Comparative Interactome Analysis of Emerin, MAN1 and LEM2 Reveals a Unique Role for LEM2 in Nucleotide Excision Repair

doi:10.3390/cells9020463

比较研究

.2020年2月18日；9(2):463.

doi:10.3390/cells9020463。

Emerin、MAN1和LEM2的比较相互作用分析揭示LEM2在核苷酸切除修复中的独特作用

伯恩哈德·莫瑟^1 2, 何塞·巴西里奥², 约瑟夫·戈兹曼¹, 安德烈亚斯·布拉奇纳¹, 罗兰·福斯纳¹

附属公司

¹奥地利维也纳1030维也纳生物中心维也纳医科大学医学生物化学中心Max Perutz实验室。
²奥地利维也纳1090维也纳医科大学生理药理学中心血管生物学和血栓形成研究系。

PMID： 32085595
预防性维修识别码：项目管理委员会7072835
内政部： 10.3390/单元9020463

比较研究

Emerin、MAN1和LEM2的比较相互作用分析揭示LEM2在核苷酸切除修复中的独特作用

伯恩哈德·莫瑟等。细胞. 2020.

.2020年2月18日；9(2):463.

doi:10.3390/cells9020463。

作者

伯恩哈德·莫瑟^1 2, 何塞·巴西里奥², 约瑟夫·戈兹曼¹, 安德烈亚斯·布拉奇纳¹, 罗兰·福斯纳¹

附属公司

¹奥地利维也纳1030维也纳生物中心维也纳医科大学医学生物化学中心Max Perutz实验室。
²奥地利维也纳1090维也纳医科大学生理药理学中心血管生物学和血栓形成研究系。

PMID： 32085595
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摘要

LAP2-Emerin-MAN1（LEM）结构域蛋白是一组丰富的内核膜蛋白，参与多种核功能，但其功能冗余性尚不清楚。在这里，我们使用生物素化依赖邻近性方法，报告了两个结构相关的LEM蛋白MAN1的蛋白质组范围的比较相互作用组分析(发光二极管3)和LEM2(发光二极管2)以及更为远亲的埃默林(EMD公司). 虽然在LEM2相互作用组中也发现了60%以上相对较小的MAN1和emerin相互作用体，但后者包括大量LEM2特有的候选物（>85%）。独特的相互作用伙伴支持emerin，并进一步深入了解先前报道的emerin在中心体定位中的作用，MAN1特异性相互作用子表明MAN1在核糖核蛋白复合物组装中的作用。有趣的是，LEM2特异性相互作用组包含核苷酸切除修复途径的几种蛋白质。因此，LEM2缺失的细胞，而不是MAN1和emerin缺失的细胞在紫外线C（UV-C）照射和γH2AX长时间积累后表现出增殖受损，类似于核苷酸切除修复蛋白DNA损伤结合蛋白1（DDB1）缺陷的细胞。这些发现表明LEM2缺失细胞的DNA损伤修复受损。总的来说，这项相互作用组研究确定了emerin、MAN1尤其是LEM2的新潜在相互作用伙伴，并描述了LEM2在核外周核苷酸切除修复中的新潜在参与。

关键词：生物ID；DNA修复；LEM蛋白；内核膜；核膜；核苷酸切除修复。

PubMed免责声明

利益冲突声明

资助者在研究设计中没有任何作用；收集、分析或解释数据；在撰写手稿时，或在决定公布结果时。

数字

图1
BirA*-emerin-V5、BirA*-MAN1-V5和BirA*-LEM2-B-V5在U2OS细胞中的表达。(A类)LEM2-、MAN1-和emerin的结构域组织示意图。黄色，跨膜结构域；蓝色，MSC-（MAN1-SRC1p-C端子）域；红色，LEM域；绿色，RNA识别基序（RRM）。(B类)BirA*融合蛋白近距离生物素化蛋白（10 nm）。展示BioID方法的卡通和时间课程。用含有1µg/ml多西环素的培养基培养细胞以诱导融合蛋白表达，6 h后添加50µM生物素，再培养16 h，然后裂解细胞。(C类)稳定表达强力霉素诱导的BirA*-融合构建物的U2OS细胞在没有（-强力霉素）或（+强力霉素、强力霉素和生物素的情况下培养，并使用V5标签抗体和荧光标记的链霉亲和素（生物素）进行免疫荧光显微镜检查。DNA用DAPI染色。棒材，10µm。(D类)制备培养细胞的总细胞裂解物，并使用V5抗体和辣根过氧化物酶（HRP）结合链霉亲和素进行免疫印迹分析。图1D中的通道位于相同的印迹上（未经编辑的免疫印迹参见补充图S1），并且在相同的暴露时间下生成。

图3
LEM2相互作用组包含几个参与核苷酸切除修复的蛋白质。(A类)使用STRING数据库对所示GO过程的LEM2的已识别高置信交互作用物进行进一步分组和分析。节点的填充颜色表示AvgP，线宽表示STRING交互分数。(B类)核苷酸切除修复（NER）途径示意图。GG-NER，全球基因组-NER；TC-NER，转录偶联NER。BirA*-LEM2生物素化的蛋白质被着色；LEM2相互作用组中未发现的蛋白质呈浅灰色。

图4
LEM2基因敲除会削弱紫外线C照射后的DNA损伤反应。通过RNA干扰敲除emerin、MAN1、LEM2或DDB1后，获得U2OS细胞的存活率。干扰RNA（Sc）用作阴性对照。(A类)转染指示的siRNA后48小时，对U2OS细胞进行免疫荧光分析，DNA（蓝色）、LEM2（红色）和emerin（绿色）染色。棒材，10µm。(B类)使用顶部所示抗体转染指定的siRNA 48小时后，对全细胞裂解物进行免疫印迹分析。γ-管蛋白作为负荷控制。(C类)Emerin-MAN1-、LEM2-和DDB1-缺失细胞或用干扰RNA处理的细胞未经处理（对照）或用亚致死剂量的UV-C（5 J/m）照射²)（+UV）和细胞增殖分析照射后96 h。(D类)条形图表示96小时时间点的细胞数。使用双向方差分析和Tukey多重比较进行统计分析，n=8，*，对-值：“*”对< 0.05; ‘**’ 对于对< 0.01; ‘***’ 对于对< 0.001; ‘****’ 对于对< 0.0001. 误差条表示平均值的标准误差。(E类)使用磷酸化H2AX（γH2AX）抗体，在紫外线处理前和48小时后通过免疫印迹分析全细胞裂解物。Ponceau S染色作为负荷控制。(F类)免疫印迹定量。该图表示紫外线处理归一化为总蛋白后γH2AX的倍数增加。

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