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.1998年5月1日；508（第三部分）：871-81。
doi:10.1111/j.1469-7793.1998.871bp.x。

新型CPI-17蛋白可能参与兔动脉平滑肌蛋白激酶C信号转导

L李 1, M等, R Lee先生, F森田, M Yazawa先生, T北泽
附属公司

新型CPI-17蛋白可能参与兔动脉平滑肌蛋白激酶C信号转导

L李等。 生理学杂志. .

摘要

1.CPI-17最近被鉴定为血管平滑肌中的一种新蛋白。在体外，其通过蛋白激酶C（PKC）的磷酸化和硫代磷酸化可特异性抑制1类蛋白磷酸酶，包括肌球蛋白轻链（MLC）磷酸酶。2.磷酸化CPI-17均呈剂量依赖性地增强了β-七叶皂苷通透性和Triton X-100去膜动脉平滑肌在恒定[Ca2+]下的次最大收缩，但对完整和不太强通透性（α-毒素）组织没有影响。硫代磷酸化CPI-17（tp-CPI）即使在无Ca2+的条件下也能诱导大幅度收缩，并使Ca2+EC50降低一个数量级以上。未磷酸化CPI-17产生了最小但显著的影响。3.tp-CPI显著增加了β-七叶皂苷制剂中稳态MLC磷酸化与Ca2+的比率。4.tp-CPI影响收缩和松弛动力学以及MLC磷酸化和去磷酸化动力学，表明其主要生理作用是抑制MLC磷酸酶。5.与tp-CPI同时使用特定抑制剂的结果否认了一般G蛋白、rho A或PKC本身参与tp-CPI对Ca2+的敏化作用。6.我们的结果表明，PKC对CPI-17的磷酸化可刺激CPI-17与MLC磷酸酶的结合并随后抑制其活性。这意味着CPI-17在很大程度上解释了迄今为止PKC和受抑制的MLC磷酸酶之间未知的信号通路。

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数字

图5
图5。GDPβS、PKC假底物抑制剂肽（19-31）或C3外酶预处理对tp-HtCPI诱导Ca的影响2+pCa 6.3敏化
图5中使用的所有动脉条在5°C下用60μMβ-七叶皂苷渗透45分钟，然后在30°C下在10μM A23187存在下渗透15分钟。一个，控制不含任何抑制剂。tp-HtCPI（5μM）使pCa 6.3时的力水平从4±1显著增加到pCa 4.5时最大值的72±3%。B2 mM GDPβS的存在并不影响tp-HtCPI诱导的作用力，但它阻止了30μM苯肾上腺素（PE）+10μM GTP诱导的pCa 6.3处作用力的增加。C类30μM PKC假底物抑制肽（PKC-IP）显著抑制佛波酯（3μM，PDBu）诱导的力发展，但不抑制tp-HtCPI诱导的收缩。天，首先在20°C下，在含有30μMβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、2 mM胸腺嘧啶和0.3μM钙调蛋白的松弛溶液中，在1μg ml存在和不存在的情况下，将渗透条培养60 min−1肉毒梭菌胞外酶C3（钙生物化学）。C3预处理抑制了PE+GTP诱导的Ca2+pCa6.3致敏，但对tp-HtCPI的作用没有显著影响。
图1
图1。体外CPI-17的特性
一个HtCPI的硫代磷酸化是通过向含有26 mU ml的pH 7.2溶液中添加1 mM ATPγS来启动的−1PKC、10μM HtCPI、10 mM MgCl2在存在一组PKC活化剂（0.2 mM CaCl）的情况下，1 mM DTT、1 mM苯甲脒和50 mM拖把2+20微克毫升−1磷脂酰丝氨酸+2μg ml−1（•），PKC激活剂组加上5μM PKC假底物抑制剂肽（19-31）(○), 或单独1mM EGTA(（）。PKC的一个单位被定义为1分钟内催化1 nmol MLC磷酸化的酶的量。在指定的时间，取出等分样品并与固体尿素混合以终止反应。HtCPI硫代磷酸化程度由考马斯亮蓝染色尿素-PAGE凝胶上未磷酸化（u-）和硫代磷酸化合（tp-）HtCP1的带强度确定。B，的32通过添加0.1 mM[γ-32P] ATP代替ATPγS，以获得与中相同的溶液一个，但使用2μM u-或tp-HtCPI代替10μM HtCPI。Ca-PS-DO代表含有0.2 mM CaCl的溶液2，20微克毫升−1磷脂酰丝氨酸和2μg ml−1二油酸；PKC-IP显示5μM PKC假底物抑制剂肽。通过添加1%的SDS终止反应，然后对样品进行SDS-PAGE。这个32在Fujix Bas 2000成像分析仪上观察凝胶上的P标记HtCPI。在SDS-PAGE中，由于高碱度（理论等电点，10.3），天然（16.7kDa）或重组六组氨酸标记蛋白（21.5kDa，分别迁移到对应于20kDa或25kDa的位置。C类，CPI-17对分离的MLCP的剂量反应关系：在pH值为7.2且含有0.1 mg ml的溶液中8 min后测量MLCP活性−1磷酸化MLC，0.1μg ml−1MLCP、50 mM NaCl、1 mM EDTA、0.1 mM EGTA、1 mM DTT、1 mC苯甲脒、0.1 mg ml−1在存在tp-HtCPI的情况下，25°C下的BSA和50 mM MOPS(▪), tp-CPI公司(▴), 或u-HtCPI(○). 反应由添加MLCP开始，通过添加固体尿素终止。通过尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳（urea-PAGE）确定脱磷MLC的程度。
图2
图2。PKC-硫代磷酸化天然产物和非磷酸化天然物的功效(一个)和PKC硫代磷酸化重组CPI-17(B)恒定Ca下2+渗透性动脉平滑肌
用80μMβ-七叶皂苷使兔股动脉条透化，然后在标准放松溶液中孵育（见方法）。将其置于pCa 6.3溶液中，直到在20°C下达到低稳态力水平。原生CPI-17（u-CPI和tp-CPI）(一个)或重组CPI-17（tp-HtCPI）(B)添加到相同的pCa 6.3溶液中，最终（超最大）浓度为0.8μM一个和5μM英寸B在达到稳定水平的力后，清洗CPI-17，并应用高浓度（10μM）的微囊藻毒素Leu-Arg类似物（微囊藻素-LR，MC），以完全抑制渗透组织中的MLCP。为了验证最大力水平，最后一种溶液中含有pCa 4.5。这些痕迹代表了两个实验，每个实验重复四次。
图3
图3。tp-HtCPI（•）和u-HtCP1的剂量-反应关系(○) 关于收缩力的稳态水平(一个)tp-HtCPI对力发展半衰期的剂量反应关系(B)
一个，CPI-17浓度在pCa 6.3溶液中累积增加。以1.35μM tp-HtCPI下最大效应的百分比测量稳态值(n个= 4).B，在20°C的pCa 6.3溶液中向每块板条中添加单剂量tp-HtCPI(n个= 4).
图4
图4。5μM tp-HtCPI对钙的疗效2+收缩力的剂量反应关系
在不存在的情况下达到稳态水平后，测量相对力(○, 控制）和存在（•）tp-HtCPI作为Ca2+逐步增加(n个= 4).
图6
图6。恒定Ca下5μM tp-HtCPI或u-HtCPI对MLC磷酸化的影响2+
透化后，将条带在20°C的标准放松溶液中孵育至少10分钟。在单独用pCa 6.3部分活化15分钟（对照）后，或在pCa 6.3活化10分钟后，再在pCa6.3溶液中用5μM u-HtCPI、5μM tp-HtCP或10μM MC再活化5分钟后，将其冷冻。用pCa 4.5活化后，将完全活化的样品冷冻5分钟。根据方法中描述的程序对冷冻样品进行处理以测量MLC磷酸化*P（P）<0.001。n个= 4–5.
图7
图7。10μM tp-HtCPI对pCa 6.7无MLCP活性时力发展时间进程的影响(一个)以及用分离的MLCK研究MLC磷酸化的时间进程在体外(B)
一个，以估算就地MLC磷酸化，用β-七叶皂苷渗透的单个板条首先在1 mM EGTA严格溶液中洗涤三次30分钟，以耗尽ATP，然后用10μM MC在0.1 mM EGTA-严格溶液中用或不用10μM-tp-HtCPI预处理20分钟，然后在不含MC的pCa 6.7（10 mM EGTA）活化溶液中放置(○）或存在（•）tp-HtCPI(n个= 3–4).B用2μM猪主动脉肌球蛋白、1μg ml−1鸡精MLCK，10μg ml−1钙调素，0.15 M NaCl，10 mM MgCl2，0.2 mM氯化钙2，1 mM DTT，0.1 mM[γ-32P] 10μM u-HtCPI存在下的ATP和50 mM Mops-NaOH(○) 或tp-HtCPI(▴) 或者两者都不是(□).
图8
图8。10μM tp-HtCPI对无MLCK活性的力松弛时间过程的影响：间接离速动力学
用于控制实验(○), 用pCa 5.7收缩每一条15分钟，然后用200μM ML-9在10 mM EGTA松弛溶液中松弛。对于测试实验（•），首先用pCa 6.3单独收缩单个条带5分钟，然后用10μM tp-HtCPI进一步刺激15分钟，然后在含有tp-HtCP的松弛溶液中用ML-9放松。相对力表示为ML-9松弛溶液中0 min时力水平的百分比；100%相对力对应于pCa 4.5下最大力的92±0.7%（对于对照组）和78±2.4%（对于tp-HtCPI）(n个= 4). 数值表示为平均值±s.e.m.公司。(n个= 3).
图9
图9。10μM tp-HtCPI对无MLCK活性的MLC脱磷反应的影响：直接失速动力学
在图7所示的相同条件下，在松弛过程中，在0分钟和2.5分钟的时间内冷冻每块切片，测量MLC磷酸化。n个=4。
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