microRNA-612 suppresses the malignant development of non-small-cell lung cancer by directly targeting bromodomain-containing protein 4

Xiaowen Kang; Fanwu Kong; Shijie Wu; Qiushuang Liu; Chengcheng Yang; Xiaomei Wu; Wei Zhang

doi:10.2147/OTT.S204004

Onco针对Ther。2019; 12: 4167–4179.

2019年5月28日在线发布。数字对象标识：10.2147/OTT。S204004号

预防性维修识别码：PMC6549771型

PMID：31213835

这篇文章已被撤回。

缩回位置：

Onco针对Ther。2021年9月9日；14时4745分

另请参见：PMC收回策略

microRNA-612通过直接靶向溴多巴胺蛋白4抑制非小细胞肺癌的恶性发展

康晓文,¹ 范武刚,² 吴世杰,^三刘秋双,⁴ 杨成成,¹ 吴晓梅,¹和张伟（音译）⁵

作者信息文章注释版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景：据报道，在非小细胞肺癌（NSCLC）中，microRNAs（miRNAs）的异常表达。miRNA的失调对非小细胞肺癌的病理学和生物学行为具有抑瘤或促瘤作用。miR-612与多种人类癌症相关；然而，miR-612在非小细胞肺癌中的表达、潜在作用和调控机制尚不清楚。

材料和方法：这里，通过RT-qPCR评估miR-612在非小细胞肺癌组织标本和一组细胞系中的表达水平。细胞计数试剂盒8、流式细胞术、Transwell迁移和侵袭，以及体内进行肿瘤生长试验以确定miR-612在NSCLC细胞恶性表型中的功能作用。研究了miR-612在非小细胞肺癌中抑瘤作用的分子机制。

结果：miR-612在非小细胞肺癌中低水平表达，且低水平表达与肿瘤坏死分期和淋巴结转移显著相关。miR-612低表达的非小细胞肺癌患者总生存率低于高表达的患者。外源性miR-612表达降低了NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进了细胞凋亡在体外.miR-612上调抑制非小细胞肺癌肿瘤生长体内.含溴蛋白4(巴西雷亚尔4)被证实为NSCLC细胞中miR-612的直接靶基因。BRD4在人类NSCLC组织中明显过表达，并且与miR-612的表达呈负相关。BRD4表达的抑制模拟了miR-612在NSCLC细胞中过表达的肿瘤抑制功能。miR-612表达的再导入消除了miR-612-介导的对NSCLC细胞的抑制作用。BRD4上调抑制非小细胞肺癌细胞PI3K/Akt通路的激活在体外和体内.

结论：这项研究支持了miR-612在NSCLC细胞侵袭行为中发挥肿瘤抑制作用的第一个证据在体外和体内通过直接靶向BRD4并停用PI3K/Akt途径。因此，miR-612可能是非小细胞肺癌患者抗癌治疗的一个有希望的靶点。

关键词：非小细胞肺癌，microRNA-612，溴代多巴胺蛋白4，生物标记物指示剂

介绍

肺癌是人类第三常见的恶性肿瘤，也是全球男性和女性癌症相关死亡的主要原因。¹肺癌有两种主要亚型：非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌。²非小细胞肺癌主要包括鳞癌、腺癌和大细胞癌，是最常见的肺癌类型，约占肺癌患者总数的80%。^三目前，采用手术切除、放射治疗和靶向治疗等综合治疗可以显著改善非小细胞肺癌患者的预后；不幸的是，长期治疗结果仍不令人满意，5年生存率<16.8%。⁴多种危险因素已被证明参与非小细胞肺癌的发病机制，⁵^,⁶^,⁷包括环境污染、吸烟和接触致癌物；然而，确切的机制尚未完全理解。因此，进一步研究非小细胞肺癌发生发展的详细机制，对于开发有效的治疗技术和改善非小细胞肝癌患者的预后至关重要。

microRNAs（miRNAs）是一组高度保守的非编码短RNA，主要在植物、动物和病毒基因组中表达。⁸在人类基因组中已经鉴定出2000多个成熟的miRNAs，预计它们能够调节三分之一的蛋白质编码基因的表达。⁹成熟的miRNAs通过序列特异性结合其靶基因的3′-UTR来负调控基因表达，最终导致mRNA降解或翻译抑制。¹⁰miRNAs对广泛的生物学行为具有广泛的影响，包括细胞增殖、细胞周期、凋亡、分化、代谢、上皮-间充质转化和转移。¹¹^,¹²^,¹³特别是，在非小细胞肺癌中发现了许多miRNAs失调，包括miR-374b，¹⁴miR-500，¹⁵miR-628，¹⁵和miR-647。¹⁶基于其靶基因的生物学功能，miRNA可能在NSCLC的形成和发展中发挥肿瘤抑制或致癌作用。¹⁷这一观察清楚地表明，miRNAs可能是治疗非小细胞肺癌患者的有效靶点。

miR-612已成为多种人类癌症中与癌症相关的miRNA，包括膀胱癌，¹⁸黑色素瘤，¹⁹结直肠癌，²⁰卵巢癌，²¹子宫内膜癌。²²然而，miR-612在非小细胞肺癌中的表达和潜在作用尚不清楚，而miR-611在非小淋巴细胞肺癌中抑瘤作用的分子机制尚不清楚。因此，我们评估了miR-612在非小细胞肺癌中的表达，并检查了其与非小细胞癌患者临床病理特征的关系。此外，还探讨了miR-612对非小细胞肺癌细胞的生物学作用及其机制。我们证明了miR-612在非小细胞肺癌致癌性中的重要作用，并且这种miRNA可能是非小细胞肝癌患者治疗的潜在靶点。

材料和方法

组织样本

本研究经哈尔滨医科大学附属第二医院伦理委员会批准。所有参与者都提供了书面知情同意书。从哈尔滨医科大学附属第二医院手术切除的患者中采集57对非小细胞肺癌组织和相应的邻近正常组织。切除术后，所有组织样本都迅速储存在液氮中。没有一名患者在手术前接受任何额外的治疗。

细胞培养和转染

总共从上海生物化学与细胞生物学研究所（中国上海）订购了五种人类非小细胞肺癌细胞系，包括H522、H460、H1299、A549和SK-MES-1，以及一种非肿瘤性支气管上皮BEAS-2B。使用含有10%FBS（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100μg/mL）的DMEM（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市，吉博科；赛默飞世尔科学公司）培养上述所有细胞系。所有细胞均在37°C的湿度条件下生长，并提供5%的CO₂.

miR-612 agomiR（agomiR-612）和阴性对照agomiC（agomi R-NC）来自上海基因制药有限公司（中国上海）。小干扰RNA（siRNA）对抗溴代多巴胺的表达蛋白4（BRD4）（BRD4-siRNA）和阴性对照siRNA（NC siRNA）购自中国科学院（长春）。BRD4过表达质粒（pCMV-BRD4）和空pCMV质粒由广州瑞宝生物科技有限公司（中国广州）制备。细胞以6个孔的密度被镀入6孔板 × 10⁵ 每个孔的细胞数。根据制造商的协议，用Lipofectamine 2000（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）介导转染实验。

逆转录定量PCR（RT‑qPCR）

根据制造商的方案，使用TRIzol试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）分离组织样品或培养细胞的总RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度计（NanoDrot Technologies，Wilmington，DE，USA）测定总RNA的浓度。使用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.）将总RNA转化为第一链互补DNA（cDNA）。使用TaqMan MicroRNA qPCR检测试剂盒（Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.）定量miR-612的表达。为了检测BRD4 mRNA的表达，采用M-MLV（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）合成cDNA，然后使用SYBR Premix Ex Taq™试剂盒（日本东京TaKaRa）对cDNA进行定量PCR。miR-612和BRD4 mRNA水平分别归一化为U6小核RNA和GAPDH。使用2计算相对基因表达^-ΔΔCt方法。²³

细胞计数试剂盒8（CCK-8）分析

采用CCK-8法检测NSCLC细胞的增殖。具体而言，转染细胞在转染24小时后进行胰蛋白酶消化、计数，并以3000个细胞/孔的初始密度接种到96个微孔板中。然后将细胞在37°C下培养0、24、48和72小时。在每个时间点通过向每个孔中添加10µL CCK-8试剂（日本熊本市道津道）进行CCK-8分析。在37°C下孵育2 h后，使用微孔板阅读器（BioTek，Winooski，VT，USA）检测450 nm波长下的吸光度。

流式细胞仪分析

使用Annexin V–异硫氰酸荧光素（FITC）凋亡检测试剂盒（Biolegend，加利福尼亚州圣地亚哥，美国），利用流式细胞术分析检测细胞凋亡。转染后48小时，收获细胞并用冰冷的PBS（Gibco；赛默飞世尔科学公司）洗涤三次。此后，将细胞悬浮在100µL的结合缓冲液中，该结合缓冲液补充有5µL Annexin V-FITC和5µL碘化丙啶。孵育30天后细胞凋亡率通过流式细胞仪测定（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA）。

跨井运移和侵入分析

将转染细胞胰蛋白酶化并悬浮于无FBS的DMEM培养基中。总计5×10⁴细胞被添加到Matrigel-coated Transwell室（BD Biosciences）的上部隔间，其中包含8个 μm孔径聚碳酸酯膜。房间的下隔间里装满了600个 μL含20%FBS的DMEM作为化学吸引剂。然后在5%CO下培养细胞₂在37°C下放置24小时。随后，用棉签将保留在上部腔室中的细胞取出。侵入聚碳酸酯膜下侧的侵入细胞用4%多聚甲醛固定，并用0.05%结晶紫染色。在倒置显微镜（IX83；Olympus Corporation，Tokyo，Japan）下对侵入的细胞进行拍照，并将侵入能力表示为每个腔室随机选择的五个显微镜场中侵入细胞的平均数量。Transwell迁移试验的执行与侵入试验类似，只是Transwell腔室没有涂上Matrigel。

体内肿瘤生长测定

用agomiR-612或agomiR-NC转染H522细胞。培养24小时后，收集转染细胞，并将其皮下注射到BALB/c裸鼠的侧翼（北京维塔尔河实验室，中国北京）。异种移植物的体积使用以下公式计算：长度 × 宽度²×0.5. 接种4周后处死所有裸鼠。切除异种移植物并称重。所有涉及动物的程序均经哈尔滨医科大学第二附属医院实验动物伦理委员会批准，并按照《赫尔辛基宣言》和哈尔滨医科学院第二附属医院伦理委员会的指导方针执行。

miR-612靶点预测

miR-612的假定靶点是使用两个公开的数据库预测的：microRNA.org(http://www.microrna.org/microrna/home.do)和TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)。

荧光素酶报告试验

包含预测野生型（Wt）或突变型（Mut）miR-612结合序列的BRD4的3′-UTR序列由上海基因制药有限公司扩增，并克隆到pMIR-REPORT miRNA表达报告载体（Ambion；Thermo Fisher Scientific，Inc.）中。构建的荧光素酶报告质粒分别定义为pMIR-Wt-BRD4-3-UTR和pMIR-Mut-BRD4-3-UTR。根据制造商的方案，使用Lipofectamine 2000将pMIR-Wt-BRD4-3ʹ-UTR或pMIR-Mut-BRD4-3ᭁ-UTR以及agomiR-612或agomiR-NC引入细胞进行报告试验。荧光素酶活性在48 使用Dual-Luciferase®Reporter分析系统（Promega）转染后小时。萤火虫荧光素酶活性归一化为Renilla荧光素酶活性。

蛋白质印迹分析

使用总蛋白提取试剂盒（南京科根生物技术有限公司，中国南京）分离组织样品或培养细胞的总蛋白。使用BCA测定试剂盒（南京科创生物技术有限公司）检测总蛋白浓度。使用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶分离等量的蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯膜（EMD Millipore，Billerica，MA，USA）。随后，在室温下将膜封闭在5%脱脂奶粉中2小时，脱脂奶粉溶解在含有0.1%吐温-20（TBST）的Tris缓冲盐水中。用一级抗体在4°C下培养过夜后，用TBST清洗膜三次，然后在室温下用山羊抗鼠（ab97023）或山羊抗兔（ab97051）辣根过氧化物酶结合IgG二级抗体（1:5000稀释；英国剑桥Abcam）培养1小时。最后，采用ECL Western Blotting分析系统（美国伊利诺伊州芝加哥GE Healthcare）对蛋白质条带进行可视化。本研究中使用的主要抗体包括兔抗人BRD4抗体（ab128874；1:500稀释；Abcam）、兔抗人磷酸化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶单克隆抗体（p-Pi3K；ab182651；1:1000稀释；Abcam）、鼠抗人单克隆Pi3K抗体（ab86714；1:1000稀稀释；Abcam）、，磷酸化蛋白激酶B的兔抗人单克隆抗体（p-Akt；sc-81433；1:1000稀释；Santa Cruz Biotechnology，Santa Crux，CA，USA）、兔抗人的单克隆Akt抗体（ab179463；1:100稀释；Abcam）和鼠抗人GAPDH抗体（ab9484；1:500稀释；Abcam）。GAPDH起到了内部控制的作用。

统计分析

数据显示为平均值 ± SD并使用SPSS 19.0版软件（IBM，Armonk，New York，USA）进行分析。非小细胞肺癌患者中miR-612的表达与临床病理因素之间的关系通过χ²测试。采用Spearman相关分析研究非小细胞肺癌组织中miR-612和BRD4 mRNA的相关性。使用双尾Student’st吨-测试。学生–Newman–Keuls之后的单向方差分析事后（post-hoc）检验用于分析多组之间的统计学显著性。采用Kaplan–Meier生存分析评估miR-612对非小细胞肺癌患者的预后价值。统计显著性水平设定为P（P）<0.05.

结果

miR-612下调与非小细胞肺癌预后不良相关

为了阐明miR-612在非小细胞肺癌中的表达谱，首次采用RT-qPCR检测了57对非小细胞癌组织和ANT中miR-611的表达。

结果表明，与ANT相比，非小细胞肺癌组织中miR-612的表达显著降低(图1A,P（P）<0.05). 此外，利用RT-qPCR研究了miR-612在五种人类NSCLC细胞系（H522、H460、H1299、A549和SK-MES-1）和非肿瘤性支气管上皮BEAS-2B中的表达差异。与观察到的非小细胞肺癌组织的趋势一致，miR-612在所有受试非小细胞癌细胞系中的表达水平显著低于BEAS-2B(图1B,P（P）<0.05).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为OTT-12-4167-g0001.jpg

在单独的窗口中打开

图1

miR-612在非小细胞肺癌（NSCLC）组织和细胞系中下调。(一个)采用RT-qPCR对57对非小细胞肺癌组织及相应的邻近正常组织（ANTs）中miR-612进行定量*P（P）与ANT相比<0.05。(B类)RT-qPCR用于评估五种人类NSCLC细胞系（H522、H460、H1299、A549和SK-MES-1）和非肿瘤性支气管上皮BEAS-2B中miR-612的表达*P（P）与BEAS-2B相比<0.05。(C类)采用Kaplan-Meier生存分析评估miR-612对非小细胞肺癌患者的预后价值*P（P）与miR-612高表达组相比，<0.05。^‡P（P）-这些值来自Chi-square测试。

为了评估miR-612在非小细胞肺癌患者中的临床价值，根据miR-611在非小淋巴细胞肺癌组织中的中位数，将所有非小细胞癌患者分为miR-613高表达组和低表达组。miR-612表达降低与肿瘤结节转移分期系统（TNM）分期显著相关(P（P）=0.017），淋巴结转移(P（P）=0.007），但与年龄、性别、肿瘤大小或吸烟无关(表1，全部P（P）>0.05). 此外，患有NSCLC且miR-612表达较低的患者的总生存率较差(图1C,P（P）=0.0064). 这些结果提示miR-612的下调可能与NSCLC患者预后不良密切相关。

表1

非小细胞肺癌患者miR-612表达与临床病理参数的相关性

参数	miR-612表达		P（P）
低(n个=29)	高(n个=28)
年龄（岁）			0.424
<60	19	15
≥60	10	13
性别			0.599
男性	12	14
女性	17	14
肿瘤大小（cm）			0.585
<三	20	17
≥三	9	11
吸烟			0.106
不	14	20
是的	15	8
淋巴结转移			0.017^一
否定	9	18
积极的	20	10
TNM阶段			0.007^一
I–II级	11	21
三	18	7

在单独的窗口中打开

注： ^一P（P）<0.05.

缩写：TNM，肿瘤结节转移分期系统。

miR-612抑制NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭并诱导其凋亡

正如我们发现miR-612在非小细胞肺癌中低水平表达一样，我们推断miR-611可能在NSCLC细胞中发挥肿瘤抑制作用。为此，将agomiR-612导入H522和A549细胞以增加内源性miR-612的表达(图2A,P（P）<0.05). 在此，使用CCK-8检测miR-612过度表达对NSCLC细胞增殖的影响。转染agomiR-612的H522和A549细胞的增殖能力比转染agromiR-NC组明显降低(图2B,P（P）<0.05). 此外，我们通过流式细胞术分析检测了miR-612过度表达的H522和A549细胞的凋亡。观察到agomiR-612转染显著增加H522和A549细胞的凋亡(图2C,P（P）<0.05).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为OTT-12-4167-g0002.jpg

在单独的窗口中打开

图2

miR-612过表达损害H522和A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并诱导其凋亡。(一个)转染agomiR-612或agomiR-NC后，在H522和A549细胞中检测到miR-612的表达*P（P）<0.05 vs agomiR-NC(B类)CCK-8分析检测的细胞增殖结果显示，miR-612上调可降低H522和A549细胞的增殖*P（P）<0.05 vs agomiR-NC(C类)流式细胞术检测凋亡细胞，结果表明miR-612过表达增加了H522和A549细胞的凋亡*P（P）与agomiR NC相比<0.05(D类和E类)利用Transwell迁移和侵袭实验测量miR-612上调后H522和A549细胞的迁移和侵袭*P（P）<0.05 vs agomiR-NC。

应用Transwell迁移和侵袭实验，探讨miR-612在NSCLC细胞转移中的确切作用。候鸟(图2D,P（P）<0.05）和侵入性(图2E,P（P）<0.05）上调miR-612后，H522和A549细胞的容量显著降低。这些结果表明miR-612能够抑制NSCLC细胞的生长和转移在体外.

BRD4是NSCLC细胞中miR-612的直接靶点

由于miRNAs通过调节其靶基因的表达发挥作用，⁹利用生物信息学分析预测miR-612的潜在靶基因。BRD4，包含miR-612的互补结合位点(图3A)由于该基因被报道为非小细胞肺癌发展的调节因子，因此被选择用于进一步鉴定。²⁴^,²⁵为了证实miR-612对NSCLC细胞中BRD4的调节作用，对转染agomiR-612或agomiR-NC的H522和A549细胞进行了RT-qPCR和蛋白质印迹分析。结果表明，BRD4mRNA的表达水平(图3B,P（P）<0.05）和蛋白质(图3C,P（P）<0.05）在miR-612上调后H522和A549细胞中下调。进一步采用荧光素酶报告分析来探讨BRD4的3ʹ-UTR是否能被miR-612直接靶向于NSCLC细胞。如所示图3DH522和A549细胞中miR-612的上调明显抑制了含有Wt-miR-611结合位点的质粒的荧光素酶活性(P（P）<0.05); 然而，miR-612表达的改变并不影响含有Mut结合位点的质粒的荧光素酶活性。总之，这些结果表明BRD4是NSCLC细胞中miR-612的直接靶基因。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为OTT-12-4167-g0003.jpg

在单独的窗口中打开

图3

巴西雷亚尔4是NSCLC细胞中miR-612的直接靶基因。(一个)miR-612及其在BRD4的3′-UTR中的假定结合位点。还显示了突变结合位点。(B类和C类)通过RT-qPCR和western blot分析分别测定miR-612过度表达H522和A549细胞BRD4的mRNA和蛋白水平*P（P）<0.05 vs agomiR-NC(D类)采用荧光素酶报告子分析法检测与agomiR-612或agomiR-NC和pMIR-Wt-BRD4-3ʹ-UTR或pMIR-Mut-BRD4-\697\-UTR联合转染后H522和A549细胞中的荧光素酶活性*P（P）<0.05 vs agomiR-NC。

非小细胞肺癌组织中miR-612的表达与BRD4的表达呈负相关

我们进一步测量了BRD4在非小细胞肺癌组织中的表达，并探讨了miR-612和BRD4的表达相关性。RT-qPCR分析结果显示，BRD4 mRNA在非小细胞肺癌组织中的表达明显高于ANT组织(图4A,P（P）<0.05). 此外，非小细胞肺癌组织中BRD4 mRNA水平与miR-612表达呈负相关(图4B;R（右）²=0.3470,P（P）<0.0001). 此外，BRD4 mRNA(图4C,P（P）<0.05）和蛋白质(图4D,P（P）<0.05）在miR-612高表达组中的表达明显低于在miR-612低表达组中的表达。这些结果证实，在非小细胞肺癌组织中，miR-612的表达与BRD4的表达呈负相关。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为OTT-12-4167-g0004.jpg

在单独的窗口中打开

图4

非小细胞肺癌组织中BRD4的表达与miR-612的表达呈负相关。(一个)采用RT-qPCR方法检测57对非小细胞肺癌组织及相应ANT中BRD4 mRNA的表达*P（P）与ANT相比<0.05。(B类)采用Spearman相关分析法分析非小细胞肺癌组织中miR-612和BRD4 mRNA水平的表达相关性。R（右）²=0.3470,P（P）<0.0001. (C类和D类)miR-612高表达组的BRD4 mRNA和蛋白水平显著低于miR-611低表达组*P（P）与miR-612低表达组相比，<0.05。

沉默BRD4表达抑制非小细胞肺癌细胞的生长和转移在体外

由于BRD4被确定为非小细胞肺癌细胞中miR-612的直接靶点，我们接下来试图确定BRD4抑制的功能是否与非小细胞肝癌细胞中miR612过度表达诱导的功能相似。将BRD4 siRNA转染H522和A549细胞，转染BRD4后H522、A549细胞中BRD4蛋白水平被有效降低(图5A,P（P）<0.05). CCK-8和流式细胞术分析显示，BRD4的下调显著抑制了细胞增殖(图5B,P（P）<0.05），但促进细胞凋亡(图5C,P（P）<0.05）。迁移(图5D,P（P）<0.05）和侵袭(图5E,P（P）经Transwell迁移和侵袭试验测定，BRD4敲除后，H522和A549细胞中的表达受到抑制。这些结果清楚地表明，沉默BRD4表达可以模拟非小细胞肺癌细胞中miR-612上调的抑瘤作用，进一步表明巴西雷亚尔4作为非小细胞肺癌细胞中miR-612的直接靶基因。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为OTT-12-4167-g0005.jpg

在单独的窗口中打开

图5

BRD4沉默抑制H522和A549细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导其凋亡。收集转染BRD4 siRNA或NC siRNA的H522和A549细胞，并用于以下分析。(一个)转染细胞进行western blot分析以确定BRD4蛋白水平*P（P）<0.05 vs NC siRNA(B类和C类)分别用CCK-8法和流式细胞术检测指示细胞的增殖和凋亡*P（P）<0.05 vs NC siRNA(D类和E类)使用Transwell迁移和侵袭分析探索上述细胞的迁移和侵袭*P（P）<0.05 vs NC siRNA。

BRD4逆转miR-612上调对NSCLC细胞恶性表型的抑制作用

正如所揭示的那样，miR-612在非小细胞肺癌的进展中发挥肿瘤抑制作用，并伴随着巴西雷亚尔4作为非小细胞肺癌细胞中miR-612的直接靶基因，我们进行了一系列拯救实验，以评估BRD4是否对miR-612-介导的非小细胞肝癌细胞恶性表型至关重要。BRD4过表达质粒pCMV-BRD4或空pCMV质粒与agomiR-612共转染H522和A549细胞。Western blot分析证实，pCMV-BRD4联合转染可恢复转染agomiR-612的H522和A549细胞中BRD4蛋白的表达(图6A,P（P）<0.05). BRD4表达的恢复部分消除了miR-612过度表达对细胞增殖的影响(图6B,P（P）<0.05）、细胞凋亡(图6C,P（P）<0.05），迁移(图6D,P（P）<0.05）和侵袭(图6E,P（P）<0.05）。这些结果进一步证明BRD4是非小细胞肺癌细胞中miR-612的直接下游效应器，抑制BRD4对miR-612-介导的非小细胞肝癌细胞的抗癌作用至关重要。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为OTT-12-4167-g0006.jpg

在单独的窗口中打开

图6

BRD4表达的恢复部分逆转了miR-612介导的对非小细胞肺癌细胞的作用。用BRD4过表达质粒pCMV-BRD4或空pCMV质粒转染miR-612过表达的H522和A549细胞。在不同的孵育期后收集转染细胞并用于随后的检测。(一个)Western blot分析用于量化BRD4蛋白水平*P（P）<0.05 vs agomiR-NC**P（P）<0.05 vs agomiR-612+pCMV。(B类–E类)分别使用CCK-8、流式细胞仪分析和Transwell迁移和侵袭分析来测定所述处理的H522和A549细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭*P（P）与agomiR NC相比<0.05**P（P）与agomiR-612+pCMV相比，<0.05。

miR-612通过靶向BRD4抑制NSCLC细胞中的Pi3K/Akt信号通路

为了进一步了解miR-612抑制非小细胞肺癌恶性发展的确切机制，我们研究了miR-611对重要信号通路的影响。由于BRD4参与PI3K/Akt通路的调节，²⁶我们探讨了在非小细胞肺癌细胞中miR-612过度表达是否可以使该途径失活。我们发现转染agomiR-612可降低H522和A549细胞中p-PI3K和p-Akt的蛋白水平。值得注意的是，BRD4的恢复表达可以消除miR-612过度表达对H522和A549细胞中p-PI3K和p-Akt水平的抑制作用(图7). 因此，这些观察结果表明，miR-612直接靶向BRD4，以抑制NSCLC细胞中PI3K/Akt通路的激活。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为OTT-12-4167-g0007.jpg

在单独的窗口中打开

图7

miR-612通过直接靶向BRD4降低H522和A549细胞中PI3K/Akt途径的激活。Agomir-612与pCMV-BRD4或pCMV共同转染到H522和A549细胞中。培养72小时后，进行western blot分析，以量化p-PI3K、PI3K和，第页-Akt和Akt表达水平。

miR-612损害非小细胞肺癌的生长体内通过调节BRD4/PI3K/Akt途径

为了进一步研究miR-612在非小细胞肺癌中的抑瘤作用体内采用肿瘤生长试验研究miR-612上调对肿瘤生长的影响。音量(图8A和和B，B类,P（P）<0.05）和重量(图8C,P（P）<0.05）agomiR-612组肿瘤明显低于agomiR-NC组。接下来，使用RT-qPCR检测miR-612在肿瘤异种移植物中的表达。数据表明，与agomiR-NC组相比，来自agomiR612转染H522细胞的肿瘤异种移植物中miR-612的表达更高(图8D,P（P）<0.05). 此外，蛋白质印迹分析表明，从agomiR-612组获得的肿瘤异种移植物显示出BRD4的表达降低，第页-PI3K和第页-Akt与agomiR-NC组比较(图8E). 这些结果表明miR-612的上调阻碍了NSCLC的生长体内BRD4的下调和PI3K/Akt通路的失活可能是miR-612抑制NSCLC生长的原因体内.

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为OTT-12-4167-g0008.jpg

在单独的窗口中打开

图8

miR-612抑制非小细胞肺癌肿瘤生长体内. (一个)移植有agomiR-612或agomiR-NC转染的H522细胞的裸鼠肿瘤异种移植物的代表性图像。(B类)agomiR-612或agomiR-NC组的肿瘤生长曲线*P（P）<0.05 vs agomiR-NC(C类)在移植后4周处死所有裸鼠后，测定肿瘤异种移植物的重量*P（P）<0.05 vs agomiR-NC(D类)对肿瘤异种移植物进行RT-qPCR分析以评估miR-612的表达*P（P）与agomiR NC相比<0.05(E类)对肿瘤异种移植物进行western blot分析，以确定BRD4、p-PI3K、PI3K，p-Akt和Akt蛋白的表达水平。

讨论

最近，各种研究报道了非小细胞肺癌中miRNAs的异常表达。²⁷^,²⁸^,²⁹miRNAs的失调对非小细胞肺癌的病理生物学行为具有抑瘤或促瘤作用。³⁰更重要的是，miRNAs被认为是非小细胞肺癌患者抗癌治疗的有吸引力的靶点。²⁶因此，研究非小细胞肺癌（NSCLC）中癌相关miRNA的表达谱和特异功能至关重要，它可能为确定NSCLC治疗的潜在治疗靶点提供新的见解。在本研究中，我们首次检测了miR-612在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达模式，并评估了其在NSCLC患者中的临床价值。值得注意的是，miR-612在非小细胞肺癌侵袭行为中的功能作用和调控机制得到了深入探讨。我们的结果显示miR-612抑制了非小细胞肺癌的恶性发展在体外而我体内这是一个由BRD4直接靶向介导的过程，与PI3K/Akt信号的失活有关。

据报道，miR-612在多种人类癌症中异常表达。例如，miR-612在膀胱癌中的表达降低，而miR-611表达降低与肿瘤分期、淋巴结转移和远处转移有关。¹⁸miR-612在黑色素瘤中下调，其下调与黑色素瘤厚度和淋巴结转移显著相关。¹⁹miR-612低表达的黑色素瘤患者的总体生存率和无病生存率较低。¹⁹miR-612在结直肠癌中低水平表达，低水平表达与肿瘤转移有明显相关性。²⁰miR-612在卵巢癌中也低水平表达²¹子宫内膜癌。²²然而，miR-612在非小细胞肺癌中的表达模式和临床意义尚不清楚。在本研究中，我们发现miR-612在非小细胞肺癌组织标本和一组细胞系中下调。miR-612的下调与非小细胞肺癌患者的TNM分期和淋巴结转移密切相关。miR-612低表达的NSCLC患者预后较差。这些结果表明miR-612可以作为非小细胞肺癌患者的诊断和预后标志物。

miR-612在恶性肿瘤的调控中起着至关重要的作用。例如，外源性miR-612的表达限制膀胱癌细胞的生长、转移、上皮-间质转化在体外和肿瘤生长体内.¹⁸miR-612的过度表达抑制黑色素瘤细胞的增殖、集落形成和侵袭，并损害肿瘤生长体内.¹⁹miR-612表达的恢复会减弱细胞增殖、迁移和上皮-间充质转化，并降低肿瘤生长体内在结直肠癌中。²⁰miR-612还通过调节细胞增殖、集落形成、转移、上皮-间充质转化、干细胞样特性和耐药性，在非小细胞肺癌的恶性发展中发挥抑瘤作用。³¹^,³²^,³³然而，miR-612在非小细胞肺癌进展中的生物学功能尚不清楚。在此，一系列功能实验表明，miR-612过度表达抑制了NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭在体外，促进细胞凋亡在体外减少肿瘤生长体内这些结果表明，miR-612是一种肿瘤抑制性miRNA，在非小细胞肺癌的发生和发展中发挥着重要的调节作用，表明miR-611是非小细胞肝癌的一个新的治疗靶点。

关于潜在机制，包括苹果酸酶1在内的多个基因，¹⁸特别是，¹⁹AKT2，²⁰特异性蛋白，1³³和HOXA13，²¹已确认为miR-612的直接靶点。在本研究中，我们探索了miR-612抑制非小细胞肺癌肿瘤过程的确切分子机制。BRD4是溴代多巴胺和末端外结构域（BET）家族的成员，³⁴被证明是NSCLC细胞中miR-612的一个新的直接靶点。BRD4在非小细胞肺癌中高水平表达，BRD4高表达与组织学类型、淋巴结转移、肿瘤分期和分化有显著相关性。²⁴BRD4高表达的非小细胞肺癌患者的预后比BRD4低表达的患者差。²⁴BRD4在负性调节NSCLC细胞生长、凋亡、迁移和侵袭中发挥关键作用。²⁴^,²⁵在此，我们证明miR-612通过直接靶向其3ʹ-UTR抑制BRD4表达，随后抑制PI3K/Akt通路的激活，从而抑制NSCLC细胞的恶性表型在体外和体内因此，使用miR-612介导的靶向治疗沉默BRD4并阻断PI3K/Akt通路可能是治疗非小细胞肺癌患者的潜在方法。

结论

总之，本研究表明，miR-612在非小细胞肺癌中的表达降低，低表达预示着非小细胞肝癌患者的生存率较差。外源性miR-612表达抑制了NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，并通过直接靶向BRD4和PI3K/Akt通路的失活促进了细胞凋亡。因此，这些观察结果表明，miR-612在非小细胞肺癌（NSCLC）中起到肿瘤抑制miRNA的作用，可能是NSCLC治疗的一个有希望的靶点。然而，这项研究的样本量很小。此外，我们没有使用antagomiR-612来沉默内源性miR-612的表达，并探讨了miR-611敲低对NSCLC细胞恶性度的影响。我们将在不久的将来解决这两个限制。

致谢

本研究得到黑龙江省博士后科学基金（LBH）的资助-Z16110号)吴洁平医学基金临床研究基金（320.6750.17138）、中国博士后科学基金（2017M610213）。

披露

作者声明，他们在这项工作中没有相互竞争的利益。

工具书类

1Torre LA、Bray F、Siegel RL、Ferlay J、Lorte-Tieunt J、Jemal A。2012年全球癌症统计.临床医师肿瘤杂志. 2015;65：87–108。doi:10.3322/caac.21262[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

2李昕，张强，范凯，等。TRPV3的过度表达与非小细胞肺癌的进展相关.国际分子科学杂志. 2016;17:437.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

三。原田H、村山S。质子束治疗非小细胞肺癌：最新进展.肺癌. 2017;8:141–145. doi:10.2147/LCTT。117647元[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

4Ettinger DS、Akerley W、Borghaei H等人。非小细胞肺癌.美国国家癌症研究中心癌症网络2012年；10:1236–1271. [公共医学][谷歌学者]

5Boffetta P，Nyberg F。环境因素对癌症风险的贡献.英国医学公牛. 2003;68:71–94. [公共医学][谷歌学者]

6加利福尼亚州里奇，麦克莱恩AM，金斯伯格MS。肺癌流行病学.Semin Intervent Radio公司2013年；30:93–98. doi:10.1055/s-0033-1342949[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

7de Groot PM、Wu CC、Carter BW、Munden RF。肺癌流行病学.Transl肺癌研究. 2018;7:220–233. doi:10.21037/tlcr.2018.05.06[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

8Badalian-Very G.Hydbring P。microRNA的临床应用.F1000分辨率2013年；2：136.doi:10.12688/f1000研究[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

9哈蒙德SM。microRNA概述.高级药物交付收入. 2015;87：3–14.doi:10.1016/j.addr.2015.05.001[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

10Bartel博士。微RNA：基因组学、生物发生、机制和功能.单元格. 2004;116：281–297。[公共医学][谷歌学者]

11Bartel博士。微小RNA：靶点识别和调节功能.单元格. 2009;136:215–233. doi:10.1016/j.cell.2009.01.002[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

12Hwang HW、Mendell JT。细胞增殖、细胞死亡和肿瘤发生中的微RNA.英国癌症杂志. 2007;96补遗：R40–44。[公共医学][谷歌学者]

13Ryan BM、Robles AI、Harris CC。微RNA网络中的遗传变异：对癌症研究的启示.Nat Rev癌症2010年；10：389–402。doi:10.1038/nrc2867[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

14王毅、于莉、王涛。MicroRNA-374b通过靶向JAM-2的p38/ERK信号通路抑制非小细胞肺癌组织的肿瘤生长并促进凋亡.胸科疾病杂志. 2018;10:5489–5498. doi:10.21037/jtd.2018.09.93[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

15姜明，周丽丽，徐恩，安琪。下调miR-500和miR-628通过靶向ING1抑制非小细胞肺癌的增殖、迁移和侵袭.生物药剂师. 2018;108:1628–1639. doi:10.1016/j.biopha.2018.09.145[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

16张亚思，陈涛，蔡玉杰，等。MicroRNA-647通过NF-kappaB信号通路靶向TRAF2，提高氩氦冷冻治疗非小细胞肺癌的疗效并抑制细胞增殖.Onco目标Ther. 2018;11:6777–6784. doi:10.2147/OTT。159337元[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

17Lamichane SR、Thachil T、De Ieso P、Gee H、Moss SA、Milic N。microRNA在人类非小细胞肺癌中的预后作用：一项系统综述和荟萃分析.Dis标记. 2018;2018：8309015.doi:10.1155/2018/8309015[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

18刘明，陈毅，黄斌，等。microRNA-612靶向苹果酸酶1表达对膀胱癌细胞的抑瘤作用.国际癌症杂志. 2018;52：1923年至1933年。doi:10.3892/ijo.2018.4342[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

19朱毅、张和林、王庆毅、陈美杰、刘斌。microRNA-612的过度表达通过靶向Espin抑制黑色素瘤细胞的生长、侵袭和肿瘤发生.分子电池. 2018;41:119–126. doi:10.14348/molcells.2018.2235[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

20盛力，何鹏，杨X，周M，冯Q。miR-612通过靶向AKT2负调控结直肠癌生长和转移.细胞死亡病. 2015;6：e1808.doi:10.1038/cddis.2015.184[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

21于浩，徐毅，张德，刘刚。长非编码RNA LUCAT1通过调控miR-612/HOXA13通路促进卵巢癌恶性化.生物化学-生物物理研究委员会. 2018;503:2095–2100. doi:10.1016/j.brc.2018.07.165[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

22Zhang L，Wang DL，Yu P。LncRNA H19通过与miR-612竞争调控其靶基因HOXA10在子宫内膜癌中的表达.欧洲药理学评论. 2018;22:4820–4827. doi:10.26355/eurrev_201808_15617[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

23Livak KJ、Schmittgen TD。使用实时定量PCR和2（-Delta Delta C（T））方法分析相关基因表达数据.方法. 2001;25:402–408. doi:10.1006/meth.2001.1262[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

24廖义夫，吴玉斌，龙X，等。高水平BRD4促进非小细胞肺癌进展.Oncotarget公司. 2016;7:9491–9500. doi:10.18632/目标7068[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

25高Z，袁T，周X，等。靶向BRD4蛋白通过下调eIF4E表达抑制非小细胞肺癌的生长.癌症生物治疗. 2018;19:407–415. doi:10.1080/15384047-2018.1423923[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

26Boeri M、Pastorino U、Sozzi G。microRNA在肺癌中的作用：microRNA特征在癌症预后中的作用.癌症J. 2012;18:268–274. doi:10.1097/PPO.0b013e318258b743[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

27姜伟、何毅、史毅等。微小RNA-1204通过调节PITX1促进非小细胞肺癌细胞增殖.细胞生物Int. 2018. doi:10.1002/cbin.11083[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

28谢强，于泽，陆毅，樊杰，倪毅，马磊。microRNA-148a-3p通过调节Ras/MAPK/Erk信号通路抑制非小细胞肺癌的增殖和上皮-间质转化进程.J细胞生理学. 2018. doi:10.1002/jcp.27899[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

29Bagheri A、Khorshid HRK、Tavallaie M等人。非小细胞肺癌中的一组非编码RNA.J细胞生物化学Epub 2018年11月28日。[公共医学][谷歌学者]

30高伟，徐杰，舒YQ。miRNA的表达及其在非小细胞肺癌预防和诊断中的临床意义.Respir Med专家版. 2011;5：699–709。doi:10.1586/年11月55日[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

31陶志华，万杰，曾丽丽，等。miR-612抑制肝细胞癌侵袭转移级联反应.实验医学杂志2013年；210:789–803. doi:10.1084/jem.20120153[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

32唐杰，陶志华，文德，等。MiR-612通过Wnt/beta-catenin信号抑制肝癌干细胞.生物化学-生物物理研究委员会. 2014;447:210–215. doi:10.1016/j.bbrc.2014.03.135[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

33刘毅、刘德林、董磊等。miR-612通过调节Sp1/Nanog信号抑制肝癌细胞的干细胞样特性.细胞死亡病. 2016;7：e2377.doi:10.1038/cddis.2016.282[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

34Belkina AC，丹尼斯GV。肥胖、炎症和癌症中的BET域共同调节因子.Nat Rev癌症. 2012;12:465–477. doi:10.1038/nrc3256[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

文章来自Onco靶点和治疗由以下人员提供鸽子出版社