分子医学代表。2017年10月；16(4): 5363–5369.
过度表达的microRNA-506和microRNA124缓解H2O（运行）2-靶向krüppel样因子4/5诱导人心肌细胞功能障碍
,1 ,2 ,三和1
张秀洲
1中国山东省滨州市滨州人民医院心内科256610
刘福燕
2中国山东省滨州市滨州人民医院麻醉科，邮编：256610
王庆庆
三中国山东省滨州市滨州人民医院药剂科，邮编：256610
耿玉雪
1中国山东省滨州市滨州人民医院心内科256610
1中国山东省滨州市滨州人民医院心内科256610
2中国山东省滨州市滨州人民医院麻醉科，邮编：256610
三中国山东省滨州市滨州人民医院药剂科，邮编：256610
2016年5月20日收到；2017年6月6日接受。
摘要
KLüppel-like因子（KLFs）调节多种细胞功能并调节病理过程。在本研究中，研究了微小RNA（miRs）在H2O（运行）2-诱导人心肌细胞（HCM）损伤。以H为单位2O（运行）2-流式细胞术检测培养的HCM细胞、活性氧和凋亡细胞。转染miR-506/-124模拟物和抑制剂以诱导miR-5060/-124功能的获得或丧失。用MTT法分析细胞增殖。目标基因通过生物信息学算法进行预测，并通过双荧光素酶报告分析进行确认。分别通过逆转录-聚合酶链反应分析和western blotting检测mRNA和蛋白质表达水平。结果表明，H2O（运行）2诱导HCM细胞显著凋亡并增加活性氧（ROS）浓度。H（H）2O（运行）2HCM中KLF4和KLF5的表达水平显著上调，miR-506和miR-124的表达水平下调。此外，生物信息学分析显示，HCM中KLF4和KLF5的3′非翻译区内存在潜在的miR-506和miR-124结合位点。miR-506和miR-124的过度表达抑制了H2O（运行）2-诱导HCMs中KLF4和KLF5的上调。miR-506和miR-214的过度表达逆转了H2O（运行）2-诱导HCM细胞凋亡和ROS增加。总之，miR-506和miR-214的过度表达被证实对H2O（运行）2-通过抑制KLF4和KLF5的表达诱导HCM损伤。
关键词：microRNA-506、microRNA124、krüppel-like因子、人心肌细胞
介绍
氧化应激刺激在一些心血管疾病的发病机制中至关重要，包括急性心肌梗死（AMI）、心肌细胞凋亡和心力衰竭(1,2). 氧化应激刺激诱导的活性氧（ROS）生成可增加血管通透性并加速心肌细胞损伤(三). 尽管在理解AMI的机制以制定有效的治疗策略方面已经取得了进展，但仍有待全面阐明。此前，已有报道称，microRNAs（miRs）在几种心血管疾病中被解除管制，并导致AMI(4). 越来越多的证据表明，循环miR作为稳定的AMI血源性生物标志物是有用的，包括miR-208、miR-499、miR-19a、miR-21和miR-1(5–7).体外miR-874的表达在H2O（运行）2心肌细胞的治疗，以及miR-874功能靶点的丧失和上调胱天蛋白酶-8拮抗坏死(8). 此外，miR-145调节ROS诱导的Ca2+心肌细胞的超负荷和细胞损伤反应(9). 然而，miR-506和miR-124在H2O（运行）2-诱导的人心肌细胞（HCM）损伤尚待阐明。
KLüppel-like因子（KLFs）由高度保守的指间空间序列区分，在哺乳动物中已鉴定出17个KLFs(10,11). KLFs调节多种细胞功能，包括生长、凋亡、血管生成和增殖(12). 例如，心肌细胞中KLF15的过度表达可以通过抑制细胞大小、蛋白质合成和肥大基因表达来抑制心肌细胞肥大(13). KLF5参与人肺动脉高压肺动脉平滑肌增殖和抗凋亡(14)和KLF4已被证明抑制平滑肌细胞增殖(15). 值得注意的是，KLF可以通过氧化应激刺激进行调节，包括内皮素-1（ET-1）、H2O（运行）2和炎症细胞因子(16). 具体而言，在ET-1和H的存在下，KLF4和KLF5显著上调2O（运行）2增加KLF2、KLF4和KLF6的表达水平(16). miRs的翻译后机制表明，miR-32通过靶向KLF4的3′-非翻译区（3′-UTR）促进胃癌的发生(17). 此外，口腔鳞癌中KLF5受miR-375调控(18). 然而，miR-506和miR-124通过调节KLF4/5在HCM中发挥作用的分子机制尚待完全阐明。
虽然miR-506对肝癌细胞上皮-间质转化的抑制作用以KLF4为靶点，但miR-505对H2O（运行）2-诱导的HCM功能障碍尚待完全阐明。本研究探讨了在HCM中，KLF4/5的表达是否受miR-506和miR-124的调节，以及KLF4/5的促凋亡作用是否受miR506和miR-124影响。
材料和方法
细胞培养
滨州市人民医院伦理委员会批准了本研究的实验方案。HCM和AC16细胞系购自美国型培养物收藏中心（美国马里兰州贝塞斯达），并在滨州人民医院医学实验中心（中国滨州）进行培养。HCM在Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）中培养，DMEM含有10%的胎牛血清（均来自Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA），10%的L-谷氨酰胺，0.5%的青霉素/链霉素，10%的非必需氨基酸和10%的丙酮酸，在5%的CO中培养2大气温度为37°C。
使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）分析检测细胞活力
根据制造商的协议，使用MTT细胞增殖/活性测定试剂盒（R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN，USA）监测HCM的增殖。
乳酸脱氢酶（LDH）活性
HCMs被电镀（1×105细胞/孔），并在96个培养皿中处理，用H培养2O（运行）2（0、50、100、200和400µM）。24小时后，进行离心（12000×g，4°C下15分钟）以获得上清液，并测量LDH水平。根据制造商的协议（目录号ab102526；英国剑桥Abcam）记录测量值。用足细胞裂解物的蛋白质浓度对数据进行标准化。
ROS的测量
通过二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）的细胞内氧化，使用荧光分析法评估HCM中ROS的生成。电池（4×105)在6孔板中孵育24 h，然后在37°C下DCFH-DA（50µg/ml）孵育30 min，收获细胞并用PBS洗涤两次，最后添加到1 ml PBS中。使用流式细胞仪检测和分析细胞（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA）。荧光产物2′，7′-二氯荧光素（DCF）在530nm的发射波长和485nm的激发波长下检测，并使用流式细胞仪分析软件BD-CellQuest（5.1版；BD-Biosciences）对结果进行分析。
细胞凋亡测定
使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸镍标记（TUNEL）方法对凋亡细胞进行定量评估，该方法使用BD ApoAlert™DNA片段分析试剂盒（BD Biosciences）检测凋亡过程中的DNA链断裂。根据制造商的协议记录测量结果。立即使用FACScan系统和CellQuest程序（5.1版；BD Biosciences）对细胞进行分析。
miRs表达式分析
HCM（1×105细胞/孔）与H孵育2O（运行）2（0、50、100和200µM）。用TRIzol（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）提取总RNA。使用miRNA分离试剂盒（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）从总RNA中分离出miRs。用1%甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳。使用miRCURY™阵列功率标记套件（Exiqon，Inc.，Woburn，MA，USA）用Hy3或Hy5荧光标记miR，以获得可能与芯片杂交的荧光探针。在标准条件下，使用MAUI杂交系统将标记探针与miRCURY™芯片杂交。用安捷伦芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并使用安捷伦特征提取软件（版本12）进行分析。根据折叠变化≥2、P<0.05和FDR<0.05筛选差异表达的miRs。最后，通过分层聚类分析显示差异表达的miR，并使用MeV软件（版本4.2.6）绘制输出。
荧光素酶报告基因活性测定
通过聚合酶链反应（PCR）扩增，获得含有miR-506和miR-124预测靶位点的KLF4和KLF5基因的3′-UTR。将该片段插入pMIR-REPORT荧光素酶microRNA表达报告载体（Ambion；Thermo Fisher Scientific，Inc.）的多个克隆位点。用含有KLF4和KLF5 3′-UTR的0.1微克荧光素酶报告子以及使用Lipofectamine 2000（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）的miR-506和miR-124模拟物共同转染细胞。转染48小时后收集细胞裂解物，并根据制造商的方案检查荧光素酶活性。
miRs的模拟物和抑制剂
使用高效液相色谱法（GenePharma，中国上海）化学合成并纯化FAM修饰的2′-OMe寡核苷酸。2′-OMe-miR-506和miR-124模拟物由RNA双工体组成，其序列分别为：5′-UAAGGCACCCUCUGUAGA-3′和5′-UAAGGACGGAUGAUCC-3′。2′-OMe-miR-506和miR-124抑制剂的序列分别为：5′-UCUCAGAGAGGGUGCCUUA-3′和5′-GGCAUCACCGUGCCuUA-3′。miR-506和miR-124的2′-Ome-scraft寡核苷酸分别为：5′-UAGUGCGGCACACAGGGGGGA-3′和5′-GCGAGGGCCAUGG-3′。使用最终浓度为100 nM的Lipofectamine 2000（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）转染细胞。
逆转录（RT）-PCR分析
根据制造商的方案（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.），使用TRIzol进行RNA提取。cDNA的合成是通过使用moloney鼠白血病病毒逆转录酶（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）和寡核苷酸dT与4µg总RNA的RT反应进行的(15)引物（发酵剂；赛默飞世尔科技公司）符合制造商协议。使用mirVana RT-qPCR miRNA检测试剂盒（Ambion；Thermo Fisher Scientific，Inc.）结合SYBR-Green实时PCR定量miR-506和miR-124的水平。PCR反应混合物包含12.5µl SYBR-Green SuperMix（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市Bio-Rad Laboratories，Inc.）、1µl cDNA、300 nM每个引物和最终体积为25µl的DEPC H2O。循环反应为95°C 10 min，然后是40个95°C循环15 s，58°C循环30 s，72°C循环30s。在热循环反应后，确定量化循环（Cq），并根据Cq值计算miR-506和miR-124的相对水平(19)并归一化到每个样本中的U6的水平。用以下引物进行PCR分析：KLF4（175bp）正向，5′-TCAAGAGTCATGCCACCGG-3′和反向，5′-CTCGCTGTGAGTTCGCA-3′；KLF5（212 bp）正向，5′-AGCTCACCTTGAGGACTCATA-3′和反向，5′-GTGGCAGTGCTCAGTTCT-3′；GAPDH（83 bp）正向，5′-GCACGTCAGAGAAC-3′和反向，5′-TGGTGAAGAGAGAGGA-3′。
蛋白质印迹分析
在NP-40缓冲液中提取细胞，然后煮沸5-10分钟并离心（12000×g，4°C下15分钟），以获得上清液。蛋白质浓度是使用双茚二酸试剂盒（目录号BCA1-1KT；Sigma-Aldrich；德国达姆施塔特默克公司KGaA）测定的。含有60µg蛋白质的样品在10%SDS-PAGE凝胶上分离，转移到硝化纤维素膜上（Bio-Read Laboratories，Inc.）。在TBS中用5%（w/v）非脂肪干乳和0.1%（w/v）吐温-20（TBST）饱和后，在37°C下用以下一级抗体培养膜1.5小时：圣克鲁斯生物技术公司（美国德克萨斯州达拉斯）的Caspase-3（目录号sc-271028；稀释度：1:1000）和Caspase-9（目录号sc-17784；稀释度1:500）；来自Abcam的KLF4（目录号ab75486；稀释度：1:1000）和KLF5（目录号ab191086；稀释率：1:1000。在用TBST进行三次洗涤后，将膜与适当的辣根过氧化物酶结合抗体（目录号sc-516102；稀释度：1:10000；Santa Cruz Biotechnology）在37°C下孵育1 h，并使用化学发光法（Thermo Fisher Scientific，Inc.）进行可视化。
统计分析
实验数据报告为各组的平均值±标准偏差。所有统计分析均使用PRISM 5.0版（GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA，USA）进行。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
H2O2诱导HCM细胞毒性、凋亡和活性氧
本研究首先考察了H的作用2O（运行）2HCM生存能力。HCM暴露于H2O（运行）2在不同浓度下培养24小时，结果表明，与h2O（运行）2导致HCM的存活率显著下降，且呈剂量依赖性(). HCM培养24小时，并进行TUNEL分析以检测细胞凋亡。H（H）2O（运行）2孵育导致HCM细胞凋亡显著增加，且呈剂量依赖性(). 在暴露于H的HCM中还观察到细胞外LDH活性的浓度依赖性增加2O（运行）2(). 确定ROS在H中的作用2O（运行）2-用流式细胞术和DCFH-DA测定HCM诱导的ROS浓度2O（运行）2与对照组相比，浓度≥100µM的培养增加了HCM中的ROS浓度().
H（H）2O（运行）2-HCM中诱导的细胞毒性、凋亡和活性氧。（A） HCMs与H一起孵育2O（运行）2用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵法检测细胞活力。（B） HCM与H孵育2O（运行）224h，流式细胞仪检测TUNEL染色。（C） 在HCM暴露于H后测量LDH水平2O（运行）224小时（D）根据DCF（DCF-DA的氧化衍生物）的荧光强度变化，在用h处理12小时后，测量细胞内ROS的生成2O（运行）2值表示为平均值±标准偏差（每组n=3）*与对照组相比，P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。HCM，人心肌细胞；TUNEL，三磷酸镍标记；乳酸脱氢酶；活性氧；DCF-DA，二氯二氢荧光素二乙酸酯。
H2O2调节HCM中KLF4和KLF5的表达
本研究使用RT-qPCR分析检测了200µM H的影响2O（运行）2KLF4和KLF5的mRNA表达。KLF4的mRNA表达在所有时间点均上调，在6小时时表达最大(). KLF5在12和24小时也上调，以应对h2O（运行）2尽管与KLF4相比反应延迟().
H（H）2O（运行）2调节HCM中KLF4和KLF5的表达。KLF4和KLF5的mRNA表达水平受H调节2O（运行）2（200µM）。采用逆转录定量聚合酶链反应分析法检测不同时间点（A）KLF4和（B）KLF5的mRNA表达。数值表示为平均值±标准偏差（每组n=3）*与对照组相比，P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。KLF，类krüppel因子。
在H2O2孵育HCM中miR-506和miR-124下调
检测不同表达的miR对H的反应2O（运行）2在HCM中，使用从暴露于不同浓度H的HCM中提取的总RNA生成的小RNA库进行微阵列分析2O（运行）2结果表明，在含有不同浓度h的HCM中，miR-506和miR-124显著下调2O（运行）2，与对照组相比(). 因此，miR-506和miR-124在HCM中的功能作用是在H2O（运行）2进一步研究miR-506和miR-124在H2O（运行）2-孵育HCM后，将miR-506和miR-124的模拟物和抑制剂转染到HCM中。研究发现，miR-506和miR-124模拟物足以分别增加miR-505和miR-127的表达水平，而miR-508和miR-126抑制剂则具有相反的作用。这些结果表明miR-506和miR-124的模拟物和抑制剂在HCM中有作用().
miR-506和miR-124在H中下调2O（运行）2-孵育的HCMs。（A） 用H治疗的HCM中差异表达miR的无监督分层聚类2O（运行）2通过microRNA微阵列分析测定24小时。使用MeV软件（4.2.6版）绘制输出。逆转录定量聚合酶链反应分析测定了转染（B）miR-506和（C）miR-124模拟物和抑制剂的HCM中miR-506,miR-124。数值表示为平均值±标准偏差（每组n=3）*与对照组相比，P<0.05。HCM，人心肌细胞；miR，microRNA；控制；NC，阴性对照。
miR-506和miR-124靶向HCM中的KLF4/5
生物信息学分析显示，KLF4和KLF5 RNA含有miR-506和miR-124的一个保守靶位点(). 为了确认这种可能性，KLF4或KLF5的野生型序列（KLF4-wild和KLF5-wild）或其突变序列（KLF4-Mut或KLF5-Mut），如，亚克隆到pMIR荧光素酶报告子中，然后分别与miR-506和miR-124的模拟物或其miR-NC共同转染到HCM中。转染后24小时进行荧光素酶分析。如所示与NC组相比，转染miR-506或miR-124的KLF4-wild和KLF5-wild HCM的荧光素酶活性降低。相比之下，将miR-506或miR-124转染到KLF4-Mut或KLF5-Mut HCM后，与NC组相比，荧光素酶活性没有显著差异。
miR-506和miR-124针对HCM中的KLF4/5。（A） 人miR-506在KLF4-wild和KLF5-wild 3′-UTR上的推测结合位点。（B） 人miR-124在KLF4-wild和KLF5-wild 3′-UTR上的推测结合位点。在双荧光素酶报告基因测定中，用插入有（C）KLF4野生和KLF5野生3′-UTR的萤火虫荧光素酶报告基因或插入有（D）KLF4-Mut和KLF5-Mut 3′-UTR的报告基因转染人心肌。在转染后24小时，评估相对荧光素酶活性。数值表示为平均值±标准偏差（每组n=3）*与对照组相比，P<0.05。KLF，类krüppel因子；野生型；Mut，突变体；3′-UTR，3′-非翻译区；miR，microRNA；NC，阴性对照。
miR-506和miR-124的过度表达抑制H2O2孵育HCM中的细胞凋亡和ROS
进一步采用RT-PCR分析观察miR-506和miR-124对KLF4和KLF5 mRNA水平的影响。如所示miR-506和miR-124模拟物的转染并未显著改变HCM中KLF4或KLF5的mRNA表达。使用蛋白质印迹分析验证了miR-506和miR-124调节HCMs中KLF4和KLF5蛋白表达的能力，结果表明miR-506和miR-124的过表达抑制了HCMs中KLF4和KLF5蛋白的表达2O（运行）2-HCM中KLF4和KLF5的诱导上调(). 用western blot分析检测凋亡相关标记物的蛋白表达。结果表明，caspase-3和caspase-9是与细胞凋亡密切相关的关键caspase途径蛋白，在miR-506或miR-124过表达的细胞中与H2O（运行）2与接触H的人相比2O（运行）2仅限(). 研究还发现，miR-506或miR-124的过度表达逆转了H2O（运行）2-分别导致HCM中ROS浓度增加().
miR-506和miR-124的过度表达抑制H细胞凋亡和ROS2O（运行）2-孵化HCM。过度表达（A）miR-506和（B）miR-124对KLF4或KLF5的mRNA表达水平没有影响。在用miR-506和miR-124转染后24小时，使用蛋白质印迹分析测量（C）KLF4和KLF5以及（D）胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-9的蛋白质表达水平。当（E）miR-506和（F）miR-124过度表达时，根据DCF在h存在下12 h的荧光强度变化来测量细胞内ROS的产生2O（运行）2DCF-DA的氧化衍生物。数值表示为平均值±标准偏差（每组n=3）*与对照组相比，P<0.05。miR，microRNA；KLF，类krüppel因子；活性氧；DCF-DA，二氯二氢荧光素二乙酸酯。
讨论
本研究结果表明，H2O（运行）2孵育导致HCM中KLF4和KLF5 mRNA水平显著增加，miR-506和miR-214水平降低。miR-506和miR-214的翻译后机制调节H中KLF4和KLF5的蛋白表达2O（运行）2-诱导HCM损伤。此外，miR-506和miR-214的过度表达逆转了H2O（运行）2-诱导HCM细胞凋亡和ROS水平。因此，我们得出结论，miR-506和miR-214的过度表达对H具有保护作用2O（运行）2-通过抑制KLF4和KLF5的表达诱导HCM损伤。
之前的研究表明H2O（运行）2作为活性氧的有效生成物，诱导新生大鼠心肌细胞凋亡(20). 与本报告一致，本研究发现H2O（运行）2孵育导致HCM中细胞存活率显著降低，细胞凋亡和ROS生成增加。发现miRs的翻译后机制参与H2O（运行）2-诱导HCM功能障碍。越来越多的证据表明，miRs在心肌缺血中至关重要，例如，miR-19b在小鼠心肌缺血再灌注的梗死区下调(1)miR-320的下调抑制心肌细胞凋亡，保护心肌缺血和再灌注损伤(21)和miR-93抑制缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡(22). 在新生小鼠的心肌细胞中，H2O（运行）2上调miR-137的表达并诱导细胞凋亡，而miR-137-功能丧失可防止细胞凋亡(23). 在本研究中，microRNA微阵列分析表明2O（运行）2miR-506和miR-124的表达显著下调，而miR-505或miR-124-的过度表达逆转了H2O（运行）2-诱导HCM细胞凋亡并增加ROS水平。
本研究还研究了HCM中miR-506和miR-124的潜在分子机制。作为AMI的副产品，H2O（运行）2可诱导心肌细胞氧化应激相关凋亡(三,24). 在心肌细胞中，至少有11个KLF被表达，它们对各种基因启动子中的精确序列具有不同的亲和力(16). 细胞周期蛋白D1被确定为KLF13的直接转录靶点，这可能解释了在KLF13水平下调的胚胎中观察到的增殖缺陷(25). 新生大鼠心室肌细胞KLF4过度表达抑制心肌细胞肥大的三个基本特征(26). KLF5参与人肺动脉高压肺动脉平滑肌增殖和抗凋亡(14). 这些发现表明KLF家族在心肌细胞中具有发育作用。然而，miR-506和miR-124是否调节H2O（运行）2-诱导的心肌细胞损伤尚未报道。在肝细胞癌（HCC）细胞中，KLF4诱导miR-506的表达，抑制EMT增强的HCC生长和侵袭，而miR-505反义的过度表达消除了KLF4对HCC细胞生长和侵袭的抑制作用(27). 本研究发现，KLF4和KLF5 3′-UTR含有一个miR-506和miR-124的保守靶点，而miR-505和miR-127的过度表达抑制了H2O（运行）2-诱导HCM中KLF4和KLF5的上调。
总之，本研究证明了miR-506/-124靶点对KLF4和KLF5信号转导抑制H2O（运行）2-诱导HCM细胞凋亡和ROS水平。尽管本研究仅限于临床实验，但获得的数据表明miR-506和miR-124可被视为诊断和评估AMI发病和发展的潜在生物标志物。
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