介绍
大多数脊椎动物骨骼是由软骨内骨形成生成的，软骨内生长板软骨细胞直接引导随后的骨形成(1). 发育中的生长板有3层形态不同的软骨细胞：圆形软骨细胞、扁平柱状软骨细胞和肥大软骨细胞(补充图1、A和B; 本文的在线补充材料；https://doi.org/10.1172/jci.insight.97903DS1) (2,三). 圆形软骨细胞和扁平柱状软骨细胞在胎儿期都会增殖。扁平柱状软骨细胞增加其增殖速度，然后停止增殖，并扩大许多倍，成为肥大的软骨细胞。胎儿生长板被软骨膜包围，其中未成熟的成骨细胞前体（表达II型胶原的细胞[4]，然后是nestin[5]和osterix[6]）对来自增生前和肥大软骨细胞的信号作出反应，成为成骨细胞(补充图1B).
甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP，也称为甲状旁腺素样[PTH-like]激素[PTHLH]）最初被认为是癌症患者高血清钙的原因(7). 而PTHrP和PTH仅在前13个氨基酸中具有同源性(8)，它们有一个共同的受体(9). 这个托尔普-KO小鼠出生后立即死于呼吸衰竭，该呼吸衰竭是由胸腔周长较小引起的，与正常肋骨软骨中未见的广泛软骨细胞肥大和矿化有关(10)，证明了PTHrP的重要生理作用。由圆形软骨细胞合成并分泌的PTHrP抑制软骨细胞肥大(补充图1B). PTH/PTHrP受体-KO（PTH 1受体[PTH1R]）小鼠类似于托尔普-KO小鼠，前肋软骨细胞肥大和矿化(11). 在人类中，缺乏功能性PTH/PTHrP受体（Blomstrand软骨发育不良）的胎儿表现出类似于第1部分-KO小鼠(12). 此外，软骨细胞特异性托尔普-使用小鼠2型胶原蛋白启动子过度表达人PTHrP蛋白的Tg小鼠显示生长板软骨细胞延迟肥大(13). 杂合（HET）托尔普-Tg（千克）(托尔普-Tg（千克）/+)出生后1周内，小鼠的所有长骨中只有圆形软骨细胞，随后的骨形成也严重延迟(补充图1C).
I类组蛋白脱乙酰酶（HDAC）蛋白（HDAC1、-2、-3和-8）是普遍表达的核酶，具有HDAC活性。组蛋白去乙酰化导致染色质凝聚和随后的转录抑制。相反，IIa类HDAC蛋白（HDAC4、-5、-7和-9）在特定组织中表达，仅表现出最低的HDAC活性(14). 除了变异的HDAC结构域外，IIa类HDAC蛋白具有特征性的N末端延伸，14-3-3蛋白和转录因子（如心肌细胞增强因子2（Mef2））具有保守的结合位点(14). 当与细胞质中的14-3-3蛋白结合时，IIa类HDAC蛋白不会阻止细胞核中Mef2的转录活性。因此，IIa类HDAC蛋白通过14-3-3蛋白的释放和核移位，充当核Mef2的负调控因子(15). 正如预期的那样，Mef2在骨骼肌和心肌中的关键作用，对于IIa类HDAC蛋白的KO小鼠，Hdac5型(16),Hdac7型(17)、和Hdac9型(18)，表现出心血管表型。然而Hdac4型-KO小鼠意外地在软骨细胞中表现出致命表型，其特征是肋骨软骨细胞肥大和矿化，而WT小鼠中没有出现(19).
随后的小鼠遗传学研究发现，Mef2诱导软骨细胞肥大(20). PTHrP对HDAC4/Mef2相互作用的调节随后在使用培养的鸡原代软骨细胞的体外研究中显示(21). 在人类中PTHRP公司(22)或第个，共个HDAC4型(23)导致骨骼发育不良，E型短趾，提示PTHrP和HDAC4之间存在功能联系。然而，尚未在体内对这种功能关系进行直接测试。
在本研究中，我们在体内证明，PTHrP对软骨细胞分化的影响需要HDAC4。我们在体内表明，PTHrP作用导致HDAC4磷酸化降低，并诱导随后的HDAC4蛋白核移位。然而，我们的小鼠模型表明HDAC4不是PTHrP信号的唯一介导者。我们确定HDAC5是软骨细胞中PTHrP信号传导的额外介质，尽管Hdac5型-当HDAC4存在时，KO小鼠没有生长板表型。我们进一步发现，PTHrP对HDAC4的作用抑制了Mef2的作用；否则，Mef2的这种作用将允许runt-related转录因子2(运行2)软骨细胞肥大所需的表达。因此，我们确定了一条重要的信号通路，该通路调节小鼠和人类的软骨细胞分化。
结果
Hdac4-KO骨骼中软骨细胞的加速分化是Pthrp-KO骨骼的一种温和形式。
如果HDAC4是软骨细胞中PTHrP信号的介体，那么托尔普-KO鼠标和Hdac4型-KO小鼠应表现出类似的骨骼表型。我们比较了生长相关软骨细胞的两个典型区域：胫骨近端的生长板和前肋软骨。在新生儿中托尔普-KO小鼠，生长板顶部到肥厚层开始的距离（用黑线表示)由于软骨细胞的加速肥大，其长度非常短(，WT控制的35.3%）。这个Hdac4型-KO小鼠出生时表现出相似但较温和的表型(64.1%的WT控制）。
加速软骨细胞分化Hdac4型-KO骨架是托尔普-KO骨架。胫骨近端生长板的H&E染色（原始放大倍数，×100[A类–C类，顶部]；×40 [D类，顶部]），前胸腔（原始放大倍数，×40[A类和B类，底部]）和前肋软骨（原始放大倍数，×100[C类和D类，底部]）出生时(A类和C类)，第8页(B类)和第12页(D类). 年龄相同的老鼠是室友，除了Hdac4型-KO鼠标进入D类。要比较托尔普-KO鼠标和Hdac4型-KO老鼠正好在同一窝里，我们让Hdac4/Pthrp公司带有Hdac4/Pthrp公司双HET鼠标。(A类). 数字表示增殖软骨细胞区域的平均长度（以黑线表示）（平均值±SEM，n个=3，生物三倍体）*P（P）=7 × 10–7, **P（P）=6 × 10–6，***P=8 × 10–7, ****P（P）=3 × 10–6由双尾学生吨与相应的WT测量值进行比较。A类P（P）小于0.05的值被认为是显著的。黑色箭头表示肋骨软骨细胞肥大和矿化，这在WT对照组中没有发生。比例尺（红线）：500μm。
这个Pthrp公司-KO小鼠出生后立即死亡，原因是正常情况下未发现的前肋软骨中的软骨细胞肥大和矿化，以及随之而来的小胸腔(，黑色箭头）。相比之下Hdac4型-KO小鼠出生时肋骨软骨分化正常(). 逐渐加速的肋骨软骨细胞肥大始于P2(19). 我们观察到大鼠前肋软骨中广泛存在肥大的软骨细胞Hdac4型-KO鼠标位于P8(，黑色箭头）。与进行性肋骨软骨细胞肥大一致Hdac4型-KO小鼠在P10和P14之间死亡。表型与托尔普-KO小鼠支持HDAC4介导PTHrP信号的假设。然而Hdac4型-KO小鼠也提示可能存在PTHrP信号传导的其他介质Hdac4型-KO鼠标。
通用Hdac4-KO小鼠的软骨细胞表型仅依赖软骨细胞中的Hdac4-KO。
排除其他器官中HDAC4缺失引起的系统性影响对普遍性软骨细胞表型有重要贡献的可能性Hdac4型-KO小鼠，我们产生了软骨细胞/骨特异性条件Hdac4型-使用2型胶原蛋白的KO小鼠-Cre公司鼠标(24)以及Hdac4型-被鞭打的老鼠(25). 2型胶原蛋白-Cre公司我们使用的在软骨细胞和软骨膜细胞中具有活性，导致Hdac4型从软骨细胞和成骨细胞，避免广泛KOHdac4型在其他单元格类型中。软骨细胞/骨特异性条件性Hdac4型-KO鼠标(Col2-Cre:Hdac4色谱飞行/飞行)胫骨生长板的增殖区较短(，黑线，62.8%Hdac公司4飞行/飞行对照组）和正常肋软骨()在出生时，就像在宇宙中看到的那样Hdac4型-KO鼠标(). 在P12，两个KO小鼠与新生鼠具有相似的表型托尔普-KO小鼠：胫骨生长板极短，肋骨软骨细胞广泛肥大和矿化，在WT对照组中未见(，黑色箭头）。这个Col2-Cre:Hdac4色谱飞行/飞行小鼠在P14左右死亡Hdac4型-KO鼠标。接下来，我们生成了一个晚期软骨细胞/骨特异性条件Hdac4型-KO鼠标使用成骨相关转录因子抗体-Cre公司(奥斯克斯-Cre）鼠标(26). 这个奥斯克斯-我们使用的Cre在肥大的软骨细胞、软骨膜和成骨细胞中很活跃。相比之下Col2-Cre:Hdac4色谱飞行/飞行鼠标Osx-Cre:Hdac4飞行/飞行小鼠在生长板和骨骼中表现出正常表型(补充图2). 这个Osx-Cre:Hdac4飞行/飞行老鼠可以以正常的身体存活到成年。这一结果表明，普遍存在的软骨细胞表型Hdac4型-KO小鼠只依赖增殖的软骨细胞。
我们在最初的实验中并没有得到这个直接的结果。在第五代回交时Hdac4型-漂浮小鼠（混合遗传背景）到C57BL/6小鼠，软骨细胞特异性条件Hdac4型-KO小鼠仅在四肢的生长板软骨细胞中表现出明确的表型，而在肋骨软骨细胞中则没有。只有回交10代才能观察到肋骨表型。这一发现强调了在解释特定突变的影响时统一遗传背景的重要性。
PTHrP和HDAC4通过共同途径发挥作用。
为了检测PTHrP和HDAC4是否通过共同途径工作，我们接下来分析了小鼠双HETPthrp公司和Hdac4型.两只HET小鼠的生长板长度均正常(，黑线）。如果PTHrP和HDAC4独立工作，那么双HET小鼠也应该具有正常的生长板。然而，双HET小鼠的增殖区明显较短(（黑线，占WT对照的85.4%），这可能是生长板中PTHrP作用降低的结果。双HET小鼠的表型轻微，但与单个KO小鼠的表型相似(). 本实验表明，PTHrP和HDAC4通过共同途径抑制软骨细胞肥大。
PTHrP和HDAC4通过共同途径发挥作用。(A类)出生时胫骨近端生长板的H&E染色（原始放大倍数，×100）。图中的老鼠是同窝老鼠。数字表示增殖软骨细胞区域的平均长度（以黑线表示）（平均值±SEM，n个=3，生物三倍体）*P（P）<0.0003，采用随机截距线性混合效应模型（SAS Institute）。A类P（P）小于0.05的值被认为是显著的。(B类)出生时整个胫骨的H&E染色（原始放大倍数，×20）。图中所示的老鼠是在Hdac4型-HET鼠标和Hdac4型-HET公司-托尔普-Tg/+鼠标。黑色箭头表示扁平柱状和肥大的软骨细胞区域。黑线表示肥大软骨细胞层的长度。表型的重复性由3只独立的幼崽证实。(C类和D类)ISH用于小时mRNA和第10a1列胫骨内侧和人的mRNA托尔普胫骨近端生长板处的mRNA（原始放大倍数，×100）。与中所示的鼠标相同B类.比例尺（红线）：500μm。
作为PTHrP作用是否需要HDAC4活性的更严格的基因检测，我们删除了Hdac4型基因托尔普-Tg/+鼠标。如果HDAC4介导PTHrP信号，则Hdac4型缺失应改变PTHrP-Tg表型。甚至HET删除Hdac4型出生时部分阻断PTHrP-Tg表型(,Hdac4型-HET（高等教育技术）：托尔普-Tg/+鼠标）。胫骨比托尔普-Tg/+小鼠，我们在胫骨中观察到扁平柱状软骨细胞和肥大的软骨细胞(，黑色箭头），未在托尔普-Tg/+出生时的小鼠。ISH对印度刺猬mRNA（Ihh，一种在增生前和早期软骨细胞中表达的基因）和10型胶原mRNA（Col10a1，一种表达于增生软骨细胞的基因）的研究证实了这些发现().
引人注目的是Hdac4型PTHrP-Tg表型几乎完全逆转。与托尔普-Tg/+对照Hdac4型-KO公司：托尔普-Tg/+小鼠在出生时表现出明显的生长板、骨骼、骨髓和正常长度的胫骨(). 这一结果清楚地表明，HDAC4是介导PTHrP信号传导所必需的。然而Hdac4型-KO公司：托尔普-Tg/+鼠标与Hdac4型-KO小鼠，如果HDAC4是PTHrP信号的唯一介导者，则可以预期。这个Hdac4型-KO公司：Pthrp公司-Tg/+小鼠表现出一个极长的肥厚层(，黑线），胫骨比Hdac4型-KO小鼠出生时，表明PTHrP必须通过其他介质诱导这些差异。
在E17.5中，我们看到了Hdac4型-KO鼠标和Hdac4型-KO公司：托尔普-Tg/+鼠标。中较长的增殖区Hdac4型-KO公司：托尔普-Tg/+鼠标(补充图3，黑线）表示由于PTHrP通过HDAC4以外的介质发挥更大作用而导致软骨细胞延迟肥大。在Hdac4型-KO公司：托尔普-Tg/+小鼠，肥大区域占据中心区域，骨形成从两个软骨膜开始(补充图3，黑色箭头）。长肥厚层Hdac4型-让开：托尔普-出生时的Tg/+小鼠可能反映了肥厚区域分离的早期延迟。
我们想排除对我们发现的另一种解释——如果删除Hdac4型降低2型胶原蛋白启动子的活性托尔普-Tg/+小鼠，随后PTHrP过度表达减少可能导致观察到的表型。为了排除这种可能性，我们检查了托尔普ISH的mRNA表达水平。这个托尔普-Tg/+小鼠过度表达人PTHrP（氨基酸1–141）蛋白(13). 人类PTHrP（氨基酸1-141）区域在氨基酸序列中与小鼠PTHrP有7个错配，但在DNA序列中有55个错配。因为我们的老鼠托尔普cRNA探针没有检测到人类托尔普mRNA在托尔普-Tg/+鼠标，我们生成了一个人托尔普cRNA探针。然后，我们确认HET或纯合子缺失Hdac4型没有降低人类托尔普增殖软骨细胞中mRNA的过度表达(). 因此，我们的结果与模型最为一致，其中Hdac4型删除会阻止PTHrP的动作。
PTHrP信号降低HDAC4磷酸化。
为了研究PTHrP信号传导对HDAC4影响的分子机制，我们在体内检测了PTHrP是否在三个14-3-3结合位点调节HDAC4蛋白的磷酸化状态。以前的一项体外研究使用鸡初级软骨细胞中过度表达的HDAC4蛋白证明，PTHrP或forskolin的急性治疗导致HDAC4蛋白质的磷酸化显著降低，尤其是在第一个14-3-3结合位点，而其他两个位点的磷酸化没有显著改变(21). 为了分析体内PTHrP的作用，我们在出生时手动显微解剖了胫骨近端生长板增殖的软骨细胞（见方法），然后我们通过Western blots检测HDAC4磷酸化的程度，使用检测特定位点磷酸化的抗体(21,27)
我们使用的第一个抗体识别HDAC4（Ser246）、HDAC5（Ser259）和HDAC7（Ser155）上的第一个磷酸化HDAC位点（指示的残基代表人类HDAC4蛋白中的残基）。小鼠HDAC4蛋白中的残基为HDAC4（Ser245）、HDAC5（Ser250）和HDAC7（Ser178））。这种抗体在出生时生长板增殖区软骨细胞的蛋白质印迹上检测到2条带(). 最近，制造商（细胞信号技术）将上层带的分配从磷酸化HDAC4（Ser246）改为磷酸化HDAC 4（Ser266）和磷酸化HDCA5（Ser259）的组合。在我们的实验室中，我们使用来自HDAC4和HDAC5消融骨细胞系的类似Western blots证实了这些新的分配（T.Sato和M.Wein，未发表的数据）。
体内通过PTHrP信号传导的HDAC4去磷酸化和核转位。(A类和C类)14-3-3结合位点的蛋白质印迹（见补充材料中完整的未经编辑的印迹）。出生时，从胫骨近端生长板中的微细切割增生软骨细胞区域进行全细胞裂解。使用了不同的动物组(A类,n个=3，生物三倍体；C类,n个=2，生物副本）。Tg、，托尔普-Tg/+；KO，托尔普-科威特。WT1或WT2和WT3分别来源于Tg凋落物或KO凋落物(A类). Tg1和Tg2是室友。KO幼崽来自不同的窝。(B类和D类)根据中的谱带计算相对谱带强度A类(n个=3）或C类(n个=2）以及补充图4A(n个= 2). HDAC4被归一化为β-肌动蛋白。磷酸化HDAC归一化为HDAC4。S245+S250，磷酸HDAC4-Ser245和磷酸HDAC5-Ser250之和；S465，磷酸化HDAC4-Ser465；S629，磷酸化HDAC4-Ser629*P（P）=0.03, **P（P）=0.002,***P（P）=1 × 10–5，****P=4 × 10–4个,*****P（P）=5 × 10–5由双尾学生的吨测试。(E类)共焦显微镜下的典型IHC图像（原始放大倍数，×620）。出生时胫骨近端生长板中的圆形软骨细胞：绿色（HDAC4）和蓝色（DAPI，核染色）。(F类)细胞核中的HDAC4总强度与整个细胞中HDAC4的平均强度之比（平均值±SEM，n个=5，生物复制）。的比率托尔普-Tg/+细胞为50.7%±2.4%托尔普-KO细胞为38.4%±1.3%。详细计算如所示补充图4B和补充表1.*P（P）<0.0001采用随机截距线性混合效应模型（SAS Institute）。A类P（P）小于0.05的值被认为是显著的(B类,D类，以及F类).
首先，我们比较了第一个14-3-3结合位点在托尔普-Tg/+鼠标Pthrp公司-KO鼠标及其WT控件。虽然我们不能单独分析磷酸化的HDAC4（Ser245），但我们观察到HDAC4和HDAC5（Ser250）在第一个14-3-3结合位点的磷酸化水平显著降低托尔普-Tg/+鼠标与WT控件中的级别进行比较(;P（P）=0.03），这一发现与我们之前的体外研究一致(21). 该位点的HDAC4磷酸化在托尔普-KO鼠标与WT控件中的鼠标进行比较(;P（P）= 0.03). HDAC4总蛋白水平在托尔普-Tg/+，托尔普-KO及其WT控制().
接下来，我们比较了所有14-3-3结合位点的HDAC4磷酸化水平托尔普-Tg/+鼠标和托尔普-出生时的KO小鼠。我们准备了4套托尔普-Tg/+小鼠（Tg4、Tg5、Tg6和Tg7）和Pthrp公司-用于统计分析的KO（KO4、KO5、KO6和KO7）小鼠（Tg4–Tg7和KO4–KO7：n个=4，生物复制）。我们观察到HDAC4磷酸化在第一个14-3-3-结合位点减少最多托尔普-Tg/+小鼠，同时我们还在第二和第三结合位点检测到较低水平的HDAC4磷酸化（HDAC4（Ser465）和HDAC4（Ser629）（分别为人类HDAC4蛋白中的Ser467和Ser632）(和补充图4A).
为了计算平均带强度，我们对这8个样本进行了2次独立的Western blot。当HDAC4总蛋白水平归一化为β-肌动蛋白水平时，其不受PTHrP状态的影响(). 通过将磷酸化HDAC4蛋白水平标准化为总HDAC4蛋白质水平，我们发现第一个14-3-3结合位点的变化最显著，但其他两个位点的变化也很显著(). 该结果表明，PTHrP信号导致体内三个14-3-3结合位点HDAC4磷酸化水平降低。
PTHrP信号转导促进HDAC4核转位。
当细胞内信号导致14-3-3结合位点磷酸化水平降低时，IIa类HDAC蛋白从14-3-3蛋白中释放出来，然后进入细胞核(21). 为了证明体内PTHrP信号转导诱导的HDAC4核移位，我们比较了细胞内HDAC4定位与托尔普-Tg/+鼠标和Pthrp公司-通过IHC研究KO小鼠，重点观察出生时胫骨近端生长板中圆形增殖软骨细胞。使用共焦显微镜，我们在托尔普-Tg/+鼠标。相反，HDAC4信号在细胞核中较低，但在细胞质中较高托尔普-KO鼠标().
为了定量评估HDAC4蛋白的细胞内定位，我们建立了一种方法，通过三色IHC（对于HDAC4、细胞核和全细胞）计算细胞核和整个细胞中的HDAC4信号强度（参见方法，补充图4B，以及补充表1). 我们分析了胫骨近端生长板中圆形增殖软骨细胞的共焦图像(补充表1; 分析的总细胞数：Tg=5468，KO=4692）使用5组托尔普-Tg/+小鼠（Tg8、Tg9、Tg10、Tg11和Tg12）和托尔普-出生时的KO小鼠（KO8、KO9、KO10、KO11和KO12）（Tg8–Tg12和KO8–KO12：n个=5，生物复制）。细胞核中的HDAC4信号总强度与整个细胞中的信号总强度的平均比率在托尔普-Tg/+鼠标(,托尔普-Tg/+：托尔普-KO=50.7%对38.4%；P（P）<0.0001），支持PTHrP增加HDAC4核易位的假设。
鉴定HDAC5作为软骨细胞中PTHrP信号的额外介质。
确定可能在Hdac4型-KO小鼠，我们关注其他IIa类HDAC蛋白，即HDAC5、HDAC7和HDAC9。我们假设IIa类HDAC蛋白之间常见的N端延伸可能受到PTHrP信号的调节，正如我们在HDAC4中观察到的那样(和补充图4A).
在使用手动显微解剖的新生WT小鼠胫骨近端生长板进行微阵列分析时（参见方法），Hdac5型mRNA和Hdac7型mRNA的表达水平与Hdac4型mRNA，但表达水平Hdac9型mRNA处于背景水平().
然后，我们分析了HDAC4蛋白与HDAC5或HDAC7的同源性。首先，我们关注14-3-3结合基序的保存(，顶部）。在HDAC4和HDAC5之间，我们发现第一个结合位点完全匹配，第二个或第三个结合位点有一个不匹配。在HDAC4和HDAC7之间，我们发现了另外两个不匹配：一个在第一或第三个结合位点上不匹配，另一个在第二个结合位点处不匹配(). 我们还分析了II类HDAC家族蛋白的整个N末端延伸域的同源性。我们发现HDAC4与HDAC5之间的同源性高于HDAC4和HDAC7（49.7%vs.26.9%），而C末端HDAC结构域的相似性（73.6%vs.67.6%）(，底部）。总之，我们首先研究了HDAC5，与HDAC7相比，HDAC5在蛋白质序列上与HDAC4具有更高的同源性。
HDAC5作为补充HDAC4行动的候选者。（顶部）HDAC4、HDAC5和HDAC7蛋白质之间14-3-3结合基序的同源性。红色字母“S”代表磷酸化丝氨酸。带下划线的字母表示不匹配的氨基酸。除了HDAC7-S479（人类RAQSSP有一个失配）外，这些基序在小鼠和人类之间是保守的。HDAC4的（中间）蛋白质结构域。（底部）HDAC4蛋白与N末端延伸域或C末端HDAC域中的HDAC5或HDAC7同源。蛋白质序列由多序列比对程序Clustal Omega分析。
我们首先分析了Hdac5型-出生时的KO小鼠在肋骨软骨细胞、胫骨生长板和整个胫骨中发现正常表型()，这一发现与之前的报告一致，表明Hdac5型-KO鼠标(16). 接下来，我们分析了两种基因都发生突变的小鼠Hdac4型和Hdac5型令人惊讶的是Hdac4型-KO公司：Hdac5型-HET（4KO:5HET）小鼠出生后立即死亡。该小鼠的肋骨表型与托尔普-KO小鼠，软骨细胞肥大显著加速(). 这一发现与HDAC5介导PTHrP信号以抑制软骨细胞肥大的概念一致Hdac4型-KO鼠标。这个Hdac4型和Hdac5型双KO小鼠出生时死亡，肋骨表型比托尔普-KO鼠标()因此，其表型与PTH/PTHrP受体-KO鼠标(28). 中的表型Hdac4型和Hdac5型双KO小鼠支持这样的假设，即这两种II类HDAC蛋白都是PTHrP信号传导所必需的，可以有效阻止软骨细胞肥大的启动。
HDAC5作为PTHrP信号传导的额外介质的鉴定。(A类)出生时前肋软骨的H&E染色（原始放大倍数，×100）。显示的老鼠出生于同一父母，除了托尔普-KO鼠标。黑色箭头表示肋骨软骨细胞异常肥大和矿化。DKO，双KO。至少2只独立的动物证实了表型的再现性。(B类)ISH用于第10a1列mRNA和第2a1列出生时前胸腔中的mRNA（原始放大倍数，×40）。黑色箭头表示肋软骨中具有代表性的表达区域。(C类)出生时整个胫骨的H&E染色（原始放大倍数，×20）。5000万美元，Hdac5型-KO；4KO，Hdac4型-KO；5HET、，Hdac5型-HET；4&5 DKO，Hdac4和5伏特加。图中显示了相同的老鼠A类–C类.比例尺（红线）：500μm。
肥大软骨细胞标记基因的ISH清楚地提供了分子数据，证明了Hdac5型删除Hdac4型-KO鼠标。新生儿Hdac4型-KO鼠标和WT鼠标不表达第10a1列前肋软骨mRNA表达。然而，HET删除了Hdac5型在中Hdac4型-KO鼠标指向第10a1列mRNA表达类似于托尔普-KO鼠标(,Hdac4型-KO公司：Hdac5型-HET和托尔普-KO，黑色箭头）。双KO鼠标显示更低第10a1列mRNA表达，但骨桥蛋白表达较高(OPN公司)信使核糖核酸(补充图5A，黑色箭头），如PTH/PTHrP受体-KO小鼠所示，表明进一步分化为晚期肥厚阶段，其中OPN公司mRNA表达。相反，第2a1列mRNA在增殖的软骨细胞中表达，在WT小鼠和Hdac4型-KO鼠标(，黑色箭头）。HET或纯合子缺失Hdac5型在中Hdac4型-KO小鼠导致第2a1列mRNA表达，正如托尔普-KO鼠标().
长骨表型Hdac4型-KO公司：Hdac5型-HET小鼠比托尔普-KO鼠标，但Hdac4型和Hdac5型双KO小鼠表现出类似于托尔普-出生时KO小鼠()和E18.5(补充图5B).
当HDAC4表达低时，HDAC5介导PTHrP信号。
我们进一步探讨了HDAC4和HDAC5在生长板PTHrP过度表达中的相关作用。我们首先删除了Hdac5型基因在托尔普-Tg/+鼠标。HET或纯合子缺失Hdac5型对托尔普-Tg/+表型()与此相反Hdac4型删除托尔普-Tg/+鼠标(). 接下来，我们删除了Hdac5型基因在Hdac4型-HET（高等教育技术）：托尔普-Tg/+鼠标。由于HDAC4表达有限，我们发现当Hdac4型-HET缺失与Hdac5型-HET删除，然后Hdac5型-KO删除(). 我们确认Hdac4型和/或Hdac5型删除量没有降低托尔普mRNA过度表达(补充图6A). 这些结果表明，当HDAC4的表达水平较低时，HDAC5介导PTHrP信号传导。
当HDAC4表达较低时，HDAC5介导PTHrP信号传导。(A类和B类)出生时整个胫骨的H&E染色（原始放大倍数，×20）。显示的老鼠是同窝老鼠(A类)或父母相同(B类). 4HET、，Hdac4型-HET公司。(C类)出生时胫骨近端生长板的H&E染色（原始放大倍数，×100）。第一张和第二张图片中的老鼠以及第三张和第四张图片中老鼠分别是同窝老鼠。黑线表示肥大软骨细胞层的长度。(D类)ISH用于第10a1列出生时胸腔前部的mRNA（原始放大倍数，×40）。右侧图像中的黑色箭头表示异常第10a1列前肋软骨mRNA表达。第10a1列在左边的图像中，前肋软骨中未见mRNA表达（黑色箭头）。请注意第10a1列左侧可见胸骨中的mRNA表达。每个基因型的2只独立动物证实了表型的再现性。比例尺（红线）：500μm。
此外，我们删除了Hdac5型基因在Hdac4型-KO公司：托尔普-Tg/+鼠标。PTHrP的Tg表达Hdac4型-KO公司：Hdac5型-HET小鼠对生长板的影响不大，与之相比Hdac4型-KO鼠标和Hdac4型-KO公司：Pthrp公司-Tg/+鼠标(). 这个Hdac4型和Hdac5型删除量没有降低Pthrp公司mRNA在该小鼠模型中的过度表达(补充图6B).
重要的是，我们看到了广泛的第10a1列大鼠肋骨软骨细胞中mRNA的表达Hdac4型-KO公司：Hdac5型-赫特：托尔普-尽管PTHrP过度表达，Tg/+小鼠(，右侧为黑色箭头），而没有第10a1列mRNA在小鼠肋骨中的表达Hdac4型-KO公司：托尔普-Tg/+鼠标(，左）。我们无法生成Hdac4型-KO公司：Hdac5型-KO公司：托尔普-Tg/+小鼠，在托尔普-Tg背景小鼠。综合起来，这些ISH数据提供了分子证据，证明HDAC5是PTHrP信号传导的重要介质，可以抑制软骨细胞肥大Hdac4型-KO鼠标。
当PTHrP/HDAC4动作较低时，Mef2/Runx2信号级联被激活。
之前的一项研究表明，使用ISH甲基安非他明类兴奋剂在软骨细胞和成骨细胞中使用扭转2-Cre导致了运行2生长板前增生区的mRNA表达(20). 这一结果表明，对于运行2表达，制作运行2表达Mef2C作用的读数和可能贡献者(29). 我们想知道Runx2是否是成骨细胞分化所必需的转录因子(30,31)和软骨细胞(32)在我们的小鼠模型中，有助于软骨细胞肥大。
我们使用Hdac4型-KO鼠标。之前的一份报告显示Hdac4型-KO小鼠，Hdac4型缺失导致高Mef2C活性，随后诱导肋骨软骨细胞肥大和矿化，而这通常不会发生(20). 在P8Hdac4型-KO小鼠表现出实质性软骨细胞肥大，其方式类似于托尔普-KO鼠标(和，黑色箭头）。HET删除运行2在中Hdac4型-KO小鼠在P8消除软骨细胞肥大(，中上部），这使得这只老鼠能够以正常的肋骨表型存活更长时间(，右上角）。HET删除运行2自身对肋骨表型没有影响(，底部）。这个实验，与以前的实验相结合(20)，表明当Runx2表达受限时，Mef2未能诱导软骨细胞肥大。
HDAC4/5通过PTHrP作用抑制Mef2/Runx2信号级联。(A类)P8和P21处前肋软骨的H&E染色（原始放大倍数，×100）。同龄的老鼠是室友。这个Hdac4型-KO小鼠在P10和P14之间死亡。黑色箭头表示肋骨软骨细胞异常肥大，这被HET缺失所抵消运行2（顶部图像）。比例尺（红线）：500μm。这个运行2-HET小鼠表现出正常的肋骨表型（底部图像）。(B类)软骨细胞肥大的发育调控模型。这个模型是根据这份手稿和以前的报告中的数据得出的(20,21). PTHrP作用通过降低14-3-3结合位点处HDAC4的磷酸化来增加HDAC4核转位。当HDAC4表达低时，HDAC5也介导PTHrP信号传导。在细胞核中，HDAC4和HDAC5通过HDAC4/5的Mef2结合位点阻断Mef2的转录活性。Mef2通过直接激活和激活Runx2表达来驱动软骨细胞肥大。Runx2作用于HDAC4/Mef2和HDAC5/Mef2的下游，以驱动软骨细胞肥大。
总结了根据我们的数据和以前的手稿得出的模型(20,21). PTHrP作用通过减少HDAC4在14-3-3结合位点的磷酸化来增加HDAC4核转位。当HDAC4表达低时，HDAC5也介导PTHrP信号传导。在细胞核中，HDAC4和HDAC5通过Mef2结合位点阻断Mef2的转录活性。Mef2通过直接作用和激活Runx2表达促进软骨细胞肥大。Runx2作用于HDAC4/Mef2和HDAC5/Mef2的下游，以驱动软骨细胞肥大。总之，我们揭示了调节软骨细胞肥大的主要信号通路。
讨论
在软骨内骨形成过程中，软骨细胞肥大是分化程序从软骨细胞分化转变为骨形成的关键转折点。软骨细胞肥大也是骨延长的重要组成部分。肥大的软骨细胞为血管侵袭和成骨细胞分化提供关键信号(1,4,5,6). 如围产期死亡率所示托尔普-KO小鼠(10)软骨细胞肥大必须得到适当调节，以维持骨骼的正常发育。PTHrP用于抑制体内软骨细胞肥大的分子机制尚未确定。
我们的合著者Elena Kozhemyakina和Andrew Lassar之前的工作建立了一个体外模型，即PTHrP快速导致培养细胞中HDAC4磷酸化水平降低，与HDAC4向细胞核的移动有关，HDAC4随后与Mef2C结合，并阻断Mef2C靶启动子的激活(21). 在这里，我们提供了体内遗传学证据，证明HDAC4是PTHrP作用所必需的，PTHrP作用导致体内HDAC4磷酸化不足，HDAC4的核积累增加，随后抑制胶原蛋白10a1，Mef2C和Runx2靶基因。因此，体内和体外数据一起强烈支持HDAC4在软骨细胞中介导PTHrP信号的假设。此外，体内数据显示HDAC4不是PTHrP作用的唯一介质。我们发现，尽管Hdac5型-KO小鼠出生时没有骨表型，当HDAC4减少或缺失时，需要HDAC5来调节PTHrP的作用(). 我们没有分析Hdac4型和Hdac7型双突变小鼠，以检查HDAC7是否也介导PTHrP信号。PTHrP信号降低HDAC7第一个14-3-3结合位点的磷酸化水平(，以及补充图4A)，表明PTHrP也降低HDAC7磷酸化。然而，仅HDAC7不能阻止Hdac公司4和Hdac5型出生时的双KO小鼠(和补充图5，A和B). 相反，HDAC5可以阻止Hdac4型-出生时的KO小鼠(). 因此，我们得出结论，HDAC4和HDAC5是软骨细胞中PTHrP信号传导的主要介质；我们也不能排除HDAC7的作用。
我们发现PTHrP信号降低HDAC4 14-3-3结合位点的磷酸化，特别是在残基Ser245处(，以及补充图4A)，增加HDAC4的核定位(). 一项利用培养的鸡初级软骨细胞进行的体外研究提供了证据，证明PTHrP信号能够激活蛋白磷酸酶2A（PP2A），这是一种以HDAC4-Ser245为靶点的磷酸酶(21). 我们试图利用新生儿的跖骨外植体来检测PP2A的作用托尔普-用冈田酸治疗的Tg/+小鼠，观察PP2A抑制剂在刺激软骨细胞肥大时是否能刺激软骨细胞第10a1列mRNA在体外研究中的表达(21). 不幸的是，冈田酸对跖骨外植体毒性太大，无法清楚地解释结果。盐诱导激酶3（Sik3）影响软骨细胞肥大；Sik3-KO小鼠软骨细胞肥大延迟(33). 一项分析HEK293T细胞过度表达蛋白的体外研究表明，Sik2和Sik3磷酸化HDAC4和HDAC5的14-3-3结合位点(34). 还需要进一步的研究来确定PTHrP是否通过调节激酶或磷酸酶或两者在体内调节HDAC4和HDAC5的磷酸化。
此外，我们研究了PTHrP/HDAC4/Mef2通路下游的介体。以前的一项研究表明，当使用扭转2-Cre，这一发现与软骨细胞中Runx2表达反映Mef2作用的想法一致(20). 为了测试Runx2是否导致Mef2下游软骨细胞肥大，我们利用Hdac4型-以KO小鼠为遗传模型进行此功能分析。在Hdac4型-KO小鼠，纯合子的Mef2活性较高Hdac4型缺失导致广泛的肋骨软骨细胞肥大，包括正常情况下不肥大的区域(，以及). 当Hdac4型-KO鼠也被制成HET运行2，软骨细胞肥大被完全阻断(). 这一结果表明，在这种情况下，需要Runx2表达来激活向肥大软骨细胞的分化。
软骨细胞肥大受核内Mef2C转录激活和HDAC4抑制之间的平衡调节(20). 使用体内动物模型，我们证明了该系统中的一个关键决定因素是PTHrP调节HDAC4的核转位。当PTHrP作用较低时，HDAC4较低的核分布允许Mef2增加运行2随后诱导软骨细胞肥大的mRNA表达。
这个托尔普-Tg/+小鼠是以短肢侏儒症为特征的软骨发育不良的动物模型(13). 在人类中，Jansen型干骺端软骨发育不良是一种罕见的短肢侏儒症，是由一种组成性活性突变PTH/PTHrP受体引起的(35). 在本研究中托尔普-Tg/+小鼠可以通过HET或纯合子缺失Hdac4型()或双HET删除Hdac4型和Hdac5型(). HDAC4和/或HDAC5可能是Jansen型干骺端软骨发育不良的潜在治疗靶点。此外，PTHrP表达杂合子人群的短趾畸形(22)，Gsα(36)，或HDAC4(23)表明这里分析的途径也控制着人类的生长板功能。
在本研究中，我们提供了体内遗传学证据，以揭示软骨细胞中PTHrP信号的下游介质。我们预计，我们对活体骨骼的遗传和分子分析提供了PTHrP信号的可能分子机制，可能有助于PTHrP在其他靶器官中的作用，例如牙齿、乳腺、皮肤和头发、血管、胎盘和胰腺(37).
方法
突变小鼠。
这个托尔普通用KO鼠标由我们小组生产(10). 生成其他突变小鼠并提供如下：Hdac4型通用KO鼠标(19),Hdac4型-被鞭打的老鼠(25)、和Hdac5型通用KO鼠标(16)来自E.Olson和R.Bassel-Duby（德克萨斯大学西南医学中心，美国德克萨斯州达拉斯）；第2列-发起人：托尔普-Tg鼠标(13)来自A.Broadus（美国康涅狄格州纽黑文耶鲁大学）；第2-Cre列鼠标(24)来自R.Behringer（德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心，美国德克萨斯州休斯顿）；Osx-Cre-GFP公司鼠标(26)来自A.McMahon（美国洛杉矶南加州大学凯克医学院）；和运行2通用KO鼠标(31)来自M.Owen（英国伦敦帝国癌症研究基金会）。每个基因型均通过PCR引物进行确认，如补充表2A.
将每只突变小鼠回交给C57BL/6野生型小鼠（Charles River，菌株代码027）至少10代。这些老鼠被安置在马萨诸塞州总医院（MGH）的比较医学中心，在正常的居住条件下，有规律的食物和水。
抗体。
HDAC4兔多克隆抗体（Abcam，ab12172）、Phospho-HDAC4（Ser246）HDAC5（Ser259）/HDAC7（Ser155）兔单克隆抗体（Cell Signaling，3443）、Phopho-HDAC4（Ser467）兔多克隆体抗体(27)（由T.P.Yao生成）、磷酸-HDAC4（Ser632）兔多克隆抗体（Santa Cruz，sc-101691）、β-肌动蛋白兔单克隆抗体（Cell Signaling，8457）、兔IgG-HRP山羊二级抗体（Santa-Cruz，sc-2004）、DIG-AP、Fab片段羊多克隆抗体，和Alexa Fluor 488山羊二级抗体（生命科技，A11008）。
组织学。
在本研究中，我们使用福尔马林固定石蜡切片进行组织学实验（H&E染色、ISH和IHC）。我们用3.7%甲醛（MilliporeSigma，252549）/PBS（pH 7.4）在4°C下固定后肢和肋骨2天。然后，我们用15%EDTA（pH 7.4）（MilliporeSigma，E9884）在4°C下对样品脱钙1天（E17.5、E18.5和P0）、1周（P8、P12）或2周（P21）。石蜡处理和包埋后，我们在Superfrost Plus显微镜载玻片上切下6-μm切片（Thermo Fisher，12-550-20）。在每次组织学实验之前，将载玻片在58°C下烘烤30分钟，用二甲苯脱蜡（5分钟，共3次），然后用乙醇再水化（在100%乙醇中2分钟，共2次，然后在95%乙醇中2 min）。
ISH公司。
根据制造商的方案，使用DIG RNA-标记混合物（罗氏，11277073910）和T7 RNA聚合酶（罗氏10881767001）或SP6 RNA聚合物（罗氏108 10274001）合成DIG标记的互补RNA（cRNA）探针。在DNA酶（Promega，M6101）处理和随后使用LiCl（MilliporeSigma，L9650）进行乙醇沉淀后，我们将cRNA颗粒重新悬浮在100μl无RNase水中。cRNA探针的靶区列于补充表2B.
第1天（预处理和杂交），我们修改了先前描述的方案(38). 在烘烤、脱蜡和再水化后，切片在室温下使用4%多聚甲醛（PFA，Thermo Fisher，416785000）固定10分钟，在室温下用蛋白酶K处理（Thermo Fisher，17916；PBS中3μg/ml，pH 7.4）固定10分钟，然后用4%PFA在室温下固定5分钟，在Milli-Q水中使用0.25%乙酸和0.1 M三乙醇胺（MilliporeSigma、A6404和T1377）在室温下乙酰化10分钟。每个步骤之后，进行2次PBS清洗，持续5分钟。最后一次PBS洗涤后，将载玻片浸入80%乙醇中3分钟，然后短暂风干。我们使用0.5μl DIG-标记的cRNA探针和300μl杂交缓冲液（50%甲酰胺[MilliporeSigma，F9037]，10 mM Tris[pH8.0]，200μg/ml酵母tRNA[MilliposeSigma（R8759]），1×Denhardt溶液[MilliopreSigma-，D2532]，10%硫酸右旋糖酐[MillipereSigma-D8906]，600 mM NaCl，0.25%SDS，1 mM EDTA[pH9.0]）。我们将玻片与玻璃盖玻片放在一个潮湿的玻片盒中（底部有50%的甲酰胺和5×柠檬酸盐钠[SSC]），在58°C下孵育过夜。
在第2天（清洗和抗体培养），我们遵循了之前描述的方案(39)，除了我们添加了一个阻塞步骤。依次用SSC（2×SSC在室温下洗涤30分钟，2×SSC在60°C下洗涤1小时，然后0.2×SSC在60°C下洗涤1小时）洗涤后，我们使用在100mM Tris（pH 7.5）中的5%热灭活绵羊血清（MilliporeSigma，S3772）和5%封闭试剂（Roche，11096176001）在室温下封闭载玻片1小时/150 mM NaCl缓冲液。然后，我们在室温下将载玻片与抗DIG-AP抗体（用封闭缓冲液1:2500稀释）孵育2小时。使用100 mM Tris（pH 7.5）/150 mM NaCl缓冲液进行两次洗涤15分钟后，然后使用100 mM-Tris（pH9.5）/100 mM NaCl/50 mM MgCl进行后续洗涤2缓冲10分钟，我们在室温下用BM-Purple（Roche，11442074001）培养侧面1-4天，直到观察到可见信号。在室温下用4%PFA在PBS（pH 7.4）中固定载玻片30分钟，然后用PBS清洗后，我们用Aqua-Mount载玻片安装介质（Thermo Fisher，13800）安装载玻片。
手工显微解剖。
我们修改了参考文献中所示的协议。40后肢植入O.C.T.复合物中（美国樱花Finetek，4583），置于干冰上，不固定。块体在–80°C下储存，直到Shandon Cryostat进行冷冻切片。我们在Superfrost Plus显微镜载玻片上贴上了4-6个冰冻切片（40-μm厚），并将载玻片保存在冰镇70%乙醇中。在Milli-Q水中清洗30秒后，我们用10%哈里斯苏木精（Thermo Fisher，245-677）将载玻片染色30秒。在Milli-Q水中清洗玻片30秒后，我们将玻片浸入3%甘油溶液中（Thermo Fisher，BP-229-1），以在手动显微解剖过程中保持切片湿润。我们将一片载玻片放在装满冰的培养皿上，在解剖显微镜下用28号针头解剖胫骨近端生长板。在Buffer RLT（Qiagen，RNeasy Mini Kit，74104）中采集切片进行微阵列分析，或在4×Laemmli SDS样品缓冲液（Boston Bioproducts，BP-110R）中采集标本进行Western blot。为了制备1个样本，我们从同一窝中解剖了18-20个胫骨进行微阵列分析，并从同一只小鼠中解剖了2个胫骨用于Western blot。
蛋白质印迹。
在冷冻和解冻4个循环（液氮、37°C水和涡流1分钟）并随后超声处理（间歇20秒，两次）后，用10%SDS-PAGE凝胶（Expedion、NXG01012或NXG001027）分离整个细胞裂解物。我们将凝胶转移到120 V的Hybond ECL硝化纤维素膜（Amersham，RPN303D）上1.5小时。在室温下用5%的BSA（Boston Bioproducts，P-753）在TBS-T（含TWEEN 20的Tris缓冲盐水，50 mM Tris[PH7.5]，150 mM NaCl，0.05%TWEEN 20[MilliporeSigma，P9416]）中封闭1小时后，我们用一级抗体在密封袋中培养膜（用封闭溶液稀释1:1000–3000）在4°C的振动筛上过夜。在TBS-T中清洗膜（10分钟，4次）后，我们在室温下用二级抗体（TBS-T稀释1:5000）培养膜1小时。在TBS-T中清洗（10分钟，4次）后，我们在室温下用ECL（增强化学发光）底物（Thermo Fisher，32109）培养膜1分钟。我们通过放射自显影胶片（Lab Scientific，AR-ALF-2025）检测信号。我们使用Image Studio Lite 5.0版（LI-COR生物技术）分析了波段强度。
共焦显微镜。
我们使用蔡司LSM 510共聚焦显微镜系统（Alexa Fluor 488使用488nm氩离子激光器，DAPI使用405nm二极管激光器，Whole Cell Stain使用633nm氦氖激光器）和×63油物镜，通过IHC观察荧光信号。我们通过使用一个小针孔（8μm）扫描截面来减少背景信号。我们使用更高的激光功率来补偿与小针孔相关的较低信号强度。
微阵列分析。
Affymetrix基因芯片分析使用手动显微切割从新生的黑瑞士WT小鼠（Taconic）胫骨近端生长板的3层获得的总RNA进行。使用RNeasy Mini Kit（Qiagen，74104）和QIAshredder（Qiangen，79654）以及柱上DNase I处理（Qiagen，79254）提取总RNA。第一链cDNA、第二链cDNA和生物素标记的cRNA由GeneChip One Cycle Target Labeling kit（Affymetrix，900493）合成。在cRNA片段化后，我们使用Affymetrix基因芯片操作系统将其杂交到基因芯片小鼠基因组430 2.0阵列上。使用Rosetta Resolver软件（Rosetta Biosoftware）对生物三重数据进行归一化和合并。微阵列分析的总数据集已保存在基因表达综合数据库中({“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE87605”，“term_id”：“87605“}}GSE87605型).
共焦图像的定量分析。
为了计算免疫组化图像中细胞核和整个细胞中的总HDAC4信号强度，我们使用图像分析软件Volocity（PerkinElmer）分析了3种颜色（HDAC4、DAPI和全细胞染色）的强度。我们从5组托尔普-KO小鼠和托尔普-出生时的Tg/+小鼠。对于每组动物，我们在相同的日期同时处理了IHC和共焦显微镜。我们从胫骨近端生长板圆形软骨细胞区域的不同区域拍摄了多张图像（每只小鼠6–17张图像）。每幅图像有80–120个细胞，这些细胞被共焦平面随机扫描。我们将HDAC4和DAPI双阳性区域中的HDAC4信号的总和指定为每个图像中核隔室中的HDAC 4信号。同样，我们将HDAC4和全细胞染色双阳性区域中的HDAC4信号的总和指定为整个细胞隔室中的HDAC 4信号。为了确定阳性区域的阈值信号强度，我们计算了细胞外区域的平均背景信号强度。为了计算双阳性区域的信号强度，我们使用Volocity的相交函数。我们通过分析同一动物的5张、10张和15张图像，获得了细胞核中HDAC4与整个细胞中的平均比率。因此，我们可以通过分析至少5张图像（包括400-500个细胞）来获得具有代表性的平均比率。
统计。
对于，我们为每个基因型准备了3只独立的动物(n个=3，生物三联）。我们使用9个不同的切片测量了每只小鼠增殖软骨细胞区域的平均长度。我们将每个基因型的测量值与其对应的WT基因型和双尾Student基因型进行了比较吨测试。A类P（P）小于0.05的值被认为是显著的。
对于，我们准备了3个独立的新生儿幼崽，包括每个基因型（WT，Hdac4型-HET、，托尔普-HET，以及Hdac4型和托尔普双HET）在室友中(n个=3，生物三联）。我们测量了增殖软骨细胞区域的长度（如图中的黑线所示)每个老鼠有9个不同的部分。使用随机截距线性混合效应模型（SAS Institute）对每只小鼠的切片进行了27次测量分析，这是一种考虑固定效应和混合效应的多次测量分析方法。A类P（P）小于0.05的值被认为是显著的。
对于，我们准备了3套托尔普-Tg/+小鼠、WT小鼠和托尔普-出生时的KO小鼠(n个=3，生物三联）。我们在同一凝胶上对这9个样本进行了Western blot()计算波段强度。HDAC4标准化为β-肌动蛋白，磷酸化的HDAC4蛋白标准化为总HDAC4。我们通过双尾Student’s吨测试。A类P（P）小于0.05的值被认为是显著的。
对于，我们准备了4套托尔普-Tg/+小鼠和托尔普-出生时的KO小鼠(n个=4，生物复制）。我们对4个样本进行了2次独立的Western blot(和补充图4A)计算波段强度。我们还使用β-肌动蛋白抗体在同一凝胶上对8个样品进行了蛋白质印迹，以调整两种不同凝胶的蛋白质负载量。HDAC4标准化为β-肌动蛋白，磷酸化的HDAC4蛋白标准化为总HDAC4。每个P（P）使用双尾学生的吨使用Bonferroni校正进行测试。A类P（P）小于0.05的值被认为是显著的。
对于，我们准备了5套Pthrp公司-Tg/+小鼠和托尔普-出生时的KO小鼠(n个=5，生物复制）。我们为每只动物拍摄了来自不同区域的多幅共焦图像。我们计算了每个图像的总核HDAC4与总细胞HDAC4的平均比率(补充图4B和补充表1). 通过上述混合效应模型分析每只动物的个体数据.A型P（P）小于0.05的值被认为是显著的。
研究批准。
所有动物实验均由MGH动物护理和使用委员会（IACUC）批准。我们根据IACUC法规和指南执行了所有鼠标操作程序。
