具有RBD至少一个成员的RBP与另一个酶活性蛋白结构域（如核酸酶、解旋酶）或与蛋白-蛋白相互作用结构域组合。底部面板中排除了无辅助RBD的核糖核酸酶和解旋酶。
图2
图2
光活化核糖核苷增强交联和免疫沉淀（PAR-CLIP）及其他CLIP方法概述。（a） 高通量测序CLIP（HiTS-CLIP，左面板）、单个核苷酸分辨率CLIP（iCLIP，中面板）和单个核苷酸分辨率交联亲和纯化（iCLAP，右面板）利用254 nm的短波紫外线（UV）将RNA交联到相互作用的RNA-结合蛋白（RBP）在活细胞或新鲜组织中溶解。（b） PAR-CLIP首先将可光活化的硫代核糖核苷并入新生转录物中，然后使用长波长波UV-365进行交联。RNA-RBP复合物的分离可以通过免疫沉淀（IP）（PAR-CLIP、HiTS-CLIP和iCLIP）或链霉亲和素/IMAC双亲和纯化（iCLAP）实现。与iCLAP类似，cDNA的交联和分析（CRAC）方法（未显示）利用RBP的双亲和富集，其中在变性条件下进行第二次纯化。3′和5′适配器的添加因CLIP方法而异。iCLIP和iCLAP方法循环ssDNA中间产物，以捕获交联位点处反转录（RT）过早终止产物生成的序列。在PAR-CLIP中，通过硫代核糖核苷交联RNA进行RT，然后进行聚合链反应（PCR）扩增，导致特征突变[T到C（当使用4-硫代尿苷（4SU）时）和G到a（当使用6-硫代鸟苷（6SG）时]。对这些突变进行评分会导致交联阅读簇与来源于非交联背景序列（包括丰富的细胞RNA）的簇的分化。
图3
图3
光活化核糖核苷类似物。（a） 卤化和含硫核苷类似物已被用于光交联，以探测RNA–RNA以及RNA–蛋白质相互作用。（b） 预测核糖核苷类似物在紫外线（UV）365交联到芳香氨基酸侧链时的结构。显示了与酪氨酸交联后的结构。（c） 4-硫尿苷（4SU）掺入细胞RNA的比率分析。总RNA（0.2 OD260用蛇毒磷酸二酯酶和碱性磷酸酶消化HEK293细胞，并用反相高效液相色谱（HPLC）分析。C、U、G和A对应的峰在280 nm处检测到，而4SU对应的峰则在330 nm处进行检测。根据U和4SU的吸收系数计算出4%4SU掺入率。其他细胞系的4SU替代率也为1-4%。5BrU，5-溴尿嘧啶；5IU，5-碘脲；5IC，5-碘胞苷；6SG，6-硫代鸟苷。
图4
图4
硫核糖核苷的光活化交联。（a） 表达FLAG/血凝素（HA）标记的IGF2BP2的HEK293细胞的光活化核糖核苷增强交联和免疫沉淀（PAR-CLIP），该IGF2BP1包含4个RRM和2个K同源性（KH）RNA-结合域（RBD）。顶部面板显示了与IGF2BP2交联并通过蛋白变性十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶电泳在免疫沉淀（IP）后解析的放射性标记RNA的自射线照片。表位标记的IGF2BP2的预期分子量约为75kDa。底部面板显示了一个抗HA免疫印迹（IB），以控制SDS凝胶上标记的IGF2BP2蛋白的量。（b） 顶部面板：尿苷和芳香侧链氨基酸（Tyr、Phe和Trp）的紫外线（UV）254交联产物。逆转录酶通常在交联加合物处停滞，但偶尔会跳过损伤，导致对应于交联位置的cDNA内缺失。底部面板显示了4-硫尿苷（4SU）到芳香侧链氨基酸的UV-365交联产物。4SU交联产物的结构不同于UV-254交联光加合物。逆转录酶也会在损伤处停滞，但当它通读时，最好在光加合物的正对面结合dG，从而导致定义4SU交联位点的特征性T到C转变。
图5
图5
光活化核糖核苷增强交联和免疫沉淀（PAR-CLIP）重叠序列读取簇和相应的RNA识别元件（RRE）的示例。从RNA结合蛋白（RBP）PUM2、QKI和IGF2BP家族成员的PAR-CLIP获得的重叠序列读取簇。读数与所示基因转录本的参考序列对齐；只显示最频繁的读取。序列读取拷贝数和与参考序列不匹配的数量显示在右侧；它们都表示T到C的突变（用红色字母表示）。蓝色方框表示RRE的位置，如Phylo-Gibbs基序分析所定义（右侧面板）。
图6
图6
CDK1 mRNA的光活化核糖核苷增强交联和免疫沉淀（PAR-CLIP）RNA-结合蛋白（RBPs）结合位点。CDK1的mRNA为1923 nt长（NM_001786.4）。该图仅显示了几个核和细胞质尺度RBP的外显子结合位点。显示了每个RBP的亚细胞定位。据报道，一些RBP的亚细胞分布表明，它们主要是核的（FUS），而不是胞浆的（PUM2）。然而，RBP相互之间的核质比尚不清楚，也不知道它们与mRNA靶点的关联。
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