胰岛素需求通过未折叠蛋白反应调节β细胞数量

具有活跃UPR的β细胞更有可能增殖。

胰岛包含混合的细胞群，包括β细胞本身的巨大异质性。在β细胞群中，我们假设一些细胞可能会因胰岛素生成增加而激活UPR，而不同的亚群可能会因增殖而产生反应。为了以细胞为单位评估UPR激活，对胰腺切片进行BiP免疫染色。胰岛素阳性细胞中BiP表达不均匀，体内高血糖暴露增加了BiP高表达β细胞的比例(图3，A和B). 体外葡萄糖治疗也增加了含有高水平BiP的β细胞的数量(图3C). 为了确定具有活跃UPR的β细胞与增殖的β细胞是相同的还是不同的，对胰腺切片进行胰岛素、BiP和PCNA的联合免疫维护。令人惊讶的是，肉眼观察表明许多PCNA阳性的β细胞也有高BiP表达(图3，D–G). 量化证实，β细胞增殖实际上在细胞中更为频繁，有证据表明暴露于高血糖的小鼠中存在活跃的UPR(图3H). 在未应激的正常血糖小鼠（生理盐水输注，图3H). 为了了解这一观察结果是高血糖环境所特有的，还是可能是胰岛素需求增加的一个特征，我们在第二种β细胞适应模型，即高脂饮食喂养小鼠（HFD喂养小鼠）中重复了该实验(28). 在这些小鼠中，UPR活性细胞中的β细胞增殖也更频繁(图3I)尽管血糖正常（对照组饮食144±8 mg/dl，高脂饮食127±11 mg/dl），但提示UPR活跃的β细胞增殖增加可能是胰岛素需求补偿的一般特征。

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图3

在胰岛素需求增加期间激活UPR的β细胞更有可能增殖。

(A类和B类)β细胞BiP在葡萄糖灌注小鼠胰腺切片中的表达不均匀；高血糖增加了BiP高表达的β细胞数量。代表性图像显示自n个=3（盐水）和n个=4只（葡萄糖）小鼠。(C类)在体外，葡萄糖增加了BiP高表达的原代小鼠胰岛细胞（门控胰岛素[+]）的数量。(D类–克)在高血糖小鼠的胰腺切片中，PCNA染色经常出现在BiP高表达的β细胞中（箭头），而在BiP低表达的β电池中较少出现（箭头）。(H（H）和我)高血糖胰腺切片(H（H）)或高脂肪喂养(我)小鼠，含有高BiP的β细胞更有可能是PCNA阳性(n个= 3–5). (J型和K)在体外，通过流式细胞术，葡萄糖增加了原代小鼠β细胞BrdU的掺入和细胞数量(n个= 3). (L（左）–N个)在葡萄糖刺激下，BiP高的小鼠β细胞更有可能是BrdU阳性(n个= 3). (O（运行）)相反，在过度表达cyclin D2的原代小鼠β细胞中，BrdU掺入并不局限于高BiP表达细胞。(A类和D类–克)放大倍数为200倍的图像。中的图像D类–克和中的流量图C类,L（左）,M（M）、和O（运行）代表n个=3-5个实验。数据表示为平均值±SEM*对< 0.05, **对<0.01，以及***对方差分析结果<0.001(H（H）,我、和N个)或学生的t吨测试(J型和K).

我们证实了活性UPR与体外原代分散小鼠β细胞增殖之间的相关性。在15 mM葡萄糖中培养小鼠胰岛细胞增加了β细胞增殖和总细胞数(图3、J和K). 在这些培养物中，BiP水平高的细胞更有可能合并BrdU(图3，L–N). 为了测试UPR激活是否是准备进入细胞周期的结果，我们评估了通过直接操纵细胞周期诱导增殖的β细胞中的BiP水平。在过度表达cyclin D2的β细胞中，许多含有BrdU的细胞具有中或低水平的BiP，这与BiP与增殖之间的相关性是由于增殖过程中BiP的诱导这一解释相矛盾(图3O). 综上所述，我们得出结论，具有活性UPR的β细胞比不具有活性UPRs的β细胞更有可能增殖。

轻度UPR激活可在高糖环境下促进体外β细胞增殖。

尽管文献中有大量证据表明失代偿内质网应激会导致β细胞死亡(三–7)观察到的UPR和增殖之间的相关性使我们考虑到适度的UPR激活实际上可能促进β细胞增殖的假设。为了验证这一点，通过干扰内质网钙处理（thapsigargin，Tg）或糖基化（tunicamycin，Tm），用不同机制诱导内质网应激的小分子培养原代小鼠胰岛细胞。由于这些药物的通常浓度（Tg为1μM，Tm为1–10μg/ml）会导致失代偿性内质网应激和细胞死亡，因此我们应用了广泛的浓度范围，从比通常剂量低2–3个数量级开始。通过免疫印迹检测CHOP或caspase 3评估失代偿内质网应激，我们证实这些药物在正常浓度下会导致小鼠原代胰岛细胞严重内质网紧张和细胞死亡(图4，A和B、和补充图4). 通过PCNA免疫印迹，高糖诱导增殖，符合预期。有趣的是，低剂量的Tg或Tm进一步增加了在15 mM葡萄糖中培养的胰岛细胞中PCNA的丰度，在一个突然的剂量阈值上，PCNA消失，CHOP和caspase 3被诱导。为了确定混合胰岛细胞群中PCNA丰度增加是否代表β细胞增殖增加，用低剂量Tg或Tm处理培养物，并通过BrdU掺入分析增殖情况。值得注意的是，在15 mM葡萄糖中，这两种药物都比载体对照增加了小鼠β细胞的增殖(图4，C–E、和补充图5和6). 尽管分散的胰岛BrdU增殖试验从一个胰岛制剂到下一个制剂产生不同的最大增殖，尽管采取了多种预防措施来标准化该试验（见方法），但Tg和Tm的促增殖作用是一个一致的发现。增殖效应取决于葡萄糖浓度：在5 mM葡萄糖（通常的胰岛培养基）中，低剂量Tg和Tm可诱导明显的毒性，细胞丢失且无增殖，而在10–15 mM葡萄糖中可观察到增殖效应。鉴于该领域对BrdU掺入并不总是指示细胞增殖的担忧，我们进一步证实了PCNA免疫印迹和BrdU免疫染色与磷酸组蛋白H3（pHH3）免疫染色，磷酸组蛋白H3是有丝分裂的标志物。Tg和Tm都增加了pHH3的β细胞染色百分比(图4，F和G). 为了测试直接应激ER是否能增加β细胞增殖，用表达腺病毒的小鼠胰岛细胞转导2英寸^C96Y型（秋田）。秋田胰岛素原表达也增加了β细胞BrdU掺入(图4H). 除了对增殖进行组织化学评估外，我们还假设增殖增加会增加培养孔中的细胞数量。通过流式细胞术，在15 mM葡萄糖中培养可增加胰岛细胞和β细胞的数量，但在5 mM对照组中不增加α细胞的数量(图4，I–K、和补充图6和7). 低剂量Tg和低剂量Tm，而不是高剂量Tg，增加了培养孔中的β细胞数量，再次支持了增殖效应。比较细胞计数包括一些样品中增殖细胞的增加和其他样品中死亡细胞的损失，例如在5mM葡萄糖条件下（见下文）。虽然我们不认为低剂量Tg和Tm暴露会导致细胞死亡，因为CHOP和激活的caspase 3水平较低(图4，A和B)，我们通过Annexin V/碘化丙啶染色直接测量细胞死亡(图4L和补充图8). 正如预期的那样，阳性对照组（高剂量Tg）中检测到强烈的细胞死亡，但暴露于增殖剂量Tg的原代胰岛细胞中的细胞死亡较低，与15 mM葡萄糖对照组相当。在5 mM葡萄糖条件下，细胞死亡增加，这可能解释了在低葡萄糖条件下对Tg和Tm的敏感性明显增加，并导致5 mM和15 mM葡萄糖之间的细胞数在流量计数上的差异。最后，为了排除BrdU掺入是DNA损伤产物的可能性，对培养物进行了BrdU和γ-H2AX的联合免疫保护。用葡萄糖或增殖剂量的Tg或Tm治疗后，大多数BrdU阳性细胞核的γ-H2AX为阴性(补充图9). 综上所述，这些数据表明，通过干扰2种不同的内质网维持系统，诱导轻度的非补偿内质网应激足以在体外诱导β细胞以葡萄糖依赖的方式增殖。

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图4

体外激活轻度UPR可增加β细胞增殖和β细胞数量。

(A类和B类)在原代小鼠胰岛细胞中，低剂量Tg（2–20 nM）或Tm（10–100 ng/ml）可进一步增加由15 mM葡萄糖诱导的PCNA。明显存在明显的药物剂量阈值；在较高剂量的Tg或Tm下，PCNA突然丢失，失代偿标记物CHOP(A类)和激活的caspase 3(B类)被诱导。波段以下的数字是平均波段强度量化n个=5-7个免疫印迹；平均值图见补充图4. *对<0.05 vs.15 mM车辆。(C类–电子)用低剂量Tg或Tm处理的小鼠胰岛细胞在高糖下增加增殖(n个= 3). (F类和克)磷酸化氢istone H3证实细胞增殖(n个= 3). (H（H）)秋田胰岛素原的表达促进β细胞增殖(n个= 5). (我–L（左）)流式细胞仪定量细胞计数显示低剂量Tg和Tm处理的培养物中β细胞数量增加(n个= 5–7). (J型和K)低剂量Tg不会诱导细胞死亡(n个= 4). (C类和F类)放大倍数为200倍的图像。数据表示为平均值±SEM*对< 0.05, **对< 0.01, ***对<0.001，以及^†对方差分析结果<0.0001。对中的值A类,B类,克、和我–L（左）是相对于15mM载体。

体内内质网应激在失代偿前诱导β细胞增殖。

由于体外实验表明，适应性UPR激活可促进增殖，因此我们询问内质网应激是否会在体内推动β细胞增殖。我们首先研究了瘦素受体缺陷分贝/分贝C57BLKS基因背景的小鼠。这些小鼠是一个成熟的β细胞内质网应激模型，这是由于胰岛素抵抗导致的胰岛素需求增加和C57BLKS基因影响的结合，而C57BLKS基因容易导致β细胞内质网应激和失败(29–32). 4周大时，分贝/分贝小鼠的体重和血糖仍接近正常，但通过BiP免疫染色检测，它们显示出UPR激活(图5，A–D). 与早期或轻度UPR促进增殖的假设一致，β细胞增殖在分贝/分贝4周龄的小鼠在成年后肥胖、糖尿病以及胰岛β细胞丢失时下降到与对照组相同的水平(图5，A–E). 因此，在分贝/分贝-β细胞应激的C57BLKS模型，β细胞增殖早期增加（当UPR存在但强度较低或持续时间较短时），但当失代偿发生时（当应激强度较大或持续时间较长时），增殖后期消失。

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图5

体内内质网应激在失代偿前增加β细胞增殖。

(A类–电子)分贝/分贝/当存在UPR但胰岛失代偿前，BLKS小鼠的β细胞增殖增加。(A类和B类)年体重和血糖接近正常分贝/分贝小鼠在4周龄时，但在11-14周龄时出现肥胖和糖尿病（成年；n个=3–5）。(C类–电子)4周大时，UPR已经活跃(D类)β细胞增殖增加(n个=4-6；C类和电子). 成人分贝/分贝小鼠β细胞失代偿明显（高血糖、胰岛形态丧失；n个= 6–10). (F类–K)内质网应激直接作用于β细胞足以增加体内β细胞的增殖。(F类–H（H）)杂合秋田小鼠在2周龄和3周龄时血糖和体重正常，但在4周龄时出现高血糖(n个= 4–22). 胰腺切片显示2周大时UPR已经激活。(我–K)在2周龄和3周龄时，即UPR活跃但失代偿开始前，BrdU掺入升高(n个= 3–5). (K)使用PCNA染色确认2–3周龄的秋田β细胞增殖(n个= 5–11). (D类,电子,H（H）、和我)放大倍数为200倍的图像。数据表示为平均值±SEM*对< 0.05, **对<0.01，以及***对<0.001（学生）t吨测试。

为了确定直接作用于β细胞的内质网应激是否会增加体内β细胞的增殖，我们研究了杂合子2英寸^C96Y型/+（本文称为秋田）小鼠，其中一个突变的胰岛素原（4个胰岛素等位基因中的1个）由于不正确的二硫键形成而导致β细胞内质网应激(32,33). 这些小鼠出生时糖耐量正常，但成年后由于内质网应激诱导的β细胞衰竭而成为糖尿病小鼠(34,35). 在我们的群体中，秋田幼犬在2周龄和3周龄时体重和血糖正常，在4周龄时出现糖尿病(图5，F和G). BiP免疫染色显示，早在2周龄时UPR就活跃，3-4周龄时出现异常的β细胞形态（不均匀的胰岛素染色）(图5、H和I). 再次与我们的假设一致，通过BrdU掺入测量并通过PCNA染色证实，β细胞增殖在2周时增加，在3周时减少，并且在4周时不再升高，此时严重应激明显(图5，I–K). 因此，两组中的β细胞增殖均升高分贝/分贝和秋田小鼠在内质网应激开始后早期，但在胰岛失代偿时消失。总之，4种不同的内质网应激源——干扰内质网钙处理、阻止内质网蛋白糖基化、β细胞内质网紧张敏感背景中的瘦素受体缺陷以及内质网中错误折叠的胰岛素原的负载——都导致了β细胞增殖增加。这些数据与轻度或早期UPR促进β细胞增殖的假设一致。

胰岛素需求诱导的体外和体内β细胞增殖需要UPR激活。

为了了解体外培养的β细胞对葡萄糖的增殖反应是否需要UPR激活，我们将两种化学伴侣——牛磺脱氧胆酸（TUDCA）和4-苯丁酸（PBA）应用于胰岛细胞培养，这两种药物可以减少内质网应激。这两种化学伴侣降低了胰岛培养中葡萄糖诱导的内质网应激，同时降低了p-eIF2α、p-IRE1和ATF6(图6A). PCNA的免疫印迹表明，这两种伴侣也降低了葡萄糖诱导的胰岛细胞增殖(图6、B和C). 使用免疫荧光法评估伴侣对β细胞增殖的特异性影响，我们证实，添加任一伴侣都可以阻止葡萄糖诱导的β细胞增殖增加(图6、D和E). 为了排除药物非特异性抑制细胞分裂或掺入BrdU标签所需的某些机制的可能性，我们在通过过度表达细胞周期蛋白D2激活细胞周期的同时重复了该实验。伴侣蛋白再次阻断了葡萄糖诱导的增殖，但对过度表达cyclin D2的胰岛细胞中BrdU掺入没有影响，这表明该结果不是由于非特异性毒性所致(图6，F和G).

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图6

葡萄糖诱导的β细胞体外增殖需要UPR激活。

(A类)化学伴侣TUDCA和PBA通过15 mM葡萄糖降低小鼠胰岛细胞UPR激活。(B类和C类)伴侣TUDCA和PBA可降低PCNA的葡萄糖诱导。免疫印迹A类和B类代表n个=3-4个独立实验。(D类和电子)用TUDCA或PBA缓解内质网应激可阻止葡萄糖诱导的小鼠β细胞增殖(n个= 4). (F类和克)TUDCA和PBA都没有减少过表达细胞周期蛋白D2诱导的增殖，反对对BrdU摄取或增殖的非特异性毒性作用(n个= 3). 数据表示为平均值±SEM*对< 0.05, **对<0.01，以及***对方差分析结果<0.001。

为了测试胰岛素需求诱导的体内β细胞增殖是否需要内质网应激，在安乐死前2天，对β细胞内质网负荷增加的小鼠模型进行对照或静脉注射TUDCA。胰腺切片的免疫荧光显示，TUDCA暴露降低了β细胞内质网应激标记物BiP的丰度(图7A). TUDCA治疗显著降低秋田β细胞增殖(图7、B和C),分贝/分贝-黑色(图7、D和E)和HFD喂养小鼠(图7，F和G)，在这个时间段内不降低血糖(补充图10)或阻止肠道BrdU掺入（Rohit Sharma，未发表的观察结果）。需要注意的是，小分子抑制剂可能会对其他途径或组织产生非靶向效应，TUDCA可能会降低高需求状态下的代谢需求，例如HFD-fed或分贝/分贝老鼠(36)这些结果表明，体内胰岛素需求或内质网应激驱动的β细胞增殖可能需要UPR激活。

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图7

体内胰岛素需求诱导的β细胞增殖需要UPR激活。

(A类)安乐死前2天每天两次静脉注射TUDCA可降低秋田和分贝/分贝-BLKS ER负载模型。图像代表了n个=3个生物复制。(B类–克)两天每天两次腹腔注射TUDCA可降低2周龄秋田小鼠的β细胞增殖(B类和C类;n个=3–5），4周龄分贝/分贝老鼠(D类和电子;n个=5–13），在喂食HFD的小鼠中(F类和克;n个= 5–8). 图像是在放大倍数为200倍的条件下采集的。箭头指向BrdU-阳性β细胞。数据表示为平均值±SEM*对<0.05和**对方差分析显示<0.01。

ATF6对于促进β细胞增殖是必要的，也是足够的。

UPR反应由三条典型途径组成：PERK/eIF2α、IRE1/XBP1和ATF6(三,7). 在原代小鼠胰岛细胞培养物中，葡萄糖激活了所有3条通路(图2，F–J). 为了确定这些途径中的一种或多种是否介导β细胞对葡萄糖的增殖反应，使用小分子在原代小鼠胰岛细胞中单独抑制每种途径(补充图3和11; 参考文献。37–39). ATF6和IRE1抑制剂均能降低葡萄糖诱导的增殖，但不受PERK抑制剂的影响(图8A). 相反，这些抑制剂都没有减少细胞周期蛋白D2过度表达引起的细胞周期进入，这与非特异性毒性相矛盾(图8A). 免疫印迹显示ATF6和IRE1抑制剂，而不是PERK抑制剂，也降低了原代胰岛细胞培养物中PCNA的丰度(图8B). 为了测试激活IRE1或ATF6通路是否诱导β细胞增殖，采用电穿孔法在原代小鼠胰岛细胞中过度表达IRE1、剪接（活性）XBP1或ATF6(图8，C–G、和补充图12). 令人惊讶的是，鉴于IRE1抑制剂降低了增殖，IRE1或sXBP1的过度表达也降低了15 mM葡萄糖中β细胞的增殖(图8、D和G). 然而，ATF6过度表达足以增加β细胞增殖(图8G). 为了测试葡萄糖诱导增殖是否需要IRE1或ATF6，使用shRNA降低分散胰岛细胞的表达(图8，H–P). 与抑制剂实验类似，ATF6或IRE1表达的下调降低了葡萄糖诱导的BrdU掺入(图8，I和J). 然而，只有ATF6敲除显著降低PCNA丰度(图8，K–P). 总之，这些结果表明ATF6对于葡萄糖诱导的小鼠β细胞增殖是必要的，并且足够的，IRE1/XBP在任何方向上的扰动都会干扰增殖，但该途径不足以驱动增殖。

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图8

ATF6通路对于葡萄糖诱导的体外β细胞增殖是必要的和充分的。

(A类)在原代小鼠β细胞中，ATF6和IRE1途径的小分子抑制剂显著降低了葡萄糖诱导的增殖，但PERK抑制剂没有降低(n个= 3–4). 细胞周期蛋白D2过度表达直接激活细胞周期不受影响，这与非特异性毒性相矛盾。(B类)免疫印迹显示，ATF6和IRE1抑制剂均能降低葡萄糖诱导的胰岛细胞PCNA(n个=3）。(C类–克)IRE1过度表达(n个= 3,C类和D类)，sXBP1(n个= 4,电子和克)，或ATF6(n个= 4,F类和克)在小鼠胰岛细胞中，只有ATF6增加了β细胞的增殖。(H（H）–对)shRNA敲除小鼠原代胰岛细胞中的ATF6或IRE1表明，葡萄糖诱导的β细胞增殖需要ATF6和IRE1的最佳水平(n个= 3–6,我和J型)尽管只有ATF6敲除降低了PCNA丰度(n个= 3–5,K–对).H（H）显示击倒我;K对于L（左）和M（M）; 和N个对于J型,O（运行）、和对所有实验的持续时间为72小时。数据表示为平均值±SEM*对< 0.05, **对< 0.01, ***对<0.001，以及^†对通过方差分析，<0.0001(A类,B类,D类,克,我、和J型)或学生的t吨测试(L（左）,M（M）,O（运行）、和对).

小鼠胰岛的分离、分散和培养。

岛屿如前所述被隔离(24)通过胶原酶消化和ficoll-hypaque密度梯度分离。在所有原代胰岛细胞实验中，胰岛在胰岛完整培养基（ICM、含有10%FBS的RPMI、青霉素/链霉素和5 mM葡萄糖）中培养过夜。第二天，对胰岛进行手工挑选和胰酶消化（0.05%胰蛋白酶），并将单个细胞涂布在无涂层的盖玻片上进行免疫荧光，或涂布在未涂层的塑料上进行Western blots和RNA。为了将变异性降至最低，使用分散的胰岛增殖试验、单一供应商的FBS（大西洋生物制品公司）和批次；胰岛培养基散装混合，小量贮存；胰岛分散用胰蛋白酶在一次性试管中冷冻。对每个生物复制品进行控制，以尽量减少变异性对实验结果的影响。当一项实验需要的胰岛数量超过一只小鼠所能获得的数量时，将多只小鼠的胰岛汇集在一起以实现一次生物复制。免疫印迹和免疫染色给药72小时（最后24小时用BrdU），或定量PCR（qPCR）给药6、24或48小时。

蛋白质组学筛选。

如上所述，将C57BL/6J 10至12周龄雄性小鼠注射生理盐水或葡萄糖4天。在含有1%FBS的ICM中分离胰岛并在冰上手工采摘。将来自每种情况下4只小鼠的胰岛裂解物合并，用Cy3或Cy5（匹兹堡大学蛋白质组学核心）标记，合并，在Immobiline pH 4-10等电聚焦条上聚焦到70000伏小时（IPGphor电源，Bio-Rad），并用SDS-PAGE分离(66). 对凝胶图像（台风扫描仪、GE Healthcare）的光斑强度变化进行目视评估。凝胶用考马斯（Bio-Rad）进行后染色，手动切除24种感兴趣的蛋白质（OneTouch，The Gel Co.）。在胰蛋白酶消化（胰蛋白酶金，Promega）后，洗脱肽，脱水，将肽溶解在50%乙腈/0.3%三氟乙酸/1 mM柠檬酸和等量饱和α-氰基-4-羟基肉桂酸中，并在MALDI板上进行斑点（Applied Biosystems）。匹兹堡大学综合核心设施的ABI 4700质谱仪上进行的MALDI-TOF分析确定了18种独特的蛋白质(补充表1).

免疫印迹。

用PBS洗涤胰岛细胞，并在直接添加到培养基中的125 mmol/l tris、2%SDS、1 mmol/l二硫苏糖醇、20μg/ml 4-氨基苯甲烷磺酰氟盐酸盐（APMSF）和蛋白酶抑制剂中溶解胰岛细胞。用切好的移液管尖端将细胞从塑料中分离出来，用30秒的脉冲对样品进行10分钟的声波处理，并在4度下进行30秒的休息。样品在SDS-PAGE加载缓冲液中煮沸5-10分钟。在SDS-PAGE上分离后，将蛋白质转移到PVDF膜上，然后用含有PBS和0.1%吐温-20的5%脱脂奶粉封闭膜1-2小时。用来自Abcam（p-IRE1，目录ab124945）、BD Biosciences（BiP，目录610978）、Cell Signaling Technology（sXBP，目录12782；CHOP，目录2895；活化caspase 3，目录9661；GRP94，目录2104；p-eIF2α，目录9721；PDI，目录2446；和IRE1（目录3294）、EMD Millipore（肌动蛋白，目录MAB1501；Cre，目录69050）、Imagenex（ATF6，目录IMG-273）、Novus Biologicals（ATF6，目录NBP1-40256）、Santa Cruz Biotechnology Inc.（PCNA，目录sc-56）和Sigma Aldrich（Flag，目录F1804）。使用ECL、ECL prime（GE Healthcare）或SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate（Thermo Scientific）开发印迹。使用ImageJ（NIH）量化带强度。

RNA分离和qPCR。

使用一体式RNA纯化试剂盒（诺根生物技术公司）从完整胰岛（体内葡萄糖输注）或分散胰岛（细胞培养实验）中分离出RNA。RNA质量和数量通过RNA完整性数和Nanodrop进行验证。使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）从100–500 ng总RNA合成cDNA。在RealPlex 2和4循环（Eppendorf）上使用SYBR绿色检测进行qPCR。对于基于凝胶的Xbp剪接半定量分析，cDNA在98℃下扩增2分钟，在98℃29个循环中扩增30秒，在60℃下扩增30秒、在72℃下扩增50秒，最后在2%琼脂糖凝胶上延伸5分钟，并使用GelDoc（UVP LLC.）成像。引物来自文献(补充表4). 数据表示为ddCt（折叠变化）。对于XBP1型剪接，半定量PCR，琼脂糖电泳；使用ImageJ（NIH）对条带进行量化。

流式细胞术。

培养处理后，用胰蛋白酶将分散的胰岛细胞从培养板上分离出来。悬浮液中的细胞要么没有固定（用于Annexin V/PI染色），要么用4%PFA在冰上固定20分钟。然后用冰镇PBS清洗细胞两次，并保持4度直到染色。染色当天，离心PBS中的细胞，并用BD细胞修复液/细胞壁缓冲液（BD Biosciences）在冰上再次固定5分钟。清洗后，将细胞重新悬浮在含有300μg/ml DNase的DPBS中，用于DNA消化以进行BrdU染色。细胞在37°C下培养1小时，然后用BD perm/wash缓冲液（BD Biosciences）清洗。使用抗胰岛素-488抗体（细胞信号技术）、BrdU-PE（BioLegend）和未结合的小鼠BiP抗体在冰上进行20-30分钟的染色。洗涤后，加入抗小鼠APC标记的抗体20-30分钟。对于培养细胞计数，按照上述方法制备样品，不含DNAse，并使用与Zenon Pacific Blue（Invitrogen）偶联的小鼠抗胰高血糖素附加标签。在固定的时间内以相同的速度对每个样本的细胞进行计数，以评估相对细胞数。使用LSRII流式细胞仪（BD Biosciences）和FlowJo软件对实验进行分析。根据制造商的方案（Millipore）进行Annexin V/PI染色，并使用BD Accuri C6流式细胞仪（BD Biosciences）和Flowjo软件进行分析。

IHC和免疫细胞化学。

胰腺和肠道在室温下用4%福尔马林（v/v）固定5小时，并包埋在石蜡中。使用下面列出的一级抗体和DyLight二级抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.）封锁5至7微米的切片并标记。对于免疫细胞化学，将分散的胰岛细胞在室温下用4%多聚甲醛固定10分钟。对于BrdU染色，在阻断步骤之前，将载玻片或盖玻片在37°C的1N HCl中预培养30分钟。用于免疫染色的抗体来自Abcam（BrdU，目录ab6326；胰岛素，目录ab7842）、BD Biosciences（BiP，目录610978）、Cell Signaling Technology（γ-H2AX，目录9718；pHH3，目录3377）和Santa Cruz Biotechnology Inc.（PCNA，目录sc-56）。使用尼康荧光显微镜采集图像，进行盲检和手动计数。在透射电子显微镜下，胰腺固定在2.5%戊二醛/2%多聚甲醛中，后固定在1%OsO水溶液中₄，1%K_三铁（CN）₆。通过分级乙醇系列脱水后，将样品渗透到环氧丙烷/Polybed 812环氧树脂（Polysciences Inc.）的1:1混合物中，嵌入，在37°C下固化过夜，并在65°C下硬化2天以上。将超薄（70nm）切片收集在200目铜栅上，并用在50%甲醇中的2%乙酸铀酰染色10分钟，然后用1%柠檬酸铅染色7分钟。使用JEOL JEM 1011透射电子显微镜在80 kV电压下对切片进行成像，该显微镜配有侧装AMT数码相机（高级显微镜技术）。

转染和腺病毒感染。

质粒取自Addgene（ATF6α、IRE1α和sXbp）或OriGene（sh-ATF6和sh-IRE1）。将胰岛分散到单个细胞中，并用PBS清洗。添加质粒，使用Neon转染系统（Invitrogen）在950 mV下电穿孔细胞，电击2次20 ms。电穿孔前后的存活率(补充图12)通过向悬浮在100μl PBS中的细胞添加1μl TO-PRO-3（Invitrogen）进行测量，然后在BD-LSRII上进行流式细胞术，并使用FlowJo软件进行分析。将分散的转染细胞涂布在塑料上进行Western blot，或涂布在盖玻片上进行免疫细胞化学，在治疗前24小时恢复。在接种后第二天，用表达小鼠细胞周期蛋白D2或对照（Vector BioLabs）的腺病毒在10 MOI下转染分散的胰岛细胞。

人类胰岛培养。

从综合胰岛分配计划（IIDP）获得的人类胰岛可以在ICM中恢复24-48小时。除葡萄糖和药物治疗96小时外，胰岛被采摘、分散并盖在盖玻片上，治疗开始时加入BrdU。在对照组7.5 mM葡萄糖条件下，用DAPI染色法测定的细胞核总数除以胰岛素染色的细胞数，从而确定人类胰岛制剂中β细胞的百分比，实验图像如图9A将表达人ATF6或对照的腺病毒（Vector BioLabs）在10 MOI下用于转染接种后第二天分散的人胰岛细胞。96小时后，细胞固定并按上述方法染色。

化学制品。

使用的化学品包括Tg（每文本剂量）、TUDCA（100 ng/ml）、PBA（250 nM）和Brdu（40 mg/kg）（均来自Sigma-Aldrich），以及Tm（每文本用量）、ATF6抑制剂AEBSF（100 nM）、PERK抑制剂GSK2606414（5 nM）以及IRE1抑制剂4μ8c（7μM）（均来源于EMD）。

统计。

数据表示为平均值±SEMn个独立小鼠或独立胰岛制剂。使用Prism（GraphPad）进行统计分析。对值由双尾学生的t吨用Sidak后验进行多重比较的检验或单因素方差分析；对<0.05被认为是显著的。

人类胰岛由NIDDK资助的IIDP在希望之城提供。我们感谢匹兹堡大学蛋白质组学核心、集成核心设施和生物成像中心的唐娜·斯托尔茨分别在蛋白质组学筛查和电子显微镜方面提供的帮助，并感谢麻省大学医学院国家小鼠代谢表型中心（U24-DK093000）向杰森·金提供的支持。本研究由国家卫生研究院资助：DK076562（给L.C.Alonso）、DK095140（给L.C.Alongo）和DK48280（给P.Arvan）。我们还感谢与我们的朋友和同事以及麻省大学Beta Cell Group进行的许多重要讨论。