方法详细信息
胰岛隔离和FACS分拣
胰腺mIns1-H2B-樱桃将P1、P7和P14的报告小鼠完全解剖，不进行灌注，并用1mg/ml IV型胶原酶（Sigma）消化。P21和P28胰脏经总胆管灌注125μg/ml利伯拉TL（罗氏）。使用Histopaque（Sigma）通过密度梯度离心法纯化胰岛，用Accumax（Life Technologies）分离胰岛，并用FACS在FACSAria II（BD Biosciences）上进行分类。在排除死亡或受损的β细胞和双倍体后，对表达mCherry的细胞进行了分类（在P1、P7、P14、P21和P28分别捕获了49.3%、40.5%、39.5%、41.4%和40%的预选通细胞）。
单细胞和批量RNA-seq文库制备
根据Fluidigm方案（PN 100-5950），使用FluidigmC1系统在中型（10-17μm细胞直径）微流控RNAseq芯片（Fluidigm）上捕获单个分选的β细胞。对于每个C1实验，使用与芯片上使用相同的试剂混合物，在平行PCR管中处理两个散装RNA对照物（约250个细胞/样品）和一个非细胞阴性对照物。使用Nextera XT DNA样品制备试剂盒（Illumina）制备多重文库，并使用50-bp单端测序法对HiSeq 2500（Illumina）的10条通道进行测序。
单细胞和批量文库的RNA-seq数据处理
单基因50-bp读取被STAR映射到UCSC小鼠转录组（mm9），允许多达10个不匹配（这是STAR的默认值）。仅保留与一个基因组位置唯一对齐的读取，以供后续分析。Cufflink仅使用精确匹配的读取数来估计所有基因的每千基转录物/百万片段映射（RPKM）表达水平。包含少于100万个读取或超过15%映射到线粒体读取的片段的库被排除在外。中提供了具有对齐读取数和分数的完整值的单细胞样本表S1使用使用Python和R编程语言开发的自定义脚本，对批量和单细胞RNA-Seq数据集的RPKM值进行下游分析。数据预处理、细胞排序和基因集分析采用Orange和Bioconductor的几个软件库。首先，对批量数据集和单单元数据集都应用了适度的日志转换。具体来说，函数日志(d日ij公司+1）应用于表达值，d日ij公司表示第j个样本中第i个基因的RPKM估计值。
为了消除不必要的变异，用SVA-seq对单细胞数据进行标准化(Leek，2014年)使用一组在批量数据中变异较小的“阴性对照”基因。简言之，通过增加高表达水平（平均对数转换RPKM>5）的中位数绝对偏差（MAD）值排名的表达基因的前5个百分位首先从大量数据中选择为阴性对照。进一步筛选单细胞数据集中高表达水平的基因列表（至少2个细胞中的对数转化RPKM>5）。用作阴性对照的基因，包括已知的持家基因，列在表S2B.
生物模型被定义为基因表达的全球平均变化，没有向SVA-seq提供关于每个细胞阶段的明确信息。通过选择根据MAD排序的前四分位最大变异基因（n=4313）来过滤不需要的变异校正数据，MAD的表达被考虑用于细胞排序模型的推断。
饱和度分析
为了确定所需的测序深度，我们从体细胞和单个单细胞库中对原始数据进行了子采样。为了生成单细胞集合数据集，对所有单细胞RNA-seq文库的原始读取数据进行生物信息学合并，以模拟大规模RNA-seq。根据这三个数据集，通过计算检测到的基因数量（RPKM>0）来生成饱和图，因为采样的读取数量增加了。
单元格排序
为了推断单个细胞的有序轨迹，我们采用了一种基于1D-PCA的无监督算法，该算法最初设计用于构建分化尺度，表示大量样本的转录组进展，如前所述(Mulas等人，2012年)并在Orange软件中实现。简单地说，我们将主成分分析应用于预处理数据矩阵D=（Dj个,我)带有d日j个,我表示的表达式值第i个在第j天细胞。一个实数第页(d日j个)分配给每个单元格j个通过将其表达轮廓投影到第一个主成分：
w个我是协方差矩阵第一特征向量的元素D类T型D类和我范围从1到所选基因总数（m=4313）。预测第页(d日j个),j个范围从1到所考虑的单元格总数（n=387），设置为伪时间坐标并用于确定单元格的顺序，以便：
排序评估和与其他方法的比较
除非另有规定，否则使用相同的一组选定基因和所有参数设置为默认值，将一维伪时间轨迹与应用其他方法获得的顺序进行比较。为了评估无监督算法（不使用样本采集时间点推断排序）的准确性，使用伪时序排序分数（POS）计算根据真实数据采集时间按预期排序的单元格数量：
哪里T型我和T型j个是来自时间点的单元格集我和j个,p（x）和p（年）表示分配给样本的伪时间坐标x个和年、和δ等于0或到(j个——我)/D类，如果T型我=T型j个或者如果T型我≠T型j个,分别是。计算常数D以重新缩放范围[-1，1]内的POS值。
为了将一维伪时间坐标与使用样本采集时间推断伪时间坐标的监督方法推断的顺序进行比较，我们依赖于连续电镀单元的“粗糙度”(Reid和Wernisch，2016年). 粗糙度得分R（右）计算为连续细胞之间基因表达值的距离之和，从轨迹的开始到结束，按照它们的伪时间坐标排序。一对连续单元格之间的距离j个和j+1（j+1）被定义为基因表达测量值的差异d日j个+1和d日j个:
d日j个,我是的表达式值第i个选择的基因第j天单元格，如上所述。
排序评估和与其他方法的比较
将一维伪时间轨迹与四种附加方法进行了比较，包括无监督算法，即TSCAN(季和季，2016)，单色(Trapnell等人，2014年)和Embeddr(Campbell等人，2015年)，以及一种基于高斯过程的监督方法，该方法最近被添加到“DeLorean”R包中，以下简称为DeLorean(Reid和Wernisch，2016年)。
用于评估无监督算法准确性的伪时间排序分数（POS）计算结果如下所示。
使用bootstrap程序估计基于主成分分析排序的POS得分的置信区间，通过保持不同阶段细胞的相同比例，对随机细胞集进行替换采样。这些样本被用作训练集，即确定权重w个我，用于投影剩余样本，视为测试集。引导样本包含原始样本中约63%的细胞，而测试集平均包含37%的细胞。该过程被迭代1000次，获得测试集上POS统计的估计值。90%的置信区间如下所示，表明了1D-PCA作为数据集上的伪时间排序方法的稳健性能。
对我们的单细胞数据的无监督方法的评估使用TSCAN、Monocle和Embeddr获得的POS分数。基于主成分分析及其相应的90%置信区间[0.6015-0.7028]，在1D伪时标度上获得的POS得分。
| 销售时点情报系统 |
|---|
| TSCAN公司 | 0.17 |
| 单分子膜 | 0.41 |
| 嵌入式 | 0.59 |
| 一维伪时标 | 0.65 |
由于样本采集时间点被监督方法用来推断伪时间坐标，因此这些信息不能用于评估DeLorean用POS生成的模型。因此，我们通过测量推断轨迹中连续放置的细胞的基因表达值的“粗糙度”来评估该方法。使用ANOVA选择的前20个基因，我们获得DeLorean的粗糙度值为72.9，而基于PCA的排序得分为72.5，表明通过PCA预测的细胞基因表达的过渡稍微平稳。通过使用不同的距离测量代替粗糙度来测量总轨迹距离，即欧氏距离、余弦距离和基于相关性的距离（未显示数据），得出了相同的结论。通过计算随机排序单元集上的R得分，得到了零分布。经过1000次迭代后，将使用DeLorean和1D伪时标度获得的R分数与零分布进行比较，并将p值估计为每个预测路径的累积概率。1D伪时标度和DeLorean排序均表明，在重建转录组值的平稳过渡方面具有显著的准确性（两种方法的P<0.001），与零分布的左尾相比，PCA得分更为极端（见下图）。两个订单的相似性度量，如TSCAN包中实现的和中所述(季和季，2016)，表明两种方法获得的细胞位置相似（相似度=0.72）。
随机排序粗糙度的零分布红色和绿色箭头分别表示1D伪时标度和DeLorean获得的粗糙度值。
分支轨迹的评估
Wishbone方法（Setty等人，2016）用于探索分叉发展轨迹，前三个非平凡扩散分量用于定义分叉轨迹。由于该工具需要轨迹的起点，因此我们选择了1D-PCA投影的第一个单元。如降维方法tSNE（t-distributed random neighbear embedding）所示，使用Wishbone观测到一个分支，有有限数量的细胞偏离主轨迹。通过选择胰岛素值最低的细胞也获得了类似的结果(检查2)作为起点，假设胰岛素水平在出生后成熟期间增加，以及使用不同的扩散成分（数据未显示）。通过分析兴趣模式，我们确认2英寸并且呈下降趋势附件3和Srf公司表达式。如下图所示，Wishbone识别的两个分支都显示了这些模式，两者的动态略有不同。
Wishbone检测到细胞与不同分支的关联tSNE图：属于主轨迹的单元格用蓝色表示，偏离两个不同分支的单元格用绿色和红色表示。
的表达式值Ins2、Atf3和Srf公司在（0-1）范围内缩放，并在Wishbone识别的细胞轨迹上显示在分岔点之后，用虚线和虚线描述了属于不同分支的两个细胞轨迹。
与外部数据集的比较
使用基因集富集分析（GSEA）对小鼠和人类研究中已发表的基因签名进行生物信息学比较。青少年供体β细胞中高表达α-细胞特征基因的特征(Wang等人，2016年)如“基因集的伪时间分析”一节中详细描述的，使用GSEA分析与伪时间坐标的相关性。同样的方法用于标记3个月龄和26个月龄小鼠的β细胞之间差异表达的基因(Xin等人，2016). Xin等人的数据(Xin等人，2016)，包括来自3个月大的小鼠（P90）的单细胞样本，使用SVA-seq进行标准化，以便比较来自不同实验室的样本，以及用于单细胞数据的同一组阴性对照基因。方程式1中描述的PCA模型用于预测用于推断模型的基因的表达值，对应于我们的单细胞数据集中的前四分位最变异基因（n=4313）。包含这些额外样本投影的一维伪时标度如下所示。计算P28（R=90.1）和P90（R=91.5）的伪时间坐标范围R，作为单个细胞异质性的定量测量。
外部数据在伪时标上的投影来自3个月大的小鼠（P90）的细胞及其相应的中位数投影用粉红色表示。
时序和伪固定时间表达式的分析
在所有后续分析中使用的至少2个细胞中的对数转化RPKM>1的基因被视为构建时序和伪二进制时间表达谱。对每个基因考虑五个时间点中每个时间点的样本平均值，以获得时间顺序剖面。通过将伪时序细胞分配到五个箱子来构建伪时间剖面，每个箱子的大小等于相应时间点收集的细胞数量。
单个基因的伪时间分析
根据与假时间坐标的相关性，对至少2个细胞中的对数转化RPKM>1的基因进行排序。在一组1000个随机排列的基因表达谱上评估相关性值的显著性。
血清氨基酸检测
使用YSI 2950酶分析仪测量P1和P28小鼠（n=4）的血清谷氨酰胺浓度。为了测量其他氨基酸，首先将5μl血清与200μl甲醇（水中50%v/v，20μM l-去甲缬氨酸为内标）涡流混合，然后再与100μl氯仿混合，然后以13000 rpm离心10 min。对上（极）相进行干燥、衍生和分析。使用MetaQuant根据平行运行的不同数量的标准对样品中的氨基酸进行定量。
谷氨酰胺摄取测量
隔夜在PBS中清洗回收的P1和P28胰岛，然后将其（50个胰岛/时间点，一式三份）置于含有2mM谷氨酰胺的100μl培养基中的96孔板中。24小时后，分别收集上清液和胰岛。没有仅含有培养基的细胞的微孔作为对照。将上清液离心（10000 rpm，10分钟，4°C），然后在-80°C下保存，直至分析。在RIPA缓冲液中溶解胰岛，并测量每个含有上清液的微孔的蛋白质浓度。使用YSI 2950酶分析仪测量上清液中的谷氨酰胺浓度。通过从对照样品谷氨酰胺浓度中减去实验谷氨酰胺浓度来计算谷氨酰胺摄取率，并表示为每微克细胞蛋白每小时谷氨酰胺的pmol。进行了三个独立的实验。
补充氨基酸或核苷酸测量β细胞增殖
将4至6周龄C57BL6小鼠的分离胰岛培养过夜，然后供应新鲜培养基，补充1 mM的脯氨酸、丝氨酸、赖氨酸、酪氨酸（Sigma）、谷氨酰胺（总量为3 mM）（生命技术）或核苷酸（1X GS培养基增补剂，Millipore）。然后用胸腺嘧啶类似物EdU对胰岛进行额外48小时的培养，在最后24小时内将其添加到培养基中。使用BD FACSCanto II，使用Click-iT EdU Alexa Fluor 488（生命技术）和兔Alexa-Fluro-647结合胰岛素单克隆抗体（细胞信号技术）检测细胞增殖，并使用Flowjo 8.7进行分析。进行了三个独立的实验。
线粒体膜电位和线粒体活性氧的FACS检测
让P1和P28胰岛整夜恢复，在37°C下用胰蛋白酶-EDTA处理5分钟，然后用含有4 mM葡萄糖的克雷布斯溶液冲洗两次。为了检测线粒体膜电位，将分离的胰岛细胞与10 nM荧光探针TMRM（Life Technologies）和200 nM MitoTracker Green（Life Technologies）在37°C的含有4 mM葡萄糖的Krebs溶液中孵育1小时，并加入或不加入50μM FCCP（Sigma）。为了检测线粒体活性氧，将分离的胰岛细胞与5μM MitosoxRed（Life Technologies）和200 nM MitoTracker Green（Life Technologies）在37°C的含有4 mM葡萄糖的Krebs溶液中孵育1小时。细胞用PBS清洗一次，用BD FACSCanto II进行FACS评分，并用Flowjo 8.7进行分析。TMRM和MitosoxRed水平被标准化为MitoTracker Green。进行了三个独立的实验。
ΔΨm分析
用accutase（Life Technology A1110501）分散P1和P28胰岛10分钟，将其置于Greiner Cellview玻璃底部10 mm四室共聚焦培养皿上，并培养过夜以恢复。第二天，用15 nM TMRE（Life Technologies）和200 nM MitoTracker Green在4 mM葡萄糖浓度下的Krebs缓冲液中对分散的细胞染色45分钟，然后用含有15 nM TM RE和4 mM葡糖的缓冲液冲洗两次。细胞在蔡司LSM880共焦显微镜上成像。然后补充葡萄糖以获得总计16 mM的葡萄糖，并在30 min时对细胞进行成像。随后，添加50μM FCCP，并在10 min时对电池进行成像。所得图像被量化为红色和绿色通道中的荧光强度（分别为TMRE和MitoTracker green）。活细胞被定义为与FCCP治疗相比，在4 mM葡萄糖中TMRE/MitoTracker-Green比率至少增加10%。ΔΨm的相对变化是通过16 mM葡萄糖中TMRE/MitoTracker-Green比率相对于4 mM葡萄糖的倍数变化来计算的。
线粒体DNA定量
为了测量线粒体DNA拷贝数，根据制造商的说明，使用DNeasy Blood&Tissue Kit（Qiagen）从P1和P28小鼠的mCherry分类β细胞中分离出总DNA。使用线粒体细胞色素c氧化酶亚基II的特异性引物，通过实时PCR测定线粒体DNA（mtDNA）和核DNA（nDNA）含量(Cox2公司)基因和核基因18卢比计算每个时间点的mtDNA与nDNA含量的比值。实验进行了四次。
免疫组织化学、β细胞质量测量和TUNEL分析
用以下主要抗体对小鼠胰腺进行免疫染色分析：豚鼠抗胰岛素（Dako），1:1000；兔抗Ki67（赛默飞世尔科学公司），1:200；大鼠抗BrdU（Novus Biologicals），1:250；山羊抗GFP（Abcam），1:1000；兔抗-MafA（Bethyl Labs），1:1000；兔抗Pdx1（Abcam），1:500；兔抗Nkx6.1（寿命生物科学），1:250；小鼠抗胰高血糖素（Sigma），1:100；小鼠抗肿瘤抑素（BCBC），1:2000。用与Cy3或Cy5结合的驴源二级抗体检测一级抗体（Jackson ImmunoResearch），并用0.1μg/ml的DAPI（Sigma）对细胞核进行反染色。图像在带有ApoTome模块的蔡司Axio Observer Z1显微镜上捕获，并用蔡司阿xioVision 4.8软件进行处理。对于β细胞质量测量，使用带有蔡司ApoTome模块的蔡司Axio-Oberver Z1显微镜对覆盖整个胰腺切片的图像进行拼接。使用ImageJ测量胰岛素+和胰腺总面积，β细胞质量计算如下：胰岛素+面积/胰腺总面积。为了检测细胞凋亡，使用制造商（赛默飞世尔科技公司）指定的ApopTag红色原位凋亡试剂盒进行TUNEL分析。
GSIS分析
让胰岛整夜恢复，清洗并在含有2.8 mM葡萄糖的Krebs溶液中预孵育1小时。然后，将10组胰岛转移到96孔培养皿中，放入2.8 mM葡萄糖或16.8 mM葡萄糖溶液中。培养1小时后，收集上清液，并在2%酸：80%乙醇溶液中溶解胰岛过夜。然后使用小鼠胰岛素ELISA试剂盒（ALPCO）测量上清液和裂解液中的胰岛素。分泌胰岛素以总胰岛素含量的百分比计算。
葡萄糖耐量试验
小鼠在轻相开始后禁食6小时。在0分钟时采集基础血糖，并以1.5mg/kg的10%葡萄糖剂量腹腔注射葡萄糖。在给糖后20、40、60、90和120分钟采集血样。
慢病毒的产生和转导
GFP标记慢病毒质粒（Origene PS100071）或GFP标记Srf公司将pCMV-R8.74（Addgene 22036）和pMD2.G表达质粒转染慢病毒质粒（Origene MR208120L2）至HEK293T细胞。使用PEIsolution（1 mg/ml）进行转染，并在转染后48小时和72小时收集慢病毒上清液。在4°C下通过超速离心进一步浓缩慢病毒。滴度范围为5x108至1x109时间单位/毫升。
慢病毒转导如下：分离后，胰岛培养过夜，并用accutase处理10分钟5x10三将分散的细胞每孔接种在96 v底板中（Fisher Scientific，12565481），并在含有0.8 ng/ml聚合物的MOI 5-6中用慢病毒转导。通过以365g离心5分钟使单细胞重新聚集，并在培养过夜后更换培养基。
慢病毒转导胰岛的RNA-seq分析
转导72小时后收集细胞，使用RNeasy Micro Kit（Qiagen）提取RNA。使用SMART-seq®v4 Ultra®Low Input RNA Kit for Sequenting（Clontech）和Illumina Nextera XT DNA样品制备试剂盒（Illuminia）生成三个RNA-seq文库的生物复制品，在HiSeq 4000系统（Illum）上使用50 bp单端测序进行多重化和测序。每个图书馆平均产生2500万次阅读。Cufflink如上所述绘制了读数。通过Cuffdiff评估Srf过度表达和对照样品中的差异基因表达。GSEA基因集定义为：i）基因沿假时间上调或下调（P<0.05）；ii）增殖相关基因在假手术期受到调控（P＜0.05）。
定量PCR分析
根据制造商的协议，将胰岛的DNA或cDNA与SYBR GreenERTM qPCR Supermix Universal（Thermo Fisher Scientific）混合。使用Biorad PCR系统以96-well格式进行反应。使用比较CT方法计算相对mRNA水平，并将其归一化为校准1mRNA。下面是引物和序列的完整列表。
| 底漆 | 名称序列 |
|---|
| 毫秒-校准1-F类 | GCTGCAGGATATGACG公司 |
| 毫秒-校准1-R（右） | GCTGCAGGATATGACG公司 |
| 毫秒-Srf公司-F类 | CTGACAGCAGTGGGGAAAC公司 |
| 毫秒-Srf公司-R（右） | GCTGGGTCTGTCTGGAT公司 |
| 毫秒-Cox2公司-F类 | ATACCGAGTCGTTCTGCCAAT公司 |
| 毫秒-Cox2公司-R（右） | TTTCAGAGCATTGGCAATAGAA公司 |
| 毫秒-18卢比-F类 | TGTGTTAGGGGACTGGTGGACA公司 |
| 毫秒-Rsp18型-R（右） | CATCACCACTTACCCAAAA公司 |
| 毫秒-皮平方英寸-F类 | GAGGCCGAATACCGACTTG公司 |
| 毫秒-皮平方英寸-R（右） | CCGGGAGATTTAGTGATGG公司 |
| 毫秒-皮米3-F类 | ACATGGTGTGGGGACAT公司 |
| 毫秒-皮米3-R（右） | ATAAGCTCTGGCACTCTGG公司 |
| 毫秒-锡克1-F类 | GACGGAGAGCGTCTGACACC公司 |
| 毫秒-锡克1-R（右） | GGTCCTCCGCATTTTTCCTC公司 |
| 毫秒-第二阶段-F类 | TGAAGGTGGAGACTTTGGT公司 |
| 毫秒-第二阶段-R（右） | TGGGGTTCCACATATTGTTCT |
| 毫秒-公寓1-F类 | CCGCAGGTTCTCACC公司 |
| 毫秒-公寓1-R（右） | GAGACAGCCGTGTAGT公司 |
| 胡-过氧化氢酶-F类 | TCATCAGGGATCCATATGTT公司 |
| 胡-过氧化氢酶-R（右） | CCTTCAGATGTGCTGAGGATT公司 |
