FGF21通过激活脑血管PPARγ保护糖尿病db/db雄性小鼠缺血性局灶性卒中后血脑屏障严重破坏

摘要

重组成纤维细胞生长因子21（rFGF21）已被证明对改善2型糖尿病（T2DM）卒中小鼠的长期神经预后具有潜在的益处。在此，我们测试了rFGF21通过激活脑微血管内皮细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）来保护T2DM小鼠免受中风后血脑屏障（BBB）损伤的假设。在本研究中，我们使用T2DM小鼠的远端中脑闭塞（dMCAO）模型以及培养的高血糖和炎症损伤的人脑微血管内皮细胞（HBMECs）。我们检测到脑组织中PPARγDNA结合活性以及BBB结合蛋白和PPARγ靶向基因的mRNA水平显著降低CD36型和FABP4公司脑卒中后24h脑微血管。与瘦肉对照组相比，T2DM小鼠在中风后两天发生缺血性中风，导致大量BBB泄漏。重要的是，中风后6小时开始的rFGF21给药可显著预防所有异常变化。我们的体外实验结果还表明，rFGF21通过上调FGFR1激活的连接蛋白表达和PPARγ活性升高的依赖性方式，对高血糖加白细胞介素（IL）-1β诱导的内皮细胞跨膜通透性起保护作用。我们的数据表明，rFGF21对糖尿病卒中后急性血脑屏障漏出具有较强的保护作用，这部分是通过增加PPARγDNA结合活性和血脑屏障结合复合体蛋白mRNA表达介导的。结合我们之前的研究，rFGF21可能是治疗糖尿病卒中的一个有希望的候选药物。

1.简介

大约30%的中风患者患有糖尿病，其中90%以上患有2型糖尿病（T2DM）[1]. T2DM卒中患者的死亡率几乎是非糖尿病卒中患者的两倍，且神经预后更差[2,三]. 更好地了解T2DM卒中患者亚群的特定病理生理学和开发靶向治疗已成为转化卒中研究的高度优先事项[4].

尽管有大量数据表明T2DM导致肾脏和视网膜微血管并发症，但T2DM对脑血管系统的影响仍不清楚[5]. 从临床和实验研究中获得的新证据表明，T2DM损害血脑屏障（BBB）的完整性，并在基线状态或缺血性卒中后加重BBB的通透性[5,6,7,8]被认为是T2DM卒中的一个重要病理特征，至少在一定程度上导致神经功能缺损恶化[9]. 我们之前提出了一种使用重组成纤维细胞生长因子21（rFGF21）治疗患有T2DM的缺血性中风小鼠的疾病改善方法，并观察了rFGF2对T2DM中风小鼠长期神经预后的有益影响[10]. 非常有趣的是，FGF21被报道为过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的生理和药理作用的关键介体[11]，是一个重要的核受体，转录调节多个基因表达，并在中风后脑损伤和修复中充当细胞保护应激反应的主要看门人，如抗炎和抗氧化应激[12]. 我们之前的研究表明，rFGF21给药可增加PPARγ中风后三天，T2DM小鼠外周皮层的DNA结合活性可能是减少脑组织损伤和有害促炎细胞因子表达的部分原因[10]. 其他人报告称，缺血性卒中后脑组织中PPARγ活性显著下降，导致紧密连接（TJ）蛋白下调，继而导致BBB泄漏[13,14]. 然而，rFGF21对T2DM缺血性卒中后加重早期血脑屏障破坏的药理作用及其潜在的分子机制尚未研究。

在本研究中，我们验证了我们的假设，即卒中后给予rFGF21通过FGFR1介导的脑血管PPAR升高对T2DM小鼠早期BBB损伤具有保护作用γ活动。两组实验设计如下：在T2DM小鼠中使用局灶性中风模型进行体内研究，如我们之前所述，接受或不接受rFGF21治疗[10]，并使用培养的人脑微血管内皮细胞（HBMECs）进行了体外研究，该细胞受到一个成熟的高血糖加白细胞介素（IL）-1β暴露模型的损伤，以模拟我们之前描述的糖尿病中风的体内情况[15].

2.结果

2.1. rFGF21通过FGFR1增加db/db小鼠中远端大脑闭塞（dMCAO）后梗死周围区域PPARγDNA结合活性

首先，我们检测了dMCAO后db/db小鼠脑组织PPARγ活性的变化。由于从小鼠脑微血管碎片中提取的核部分数量非常有限，我们很难直接评估脑血管PPARγ活性。相反，我们使用电泳迁移率变化分析（EMSA）分析了dMCAO后24小时近梗死脑组织核部分的PPARγDNA结合活性(图1A） ●●●●。我们的结果表明，与db/+小鼠相比，db/db小鼠的PPARγDNA结合活性显著降低（62.2%降低），表明糖尿病卒中后PPARγ活性受损(图1B） ●●●●。重要的是，延迟rFGF21给药显著缓解了db/db小鼠中风后PPARγDNA结合活性的下降（与未给药组相比增加了196.1%）。然而，在rFGF21给药前30分钟用PD173074进行治疗，显著地消除了rFGF2促进PPARγDNA结合活性的作用(图1B） 表明rFGF21处理诱导的PPARγ活化是由FGFR1介导的。

2.2. rFGF21通过激活PPARγ减少db/db小鼠dMCAO后梗死周围区域BBB外渗

使用两种不同的示踪剂：TMR-右旋糖酐（3kDa）和埃文斯蓝染料（在循环中与白蛋白结合后约68kDa，通过BBB渗出试验检测rFGF21对中风后BBB渗漏的影响(图2A） ●●●●。正如我们预期的那样，在dMCAO后48小时，渗出试验显示，与作为对照的db/+小鼠相比，db/db小鼠的BBB渗漏显著增加（3kDa TMR-右旋糖酐增加117.6%，埃文斯蓝染料增加167%）(图2B、 C）。重要的是，在中风发作后6小时给予rFGF21显著降低了db/db小鼠两种示踪剂的渗漏（3kDa TMR-右旋糖酐渗漏减少52%，埃文斯蓝染料渗漏减少43.2%）。然而，在rFGF21给药前30分钟用GW9662进行治疗，消除了rFGF2对BBB外渗的抑制作用(图2B、 C）。这些结果表明，rFGF21可以在很大程度上（约50%）保护T2DM缺血性局灶性卒中后强化的BBB泄漏，这种有益的作用可能是由PPARγ激活所致。

2.3. rFGF21通过激活脑血管PPARγ抑制db/db小鼠dMCAO后连接蛋白mRNA表达的降低

在体内实验的最后一部分，我们通过定量两个PPARγ靶向下游基因的mRNA表达水平间接评估脑血管PPARγ活性CD36型和FABP4公司[16,17]缺血性局灶性卒中后24h脑微血管碎片。我们的结果显示，卒中后PPARγ下游基因均显著减少（卒中后PPERγ下游基因减少96.8%）CD36型mRNA水平和73%减少FABP4公司mRNA水平）。中风后6小时给予rFGF21消除了这种减少（增加263.8%CD36型和199.6%的增长FABP4公司) (图3A） 反映了脑血管PPARγ活性的变化。为了研究rFGF21对BBB连接蛋白表达的影响，将从分离的脑微血管片段中提取的相同mRNA样本用于RT-PCR分析。与db/+小鼠相比，db/db小鼠BBB连接蛋白的mRNA水平显著降低，包括ZO-1（减少57.7%）、VE-cadherin（减少55.1%）、claudin-5（减少44.4%）和cloddin（减少60.2%）。非常重要的是，延迟rFGF21的给药大大改善了连接蛋白mRNA表达的减少，但这种保护作用被特异性PPARγ抑制剂GW9662阻断(图3B） ●●●●。这些结果表明，rFGF21对脑卒中后血脑屏障破坏的保护作用可能至少部分是通过促进脑微血管PPARγ活性和PPARγ相关血脑屏障连接蛋白表达介导的。

2.4. rFGF21通过促进FGFR1介导的PPARγ活性改善培养HBMEC的跨内皮通透性

在第二组实验中，我们使用培养的HBMEC来进一步验证我们的假设。高血糖（HG）加IL-1β暴露用于体外模拟糖尿病卒中条件。我们还测量了HG+IL-1β损伤后培养的HBMEC单层的通透性。首先，我们发现，通过应用不同的条件，每组培养的HBMEC之间的细胞活力没有显著变化(图4A） ●●●●。随后，测量高血糖和IL-1β损伤后培养的HBMEC单层通透性(图4B） 正如我们所料，损伤后细胞通透性显著增加（与非损伤组相比升高75.7%），而rFGF21治疗组与未治疗组相比，细胞通透率显著降低28.9%。同样，GW9662联合治疗消除了rFGF21的保护作用（32.4%升高）。此外，HG+IL-1β损伤诱导培养HBMEC核部分PPARγ活性降低（与未损伤组相比降低28.8%），rFGF21与未治疗组相比，损伤后培养HBMECs中PPARγ的活性（77.9%）和蛋白质水平（162.5%）均升高。虽然与FGFR1抑制剂PD173074联合治疗显著削弱了rFGF21上调受损HBMEC中PPARγ蛋白水平（减少50%）和活性（减少35.7%）的作用，表明FGFR1参与了rFGF21的PPARγ调节功能(图4C、 D）。我们之前的数据也一致表明，FGFR1的磷酸化和活化可能是在HBMEC中发挥rFGF21保护功能的重要步骤[15].

2.5. rFGF21通过促进PPARγ在培养的HBMECs中增加连接蛋白的表达

我们量化了HG+IL-1β条件下培养的HBMEC中两种连接蛋白ZO-1和VE-cadherin的蛋白水平(图5A） ●●●●。HG+IL-1β损伤后两种蛋白水平均显著降低（与非损伤组相比，ZO-1降低49.4%，VE-cadherin降低59.6%），而rFGF21治疗显著上调了损伤HBMEC中ZO-1（增加40.3%）和VE-cadherin（增加73.9%）的蛋白水平(图5B、 C）。同样，GW9662联合治疗阻止了rFGF21对连接蛋白的升高（分别降低35.2%和30.7%），表明PPARγ参与了培养HBMEC中rFGF2对TJ蛋白表达的调节。

3.讨论

本研究的主要发现如下：（1）与瘦db/+小鼠相比，T2DM db/db小鼠在局灶性缺血性卒中后急性期表现出更差的BBB通透性；（2） 中风发作后6 h延迟给予rFGF21，可显著减轻db/db小鼠缺血诱导的BBB通透性；（3） rFGF21的BBB保护作用至少部分是由FGFR1介导的促进脑微血管内皮PPARγ活性所起的作用(图6).

成纤维细胞生长因子21（FGF21）是FGF家族的内分泌成员，在糖脂代谢以及能量平衡中发挥着重要作用[18]. FGF21还介导对各种病理条件下组织损伤和修复的适应性反应[19,20,21]. 使用相同的2型糖尿病动物模型、db/db小鼠和非糖尿病基因控制db/+小鼠，我们先前测试了我们的假设，即rFGF21可能是一种新的有效的疾病修饰方法，可以改善T2DM卒中后的神经预后。我们早期的探索性研究表明，rFGF21的潜在治疗机制至少部分是通过系统代谢调节、抑制神经炎症原和促进白质完整性来实现的[10]. 然而，rFGF21对急性脑损伤的保护作用，尤其是对T2DM卒中中加重的BBB完整性破坏的保护作用尚未得到研究，这可能在其治疗益处中发挥关键作用。

众所周知，缺血后血脑屏障损伤导致其通透性发生动态、双相变化。先前使用啮齿动物中风模型的实验研究表明，血脑屏障泄漏有两个高峰，一个是早期外渗（中风后3-6小时），另一个是晚期外渗（卒中后24-48小时）[22,23,24,25]，在笔划后存在。自从我们在中风后6小时开始rFGF21治疗以来，本研究在中风后48小时通过使用两种不同分子量的示踪剂（3kDa TMR-右旋糖酐和Evans蓝色染料，与白蛋白结合后约为68kDa）检测BBB外渗。

在第一组实验中，我们发现与db/+小鼠相比，中风后db/db小鼠的两种示踪剂通过BBB的泄漏量显著增加。重要的是，卒中后延迟给予rFGF21显著降低（约减少50%）db/db小鼠的BBB泄漏。接下来，我们选择PPARγ作为我们的主要靶点，以研究rFGF21治疗T2DM卒中的治疗机制，因为PPARγ在抗炎、抗氧化应激和随后的血管保护方面具有关键作用[26]. 由于从脑微血管碎片中提取的核部分数量非常有限，我们很难直接检测脑血管核部分中的PPARγ活性。相反，我们使用EMSA测试dMCAO后24小时脑组织核部分PPARγDNA结合活性。我们发现，与db/+小鼠相比，db/db小鼠脑卒中后PPARγ活性严重下降，但延迟给药rFGF21几乎完全挽救了PPARγ活性。RT-PCR分析显示卒中后PPARγ靶向下游基因的mRNA表达下降CD36型和FABP4公司rFGF21对db/db小鼠脑微血管碎片中的内皮连接蛋白有很大的抑制作用，表明rFGF2 1靶向T2DM卒中后脑微血管的特异性病理反应。为了探索分子机制，基于我们之前的数据显示rFGF21可能通过FGFR1磷酸化和激活来发挥其功能[15,27]，我们通过药理学方法测试了FGFR1在PPARγ活性变化中的可能参与，包括一种特定的FGFR1抑制剂PD173074和一种特定PPARγ抑制剂GW9662。我们的体内研究结果表明，在中风后T2DM db/db小鼠中，FGF21的药理作用可能涉及连接蛋白表达的调节和随后的BBB保护，即FGF21–FGFR1–PPARγ激活。在第二组实验中，我们使用培养的HBMEC来进一步验证我们的假设。如前所述，高血糖加IL-1β模拟糖尿病卒中体外损伤[15]. 我们的体外实验结果表明，rFGF21对高血糖加IL-1β诱导的内皮细胞跨膜通透性具有强烈的保护作用，这是FGFR1激活依赖性和PPARγ活性依赖性，也与维持连接蛋白表达有关。这些结果明确定义了药理作用级联，即FGF21–FGFR1–PPARγ激活–BBB连接蛋白表达–内皮渗漏保护。

据报道，极低的肝素结合亲和力使FGF21能够通过简单的扩散穿过血脑屏障[28]我们之前对高脂肪饮食小鼠的实验也证实了这一点[27]. 然而，作为一种大分子蛋白，FGF21的脑血管效应可能在神经血管单位的背景下起主导作用。大量临床和实验研究表明，BBB完整性破坏是主要介导缺血性卒中后急性脑损伤的关键脑血管病理学[29,30]与卒中后预后不良有关[31]. 关于糖尿病相关脑微血管病的知识尚不完整，在糖尿病状态下，几种机制可能协同导致血脑屏障功能障碍，例如长期高血糖诱导的内皮解剖和代谢变化、氧化应激和紊乱的炎症反应[5,32]. 最重要的是，新出现的实验研究表明，T2DM患者卒中后血脑屏障的破坏明显加剧，这被认为是T2DM卒中的病理特征和治疗靶点之一[33,34].

在这项研究中，我们发现T2DM小鼠中风后一天，病变周围皮层的PPARγDNA结合活性以及脑微血管片段中PPARγ靶向下游基因的mRNA表达显著降低，但中风后给予rFGF21显著升高。虽然，作为一种转录因子，rFGF21激活的PPARγ如何调节调节连接蛋白表达和保持BBB完整性的后续信号通路尚待阐明，但积累的实验证据支持PPARγ活性不仅在BBB保护中发挥关键作用，还可以提高细胞存活率，恢复缺血性卒中后的稳态平衡[12]. rFGF21对脑卒中后血脑屏障的保护可能还涉及其他分子机制，这有待于进一步研究。本研究证实了T2DM小鼠局灶性缺血性卒中后BBB损伤严重加重，最重要的是，延迟rFGF21给药具有早期BBB保护作用，这可能是改善长期神经预后的关键有益作用之一，同时还延迟了治疗时间窗，表明rFGF21可能是治疗T2DM卒中的高度翻译候选基因。事实上，预计未来十年内糖尿病患者的数量将急剧增加。到2030年，估计全球糖尿病患病率将超过4.37亿[35]糖尿病相关血管并发症的发生率也将急剧上升，包括急性缺血性卒中[36]. 特别是，这些患者可能会遭受更严重的缺血性脑损伤和更糟糕的结果[37,38]由于长期全身血管异常，包括BBB的变化[6]. 我们的研究可能为通过疾病改善方法改善糖尿病卒中患者的血脑屏障损伤提供一种新的思路，并最终使这一亚组患者受益。

我们意识到这项研究的一些局限性。首先，我们使用C57BLKS-Leprdb 2型糖尿病小鼠（db/db T2DM小鼠，Jackson实验室）；然而，瘦素受体突变并不能准确反映人类疾病的真正发病机制，即使这个模型已经让我们了解了糖尿病状态下的葡萄糖代谢和血管并发症的新途径[39,40]. 应继续在糖尿病合并缺血性卒中的其他动物模型中使用rFGF21进行进一步测试[41]. 其次，我们测试了rFGF21对T2DM小鼠局灶性卒中后PPARγ激活相关BBB保护的作用。然而，FGF21诱导的PPARγ激活的详细分子机制以及PPARγ活化在调节T2DM卒中后BBB完整性中的下游信号通路需要在未来的研究中阐明。第三，多种病理因素动态交互参与T2DM卒中导致的BBB完整性损害[42]. 因此，了解rFGF21如何在药理学上调节这些病理机制是非常重要的，这需要更多的研究[43]. 第四，由于缺乏可用的免疫组织化学工作抗体来检测FGF21受体FGFR1（磷酸化FGFR1）的活性形式，我们无法确定小鼠大脑中发生FGF21-FGFR1激活的特定区域。事实上，FGF21介导的受体激活和随后在神经血管单位中的生物信号通路值得进一步研究[44]. 第五，虽然基于体外培养内皮单层的通透性测定已被普遍使用，但它可能无法全面反映体内脑血管内皮的生理特征。因此，内皮-星形胶质细胞联合培养可能是我们未来研究的更好的体外模型[45]. 最后，本研究是我们继续研究rFGF21对T2DM小鼠局灶性缺血性卒中的治疗作用。正如我们之前证明的那样，rFGF21的多种药理作用可能参与了这一治疗过程，因此不可能真正确定rFGF2的BBB保护作用完全介导了哪一部分神经结果的改善。更严重的BBB损伤和rFGF21的有效保护作用表明，BBB保护机制可能至少部分有助于改善T2DM小鼠缺血性局灶性卒中后的长期神经预后[10].

4.材料和方法

4.1. 小鼠局灶性脑缺血模型

男BKS。11–12周龄的Cg-Dock7m+/+Lepr-db/J纯合（db/db）小鼠，体重40–50 g，以及与其年龄匹配的非糖尿病小鼠BKS。Cg-Dock7m+/+Lepr-db/J杂合（db/+）小鼠，体重25-30 g，来自Jackson实验室。将小鼠安置在具有12小时暗光循环的标准动物设施中，并随意喂食颗粒和水。局灶性脑缺血是通过大脑中动脉远端（dMCAO）的凝固形成的，随后如我们之前所述，同侧颈总动脉闭塞90分钟[10]. 所有实验都是在马萨诸塞州总医院（2016N000498，2019年8月2日）和杜兰大学（846，21，2019）动物护理和使用委员会根据NIH《实验动物护理与使用指南》批准的方案后进行的。

4.2. 培养的HBMEC和损伤模型

主要HBMEC购自Cell Systems Corporation（ACBRI376，Kirkland，WA，USA），并在含有补充生长因子的完整生长介质EBM-2中培养（Lonza）。为了模拟糖尿病中风的体内环境，我们在培养的HBMEC中应用了高血糖加IL-1β的细胞损伤模型，正如我们之前发表的[15]. 简言之，最初将原代HBMEC（培养物或单层）培养在正常完整的EBM-2（含5 mM葡萄糖）中，然后转移到高血糖（25 mM葡萄糖，EBM）加IL-1β（20 ng/mL）中16 h。通过在胶原包被的Transwell插入物（直径6.5 mm，孔径0.4μm；美国纽约州康宁市）的内表面上培养原代HBMEC，建立HBMEC单层。通过WST-1分析评估培养的HBMEC的生存能力[15]. 将细胞增殖试剂WST-1（Donjindo Molecular Technologies，Rockville，MD，USA）加入24孔板（每个孔中含有450μL培养基）后，在37°C下培养细胞2小时。在空白背景对照下，使用微孔板阅读器（SpectraMax M5，Molecular Devices，San Jose，CA，USA）测量450 nm处的吸光度。

4.3. 实验组

接受dMCAO后，小鼠被随机分为四个实验组：（1）非糖尿病db/+小鼠（db/+）；（2） 糖尿病db/db小鼠（db/db）；（3） 接受rFGF21的db/db小鼠；（4）接受rFGF21加GW9662或PD173074的db/db小鼠。rFGF21溶于生理盐水中，于中风后6 h腹腔注射，每天两次，直至死亡（每次注射1.5 mg/kg）[10]. 特定FGFR1抑制剂PD173074（15 mg/kg，Sigma，Burlington，MA，USA）或转录因子PPARγ的选择性拮抗剂GW9662（4 mg/kg，Sigma）溶于40%（2-羟丙基）-β-环糊精中，并在rFGF21治疗前30分钟腹腔注射。第1组和第2组也腹腔注射等量的40%（2-羟丙基）-β-环糊精。体外研究包括五组：（1）未经任何治疗的假手术组；（2） 高血糖和IL-1β组；（3） HG+IL-1β组加上rFGF21（在IL-1β治疗期间以50nM的最终浓度添加到培养基中；（4）用溶解在DMSO中的PD173074（50nM）或GW9662（20nM）联合治疗HG+IL-1β+rFGF2 1组。GW9662和PD173074的剂量选择基于先前发表的研究[15,46,47,48].

4.4. 小鼠BBB渗透性测定

如前所述进行小鼠BBB渗透性试验[49,50]稍作修改。简言之，在中风后48小时，向小鼠静脉注射3 kDa TMR-右旋糖酐（1μg/μL，总体积200μL溶于生理盐水，Thermo Fisher）或伊文斯蓝染料（2%，总体积为200μL，溶于生理盐，Sigma）。分别在循环1小时（3 kDa TMR-右旋糖酐）或30分钟（埃文斯蓝染料）后，对小鼠进行深度麻醉，并在左心室采血后立即用足够的冰镇PBS进行心内灌注。采集近端脑组织，用1%Triton X-100（用于3kDa TMR-右旋糖酐）或50%三氯乙酸（用于Evans蓝色染料）在冰镇PBS中均质，然后离心。上清液中的荧光由微孔板读取器在分别为540和590nm（对于3kDa TMR葡聚糖）或分别为630和680nm（对于Evans蓝染料）的激发和发射波长下读取。脑组织中示踪剂含量的值（μg/g）通过标准物和血清的荧光读数进行校正。

4.5. 内皮单层通透性测定

在用不同条件处理每组HBMEC单层后，用新鲜培养基替换上下腔室的培养基，无需补充。将异硫氰酸荧光素（FITC）标记的右旋糖酐（0.1 mg/mL，分子量：70 kD，Sigma）添加到上部腔室，同时将含有500μL新鲜无血清培养基的下部腔室培养20分钟，以评估渗透性。然后，我们从下室收集了100μL介质，并测量了520 nm处发射的荧光，激发波长为490 nm。

4.6. 核提取和EMSA

我们在中风后24小时收集了近梗死区脑组织，通过使用商用试剂盒（Sigma）进行核组分提取，然后如前所述用于EMSA[10]. 简言之，含有野生型或突变的假定转录因子结合位点的寡核苷酸合成如下：PPARγ一致性寡核苷酸（意义）：5'-CAAACTAGGTCAAAGGTCAAGTCA–3'，PPARγ共识寡核苷酸（反义）：5'-TGACCTTTGACCTATTTTG–3'、PPARγ突变寡核苷酸（义）：5'-CAAAACTAGCAAAGCACA–3'和PPARγ突变寡核苷酸（反义）：5'-TGTTGTTGTGCTAGTTTTG–3'（马萨诸塞州总医院DNA核心设施）。将合成的5′端生物素标记的单链寡核苷酸退火，获得双链DNA探针。我们使用LightShift EMSA优化和控制试剂盒（Pierce，Rockford，IL，USA）进行DNA-蛋白质结合反应，然后使用化学发光核酸检测模块（Pierse）检测生物素标记的DNA。使用ImageJ软件（1.52i，NIH，Bethesda，MD，USA）对同一条带进行定量密度测定。

4.7. 小鼠脑微血管内皮细胞的分离

中风后24小时，按照其他人的描述，将小鼠处死进行脑微血管内皮分离[51]稍作修改。简单地说，整个过程是在冰上进行的，脑组织被均质化，然后在2000×克在4°C下保持15分钟，以小心地分离髓鞘，随后收集血管颗粒。样品在使用前储存在−80°C。

4.8. RT-PCR分析

使用miRNeasy Micro Kit（Qiagen）分离小鼠脑微血管内皮细胞以获得总RNA，并按照我们之前的描述进行RT-PCR[10]. 我们使用Taqman基因表达分析CD36型（Mm00432403_m1），FABP4公司（Mm00445878_m1），ZO-1号机组（Mm00493699_m1），VE-卡德林（Mm00486938_m1）、克劳丁-5（Mm00727012_s1）、闭塞素（Mm00500912_m1）和内务基因企业对企业（Mm00437762_m1）（应用生物系统）。通过内源性18S核糖体RNA的定量对数据进行归一化^-ΔΔCt方法，并通过折叠变换表示。

4.9. 体外PPARγ活性测定

按照制造商的说明，使用PPARγ转录因子检测试剂盒（ab133101，Abcam）测量PPARγ活性。简单地说，使用“核提取试剂盒”（ab113474，Abcam）从培养的HBMEC中分离出核提取物。将来自HBMEC或阳性对照的10微升核提取物与90µL完整转录因子结合检测缓冲液（CTFB）混合，并添加到96 well检测板的指定孔中。然后将平板密封并在4°C下培养过夜。第二天，清空微孔，并用200µL Wash Buffer清洗五次。然后将转录因子PPARγ一级抗体（100µL，1:100）添加到每个孔中，并在室温下孵育1 h而不搅拌。洗涤五次后，将山羊抗兔HRP结合物（1:100）添加到每个孔中，然后在室温下培养1小时。洗涤后，加入100µL显影溶液，在室温下孵育15至45分钟，然后加入100µL停止溶液。使用平板读取器测量450 nm处的吸光度。

4.10. 西部印记

对于培养的HBMEC的总蛋白分离，在添加裂解缓冲液之前用PBS洗涤细胞两次。使用质膜蛋白提取试剂盒（美国马萨诸塞州剑桥市Abcam）进行样品采集。蛋白质样品（质膜蛋白质或核提取物）在转移到硝化纤维素膜之前，在4%–20%NuPage凝胶中均匀分离。用于在4°C下过夜膜孵育的主要抗体如下：PPARγ（1:1000，美国伊利诺伊州罗克福德，Thermo Fisher）、ZO-1（1:1000；Cell Signaling，马萨诸塞州贝弗利，美国）、VE-cadherin（1:1000）、Enzo Life Sciences，美国纽约州法明代尔）、Na-K-ATP酶（1:1000、Abcam）和组蛋白H3（1:1000。然后在含有0.1%吐温20的PBS中清洗膜并通过增强化学发光（Pierce）显影后，在室温下将膜与辣根过氧化物酶连接的二级抗体（1:2000）孵育1小时。用ImageJ定量蛋白质带的光密度。

4.11. 统计分析

所有数据均以方框图的形式显示，包括中位数、下四分位数和上四分位数、最小值和最大值，并在GraphPad Prism 7.0版中使用单向方差分析和Tukey–Kramer检验对各组进行分析。统计显著性定义为第页< 0.05.

5.结论

总之，我们证明rFGF21给药对T2DM卒中小鼠早期BBB完整性破坏具有潜在的保护作用。潜在的机制至少部分是由FGFR1激活和随后的PPARγ激活诱导的连接蛋白表达介导的。结合我们之前的研究，rFGF21可能被开发成为一种新型且有效的T2DM治疗缺血性中风的疾病改善方法。