介绍
尽管多种蛋白在神经退行性疾病发病机制中的作用已经确立，但我们对其功能知之甚少。在帕金森氏病（PD）以及相关疾病路易体痴呆（DLB）和多系统萎缩中，外周膜蛋白α-突触核蛋白积聚在特征性内含物中1α-突触核蛋白突变也会产生一种显性遗传形式的PD2–7表明该蛋白具有致病作用。事实上，α-突触核蛋白基因重复，特别是三倍化，会导致严重的家族性PD8表明野生型（wt）蛋白与疾病有关。因此，突触核蛋白在PD中起着核心作用。然而，对α-突触核素的正常功能仍知之甚少。
α-突触核蛋白通常定位于神经末梢，提示其在神经递质释放中起作用9与此一致的是，适度的过度表达（不足以产生内含物或明显的毒性）抑制了大密度核心囊泡（LDCV）和突触囊泡的调节胞吐作用10–12然而，突触核蛋白的损失影响较小，据报道，在缺乏α-突触核蛋白以及密切相关的β-和γ-亚型的三重敲除（TKO）小鼠中，谷氨酸释放增加很少或没有增加13,14缺乏α-和γ-突触核蛋白的敲除小鼠显示诱发多巴胺释放增加15但引起这种生理变化的原因尚不清楚。尽管过表达抑制调节性胞吐，但内源性α-突触核蛋白的作用仍不清楚。
α-突触核蛋白与高曲率阴离子膜特异结合16–18，但也会使脂质双层变形。酵母中的突触核蛋白聚集膜19,20，管状人工膜在体外21当在哺乳动物细胞中过度表达时，会产生线粒体断裂22,23然而，膜变形通常被认为在内吞作用而非外吐作用中起重要作用。因此，过度表达的突触核蛋白对胞吐的影响很难根据膜弯曲感知或促进特性来解释。另外，已建议synuclein作为SNARE复合物的伴侣，但对递质释放没有明显影响14.
突触核蛋白引起的膜变形如何影响调节性胞吐？在胞吐过程中，突触小泡形成一个融合孔，在完全塌陷进入质膜之前会扩张。然而，作为“kiss-and-run”机制的一部分，毛孔也可以闭合，从而立即再生囊泡24膜曲率的调节可能因此影响融合孔的行为。由于谷氨酸等经典递质迅速逃逸，突触后记录可能无法检测到融合孔动力学的变化。因此，我们使用成像技术直接监测个别细胞外事件。单突触囊泡融合事件难以通过成像检测，因此我们重点关注肽能大致密核心囊泡（LDCV），因为它们的大小（直径70-200 nm）和相对缓慢的释放。肾上腺嗜铬细胞被广泛用于研究调节性胞吐过程，包括kiss-and-run释放25之前的工作确实证明了嗜铬细胞中同核蛋白的过度表达抑制了LDCV的胞吐10.α-突触核蛋白+帕金森病和DLB患者的肾上腺也经常出现路易病26影响儿茶酚胺释放到循环中27.
结果
突触核蛋白过度表达加速了嗜铬细胞中单个细胞外事件的动力学
为了了解联核蛋白如何影响释放，我们首先用编码人类α-联核蛋白的慢病毒感染出生后小鼠肾上腺髓质的原代培养物。人α-突触核蛋白和LDCV蛋白分泌蛋白II（SgII）的双重染色证实了人蛋白在嗜铬细胞中的表达(补充图1a). 我们还使用一种识别多种蛋白的抗体评估内源性α-突触核蛋白的表达。对缺乏所有同核蛋白亚型的wt和同核蛋白TKO小鼠的嗜铬细胞的比较表明，嗜铬细胞表达内源性α-同核蛋白，慢病毒给予适度的过度表达(补充图1b、c).
为了研究单个细胞外事件，我们将脑源性神经营养因子（BDNF）与黄道荧光蛋白（一种改进的绿色荧光蛋白，具有更强的pH敏感性）融合28在LDCV的低pH值下被熄灭，BDNF-pH荧光在通过胞吐作用暴露于外部介质时增加29。我们通过TIRF显微镜监测了45 mM K去极化期间BDNF-pH氟的行为+由于kiss-and-run可能在高外部Ca下更频繁发生++30，我们还使用了5 mM的外部钙++以对更广泛种类的胞外细胞事件进行采样。α-突触核蛋白过度表达可减少使用BDNF pHfluorin检测到的胞外分泌事件的数量()如前所述10钙的变化++由于Ca，条目无法说明这一点++条目与wt或TKO没有显著差异(补充图2).
α-突触核蛋白调节肽释放动力学（a）用编码BDNF-pHfluorin和人α-突触核蛋白（SYN）或空载体（wt）的慢病毒转导wt小鼠的嗜铬细胞。α-突触核蛋白的过度表达减少了45 mM K去极化在50 s内诱发的细胞外事件的数量+。来自TKO突触核的细胞与wt细胞没有差异。*，通过单因素方差分析，p=0.01（F（2,54）=4.991）。n=每组19个细胞，来自3个独立的培养物（b）突触核蛋白影响细胞外事件的上升时间。对于每个细胞外事件，确定达到90%最大荧光的时间。插图显示了每组单个代表性单元格的平均上升时间（wt，n=46个事件；SYN，n=34个事件；TKO，n=30个事件）。直方图表示50 ms bin中上升时间的事件频率（Kolmogorov-Smirnov检验p<0.0001）。wt，n=473个事件；SYN，n=256个事件；TKO，n=518个事件
（c）细胞外事件分为四类（左图）。在完全衰减时，荧光立即衰减到基线。在高原衰退期，荧光衰减在可变潜伏期后开始。在衰变闭合状态下，荧光衰变无潜伏期，但衰变停止后才恢复到基线。高原衰变闭合包括衰变前的潜伏期和不完全衰变。图（右上）说明了我们对轨迹的解释。事件类型的比例在所有三组之间都有所不同（成对的卡方以及所有三组的比较，p＜0.0001）。（d）突触核蛋白影响BDNF的释放速率。对于所有全衰减事件，荧光衰减（τ衰减）的时间常数通过拟合单个指数来确定。直方图表示具有不同τ衰减的事件分布（通过Kolmogorov-Smirnov检验，WT与SYN以及TKO与SYM的p<0.0001；WT与TKO的p<0001）。wt，n=266个事件；SYN，n=167个事件；TKO，n=237个事件
（e）对于所有具有非零衰减潜伏期的事件，确定从达到90%最大荧光到开始衰减的时间（wt，n=134个事件；SYN，n=66个事件；TKO，n=218个事件）。***，经Kruskal-Wallis单因素方差分析和Dunn事后检验，p<0.0001；H=55.22（d）和39.45（e）
由于α-synuclein的过度表达，个别细胞外事件表现出一系列特征性变化。首先，突触核蛋白的过度表达增加了荧光的上升速度。尽管在胞吐时BDNF pH的氟不猝灭会迅速发生，但许多事件的荧光会在一帧以上的时间内增加31这反映了LDCV堆芯的缓冲和溶解32碱性化或接近质膜可能会产生类似的行为，但会损失预载染料33伴随或先于缓慢上升时间的事件(补充图4a、b). 因此，synuclein过度表达增加了H+胞吐损失(和补充图3a–c). 第二，在荧光峰值后，荧光衰减率（由于肽释放）也会增加，即使是以每个细胞的平均值而不是聚集的单个细胞外排事件进行分析(补充图3d). 这些结果表明α-synuclein加速了释放事件。然而，荧光事件至少可分为四类(和补充图3e). 许多事件立即衰减到基线（完全衰减），而其他事件在完全衰减（平台衰减）之前的一段时间内保持最大荧光。还有一些，衰变被中断，如果没有闭合融合孔，则表明收缩，在衰变之前有或没有平台（衰变平台或平台衰变平台）。为了确定荧光衰减的中断是否反映了完全的孔隙闭合，我们使用pH值调整为5.5的外部溶液和不渗透缓冲液MES来猝灭残余事件(补充图4c). 衰变过程中的所有事件都显示出酸性缓冲液的猝灭作用(补充图4d)表现为胞吐，或者完全塌陷，或者扩张的融合孔持续存在，而不是远离质膜。事实上，H+-ATP酶抑制剂巴非霉素不影响任何基因型的事件时间进程(补充图4e)，证实荧光消失表明肽释放，而不是再酸化。大多数稳定事件（平台）也显示出低外部pH值的猝灭，但有一部分没有(补充图4c，d). 因此，融合孔的完全闭合只发生在稳定的事件中，但不完全闭合仍然可以限制肽的损失。与释放加速一致，突触核蛋白过度表达增加了经历完全衰变的事件的比例(). 然而，在经历完全衰变的群体中，突触核蛋白的过度表达也会增加衰变率(,补充图3f). 因此，突触核蛋白加速释放，而不依赖于对孔隙闭合的影响，这表明在胞吐早期起到促进肽释放的作用。突触核蛋白的过度表达也对停靠小泡的数量或其管腔pH值没有影响(补充图5)，反对LDCVs的普遍干扰作为胞吐变化的原因。
突触核蛋白的丢失延长了释放动力学
在基因敲除小鼠中难以检测对递质释放的明确影响11,13,14提示α-synuclein过度表达可能只是产生毒性，继而影响释放。因此，确定突触核蛋白的丢失如何影响释放动力学是非常有趣的。与之前在神经元方面的研究一致11,13,14，来自同核蛋白TKO小鼠的嗜铬细胞的事件数相对于重量没有明显变化(). 然而，对事件分布的分析显示，荧光达到峰值的时间增加(和补充图3a). 联核蛋白的丢失适度地降低了完全衰变事件的比例()并将衰减时间常数重新分配为更长的值(). 此外，在那些不会立即衰退的事件中，TKO细胞的衰退潜伏期大大增加(). （过度表达可能不会影响该参数，因为它会将潜伏期短的蛋白转换为完全衰变。）因此，突触核蛋白的丢失会延长释放，这表明内源性和过度表达的蛋白在胞吐中的作用类似。与过表达类似，突触核蛋白TKO也对LDCV对接或pH值没有影响(补充图5).
虽然我们使用了5 mM的外部钙++对于这些实验，因为它可能促进kiss-and-run，我们还检测了BDNF-pH在更生理化的2 mM Ca下的氟事件++.在这种情况下，如5 mM Ca++人α-突触核蛋白的过度表达既抑制了嗜铬粒的胞吐，又加速了BDNF-pH氟蛋白的丢失(补充图6a、b). 事件比例再次转移到完全衰变的事件中，以中断释放的事件为代价，荧光衰变的时间常数缩短(补充图6c、d). TKO也显示出相对于wt的长时间衰减(补充图6d). 因此，synuclein对2和5 mM Ca的释放具有类似的作用++.
突触核蛋白抑制融合孔的闭合（“kiss-and-run”）
突触核蛋白对释放的影响可以反映融合孔或致密核心囊泡货物溶解度的变化。事实上，相同的LDCV可以以不同的速率释放不同的物质34,35表明聚合肽的性质会影响释放速率。细胞质蛋白（如联核蛋白）似乎不太可能影响内腔内容物，但为了进一步区分对融合孔和肽溶解度的影响，我们使用了一种将pHfluorin插入囊泡单胺转运体VMAT2内腔环的构建物36，一种定位于LDCV的多面体膜蛋白。刺激表达融合的内分泌细胞会产生与LDCV一致的离散性细胞外事件，我们在这些实验中使用巴非霉素来防止囊泡再酸化。在嗜铬细胞中，α-synuclein过度表达也抑制VMAT2-pHfluorin的胞吐(). 作为一种膜蛋白，VMAT2-pHfluorin不能被释放，因此它的衰变反映了在质膜内的扩散和内吞作用，这些过程受到融合孔的限制37事实上，我们观察到扩散的事件和其他没有扩散的事件，以及荧光衰减时间过程的变化(). 尽管具有衰变潜伏期的事件比例没有差异（突触核蛋白过度表达为46%，对照为44%），但衰变潜伏期随着α-突触核蛋白过度表达而缩短(). VMAT2-pHfluorin事件的持续时间很长，这也使我们能够确定有多少可供外部溶液使用。我们发现，在pH 5.5的MES缓冲溶液中，对照组嗜铬细胞中有很大一部分持续性事件受到保护而不被猝灭()，表示kiss-and-run。在过度表达人α-突触核蛋白的细胞中，这一比例大幅下降()表明孔隙闭合受到抑制。然而，突触核蛋白过度表达也缩短了VMAT2-pHfluorin荧光衰减的时间常数()，同样支持对释放速率的独立影响，并且每个细胞事件分布的偏差不能解释对衰减延迟或衰减速率的影响(补充图7). 因此，对膜蛋白胞吐的分析支持了联核蛋白对肽释放的影响，这种影响不能用货物溶解度的变化来解释。
VMAT2-pHfluorin分析揭示了α-突触核蛋白对融合孔的影响（a）用编码VMAT2-pHfluorin的慢病毒和人类α-突触核蛋白或空载体转导野生型嗜铬细胞，3-5天后用45 mM K+在H存在的情况下+泵抑制剂巴非霉素抑制囊泡再酸化。两次细胞外事件的波形图显示了荧光时间进程和扩散的观察变化。用45 mM K去极化后+.Bar表示0.5秒。（b）α-Synuclein过度表达可减少VMAT2-pHfluorin细胞外事件的数量（通过非配对双尾t检验，p=0.0154；t（32）=2.560）。con，n=16个细胞；SYN，n=来自3个独立培养物的18个细胞（c）突触核蛋白过度表达也降低了荧光衰减的潜伏期（Mann-Whitney的p=0.0347；U=42.00）。con，n=153个事件；SYN，n=128个事件（d）显示VMAT2-pHfluorin事件在pH 5.5下猝灭（左）和未猝灭（右）的代表性痕迹。（e）在45 mM K中去极化30 s后+，嗜铬细胞在pH 5.5下受到攻击。α-突触核蛋白的过度表达降低了在低pH值下免受猝灭的事件比例（通过非配对t检验，p=0.005；t（30）=3.863）。con，n=222个来自15个细胞的事件；SYN，n=133个事件来自17个细胞（f）荧光衰减的时间常数随着α-突触核蛋白的过度表达而缩短（Mann-Whitney的p=0.0012；U=44.00）。con，n=348个事件；SYN，n=267个事件。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001
内源性和过度表达的突触核蛋白促进神经元融合孔扩张
突触核蛋白是否也会影响神经元中单个胞外分泌事件的特性？为了解决这个问题，我们首先在原代大鼠海马神经元中表达人α-突触核蛋白，对共转染的BDNF-pHfluorin进行成像。使用识别人和啮齿动物α-突触核蛋白的抗体进行定量western分析，结果显示过表达4–5倍(补充图8). 如前所述，50Hz的刺激主要在轴突中引发离散的细胞外事件38,39(). 每个盖玻片的平均事件数与synuclein过度表达没有显著变化()，但在低pH值下淬灭表明，突触核蛋白对外部溶液可接触事件的比例有显著影响（Chi-square表示p<0.0001）(). 随着过度表达，在添加低pH值溶液之前，更多事件会衰减()这表明，与过度表达synuclein的嗜铬细胞一样，这些事件衰减得更快。然而，即使在那些仍然存在的事件中，突触核蛋白过度表达也会增加低pH值可外淬的比例()表明α-synuclein对融合孔的作用与释放速率无关。
α-突触核蛋白影响神经元融合孔的闭合（a）用BDNF-pHfluorin转染啮齿动物海马神经元，14-20天后成像，在50 Hz下刺激5 s，然后在pH 5.5下立即熄灭细胞表面荧光。箭头表示可在低pH值下淬火的事件，箭头表示耐淬火的事件。比例尺，5μm。（b）样品BDNF-pH氟痕迹表明，在虚线（左侧）和耐淬性（右侧）之间施加pH 5.5时，对淬灭敏感。（c）与α-突触核蛋白（SYN）或空载体（con）共转染并如（a）（上文）所述进行刺激的表达BDNF-pHfluorin的大鼠海马神经元的每份盖玻片的平均事件频率（平均值±SEM）（通过非配对双尾t检验，p=0.13；t（16）=1.582）。n=来自2个独立培养物的9个细胞（d）将事件归类为酸暴露时已经腐烂的事件，如果不是，则归类为未被低pH值抑制或猝灭的事件，α-突触核蛋白过度表达会降低未被抑制事件的比例（Chi-square检验p<0.0001）（左面板）。n=281个事件（con），158个事件（α-syn）。突触核蛋白过度表达也增加了每个盖玻片中可淬灭事件的比例，与那些已经衰变的事件无关（右面板）。*，未配对t检验p<0.05（t（15）=2.145）（e）将转染BDNF-pHfluorin的小鼠神经元在50 Hz下刺激5 s，并在pH 7.8和6.4下用快速振荡（1.33 Hz）的Tyrode溶液过度灌注。顶部迹线显示一个细胞外事件，其振荡持续到荧光衰减，表明融合孔保持开放直到肽释放。中间的轨迹显示了一个没有完全衰减但始终振荡的事件，这表明熔合孔没有闭合。底部轨迹显示在肽释放之前振荡停止的事件（箭头），表明孔隙关闭。（f）TKO神经元中wt和synuclein的事件类型比例不同（按Chi-square计算p=0.01）。n=7（wt）和9（TKO）盖玻片中的100起事件（g）在孔隙闭合事件中，wt和同核TKO神经元在孔隙闭合时间上的累积频率分布没有显著差异（Kolmogorov-Smirnov的p=0.63）。插图显示平均值±SEM（不另作说明，不显著）。n=wt的44个事件和TKO的63个事件
神经元表达高水平的多个突触核蛋白亚型，表明TKO的作用可能大于表达适度水平的嗜铬细胞。因此，我们感到惊讶的是，突触核蛋白TKO对已经衰变、不可抑制或可通过低pH值淬火的事件的比例几乎没有影响(补充图9). 然而，神经元中的BDNF-pH氟化物事件持续数秒()由于突触核蛋白的丢失，很难检测到任何进一步的延长，并且酸淬限制了融合孔在单个时间点的表征。因此，我们求助于记者NPY-pHfluorin，因为它从LDCV中释放的速度更快34,39为了确定荧光衰减在多大程度上反映了肽释放或再酸化，我们再次使用H+-ATP酶抑制剂巴非霉素。一小部分NPY-pHfluorin事件衰减缓慢，时间常数大于5s，并且其比例被bafilomycin降低(补充图10a). 同时，巴非霉素以同样的数量增加了无衰变事件的比例。因此，一小部分事件表现出孔隙闭合，并在内吞作用后缓慢重新酸化。然而，绝大多数事件都是快速的，衰减的时间常数大大小于5s，并且巴非霉素不会显著改变其比例(补充图10a). 巴非霉素也不能改变大多数事件的衰变动力学(补充图10b). 因此，快速NPY-pHfluorin事件反映了肽释放，只有最长的事件才会发生孔隙闭合。
与嗜铬细胞的结果非常相似，神经元中α-突触核蛋白的过度表达缩短了NPY-pHfluorin事件衰减的潜伏期，以及一旦开始衰减，荧光衰减的时间常数(). 相反，所有三个突触核蛋白的丢失会显著增加NPY-pHfluorin的衰变潜伏期和荧光衰变的时间常数(). 因此，与嗜铬细胞相比，TKO对神经元LDCV胞吐动力学的影响更为显著，可能是因为神经元表达了更高水平的内源性同核蛋白，而这种差异不能归因于每个细胞事件的偏斜分布(补充图11). 有趣的是，突触核蛋白对NPY-pH荧光衰减的影响似乎只涉及更缓慢衰减的细胞外事件()，巴非霉素的实验表明它会发生毛孔闭合(补充图10). 可能很难检测到更快速衰减事件的加速，因为它们已经非常快了。然而，我们还发现，从事件出现到衰变开始的潜伏期随着突触核蛋白的过度表达而缩短，并且TKO中的潜伏期延长，但仅限于快速衰变的事件（τ<1s），这更常见(补充图12).
过表达和内源性突触核蛋白对肽释放的影响相似（a）培养的啮齿动物神经元中NPY-pHfluorin的样品荧光痕迹以50 Hz刺激5 s。个别痕迹适合于单指数衰减的平台。未显示荧光衰减的事件（右）被评为无衰减。（b、d）衰减潜伏期与非参数“无衰减”数据相结合，绘制累积频率分布图。（b）与转染空载体（con）的对照组相比，大鼠神经元中α-突触核蛋白（SYN）的过度表达显著降低了衰变潜伏期（Kolmogorov-Smirnov的p<0.0001）。对照组，n=652起事件/5张盖玻片；α-syn，n=586个事件/8个盖玻片/2个培养物（d）与wt对照组相比，同核蛋白TKO小鼠神经元中NPY-pHfluorin事件的衰减延迟增加（p<0.0001）。wt，n=928个事件/10个盖玻片；TKO，n=769个事件/11个盖玻片/3个培养物（c、e）荧光衰减时间常数的累积频率直方图（τ衰退)由NPY-pHfluorin引起，包括没有衰变的事件。（c）大鼠神经元α-synuclein的过度表达降低了衰变潜伏期和τ衰退（科尔莫戈罗夫·斯米尔诺夫的p<0.001）。（e）TKO小鼠神经元突触核蛋白缺失增加NPY-pHfluorinτ衰退相对于野生型动物的神经元（p<0.0001）。插入（英寸）（c）和（e）表示衰减潜伏期和τ的平均值±SEM衰退用于大鼠的腐烂事件（c）和鼠标（e）神经元。***，p<0.0001，由Mann-Whitney提供；U=130046（延迟）和149764（τ）in（c）；U=221111（延迟）和227995（τ）in（e）
在嗜铬细胞和神经元中，突触核蛋白的过度表达影响了外界H+以及肽释放动力学，表明融合孔的行为发生了变化。为了以更高的时间分辨率监测融合孔闭合，我们将神经元培养物的pH值振荡在6.4到7.8之间。如果融合孔打开，pH值的变化将影响肽对氟的荧光。当荧光振荡停止时，这表明孔关闭。我们在这个实验中使用了BDNF-pHfluorin，因为事件持续时间更长，因此可以在胞吐开始后相对较长的时间内提供有关孔隙闭合的信息。显示了毛孔在肽释放之前保持打开状态的事件、在成像期间未发生闭合的事件以及闭合事件的样本痕迹。所有三个突触核蛋白基因的失活大大增加了孔隙闭合事件的比例，但以未闭合事件为代价（Chi-square表示p=0.01）(). 然而，突触核蛋白的损失并不影响孔隙闭合的时间(). 结合NPY-pHfluorin数据，这些结果表明，synuclein通过两种方式阻止孔隙闭合导致的释放中断，第一种是通过增加释放速率，第二种是通过阻止孔隙闭合。
突触核蛋白定位于致密核心小泡
突触核蛋白直接或间接影响融合孔的行为吗？尽管它位于突触前，但它在突触小泡制备中的最初鉴定及其对高曲率人造膜的偏好17通过梯度分馏和光漂白，α-突触核蛋白仅与突触小泡弱相关40,41我们也未能使用一些商用抗体在嗜铬细胞中检测到过表达或内源性同核蛋白与SgII的特异性定位。如所示补充图1，这些抗体产生扩散标记。因此，我们惊讶地发现，一种针对同源金丝雀蛋白synelfin的抗体专门标记了这些细胞中的LDCV。使用这种抗体，它可以识别α-和β-突触核蛋白42，过表达的人α-突触核蛋白通过结构照明显微镜与LDCV蛋白SgII广泛共定位(). 同一抗体在牛嗜铬细胞分泌颗粒上检测到内源性同核蛋白（个人通讯，M.A.Bittner和R.W.Holz）。内源性突触核蛋白也与SgII共定位，突触核素的免疫反应具有特异性，因为TKO显示出非常低的背景染色(和补充图S13). 内源性突触核蛋白与线粒体几乎没有共定位，支持LDCVs的特异性(和补充图14). 此外，在远离质膜的LDCV上以及在质膜上，共定位持续存在，表明突触核蛋白在对接前与LDCV结合。可能是由于膜结合蛋白或多聚蛋白的构象特异性43–45因此，该抗体为突触核蛋白在神经分泌囊泡中的特异性定位提供了第一个直接的组织学证据，表明其可能对释放产生直接影响。
肾上腺嗜铬细胞分泌颗粒中过表达的内源性突触核蛋白（a）用编码人α-突触核蛋白（SYN）或空载体的慢病毒转导来自wt或synuclein TKO小鼠的嗜铬细胞，培养72 h，并对α-突触核蛋白（H3C，绿色）以及致密核心囊泡蛋白分泌粒蛋白II（SgII，红色）进行免疫染色这些图像是使用结构照明获得的，此处显示的是位于细胞-罩玻璃界面0.5μm内的120 nm厚切片的重建。尺寸棒，2.5μm。（b）利用Pearson相关系数（R）和Manders重叠系数（M1）量化SgII与突触核蛋白的共定位程度。wt-synuclein与线粒体蛋白TOM20共定位的程度以绿色显示。n=wt为7个细胞，SYN为5个细胞，TKO为6个细胞，TOM20为3个细胞（c）位于细胞内0.5–1.0μm深处的切片的类似共定位测量表明，突触核蛋白在分泌囊泡中的定位并不局限于对接池；n=3个单元。中的值b条和c（c）表示平均值±SEM
融合孔扩张的作用在其他突触核蛋白亚型中是保守的，但被帕金森病相关突变选择性抑制
α-突触核蛋白的N末端包含7个11个氨基酸重复序列，在与含有酸性磷脂头部基团的膜的相互作用中形成两亲性α-螺旋16除了膜结合外，重复序列还可能有助于功能效应，例如在融合孔上。由于三种突触核蛋白亚型在重复序列中表现出较强的序列保守性，并在更亲水的C末端发散，我们通过检测β-和γ-突触核素的作用来测试N末端的作用。将BDNF-荧光素、人β-和γ-突触核蛋白导入野生型小鼠嗜铬细胞中都可以减少细胞外事件的数量()，类似于α-突触核蛋白在嗜铬细胞中的作用以及多个突触核素亚型对突触小泡胞吐的影响11在剩下的事件中，β-和γ-突触核蛋白也会加速肽释放()，同样类似于α-突触核蛋白。作为唯一的保守结构域，N末端重复序列似乎对事件数量和动力学的影响都负有责任。
融合孔扩张是突触核蛋白的一种保守功能，被PD-相关点突变破坏用编码BDNF-pHfluorin的慢病毒和突变的人类α-突触核蛋白（A30P，A53T）、人类β-突触核蛋白（β-syn）、人类γ-突触细胞核蛋白（γ-syn。（a）与对照组相比，突变α-、β-或γ-突触核蛋白的过度表达均导致45 mM K去极化50 s以上诱发的细胞外事件数量减少+（**，通过Tukey事后检验的单向方差分析，p=0.0046；F（4,60）=4.027）。con，n=17个细胞；A30P，n=14个电池；A53T，n=10个电池；β-syn，n=11个细胞；γ-syn，n=13个来自3种独立培养物的细胞（b）β-和γ-突触核蛋白都能加速单个BDNF-pH氟释放事件的动力学。然而，这两个PD相关突变体并不影响释放动力学。累积频率分布包括衰减至基线的所有BDNF-pH氟化物事件的衰减常数。β-或γ-但非突变α-突触核蛋白的表达，将衰变常数相对于对照组的值变短（con对β-syn和con对γ-syn的Kolgomorov-Smirnov检验p<0.0001）。插图显示了衰变常数的10-90百分位方框和胡须图（平均值表示为“+”）。****，经Kruskal-Wallis单因素方差分析和Dunn事后检验（H=76.76），p<0.0001，con与β-syn和con与γ-syn；n=对照组610例，A30P组296例，A53T组172例，β-synuclein组210例，γ-synuclean组265例
（c、d）对感染空载体或编码A30P或A53T人α-突触核蛋白慢病毒的野生型小鼠的嗜铬细胞进行α-突触核蛋白（H3C，绿色）和SgII（红色）免疫染色，并通过TIRF显微镜观察（c）.尺寸棒，2.5μm。（d）使用Manders系数评估SgII与突触核蛋白的共定位程度。n.s.，不显著（单向方差分析p=0.6147；F（4,21）=0.6781）；n=3个电池用于TKO，7个用于控制，5个用于A30P，6个用于A53T，4个用于TKO-A30P，4个用来TKO-A53T（e）用syn-1抗体（左）和人α-、β-和γ-突触核蛋白（右）免疫荧光检测野生型和突变型人α-突触核苷的表达。n=6个细胞用于对照，8个用于A30P，7个用于使用syn-1抗体的A53T，7个用于对照，7个用于β-突触核蛋白，7个用于使用泛突触核蛋白抗体的γ-突触核蛋白
在之前的工作中，我们发现与PD相关的突变不会损害α-突触核蛋白抑制调节性胞吐的能力10,11A30P突变体对突触小泡的影响较小，因为它不集中于突触前突起46，但A53T突变体的行为与野生型非常相似。在嗜铬细胞中，这两种突变体都降低了细胞外事件的频率()可能是因为细胞的小尺寸消除了在远距离过程中积累的需要10因此，我们预计突变对突触核蛋白扩张融合孔的影响同样很小。然而，与PD相关的突变都发生在N末端的一个限制区域内，在第二个重复序列（A30P）的末端和第四个重复序列的末端（E46K、H50Q、G51D、A53T）2–7，表示对特定功能的干扰。值得注意的是，我们观察到A30P和A53Tα-突触核蛋白都不能加速肽释放(). 这尤其令人惊讶，因为野生型啮齿动物α-突触核蛋白基因在该位置含有致病性苏氨酸残基。因此，物种之间的其他序列差异必须解释该残基的致病性。与机制无关，PD相关突变影响突触核蛋白的一种功能（孔隙扩张），但不影响另一种功能（抑制胞吐）。
抑制胞吐的保留能力表明，PD相关突变体通常定位于LDCV。事实上，使用H3C抗体的免疫荧光显示，两个突变体与SgII在TIRF显微镜下的共定位未受影响(). 由于该抗体不能区分内源性和引入的突触核蛋白，我们还检测了突触核TKO小鼠嗜铬细胞中的突变体，再次观察到与SgII共定位时与内源性突触核素没有差异(和补充图15).
讨论
结果表明，突触核蛋白影响细胞外融合孔的行为。过度表达会加速释放事件，缩短荧光达到峰值的时间（孔隙扩张），加快荧光衰减（肽释放），并防止孔隙闭合。突触核蛋白的丢失会产生相反的影响，增加荧光峰值的时间，延长衰减时间，增加孔隙闭合的可能性。因此，过度表达和内源性突触核蛋白都促进融合孔的扩张。在某种程度上，对孔隙闭合的影响仅次于未释放货物检测的变化，但突触核蛋白似乎也能阻止持续性事件的闭合。然而，对孔开放的影响表明，突触核蛋白在胞吐早期起作用。
融合孔的变化为文献中报道的突触核蛋白对递质释放的不一致影响提供了解释。融合孔扩张预计会限制神经调节剂（如单胺类和肽类）的释放，这些调节剂缓慢地从管腔基质中分离出来，而不是像谷氨酸这样通过小孔快速逃逸的经典递质。的确，突触核蛋白的过度表达和缺失都会影响多巴胺的释放10,15相反，突触核蛋白的丢失对谷氨酸释放几乎没有影响13,14尽管存在这种明显的差异，但我们预计对突触核蛋白结合的任何囊泡的融合都有相同的影响。
我们还为内源性和过度表达的突触核蛋白与细胞内神经分泌小泡的特异性关联提供了证据，表明其可能对融合孔产生直接影响。由于突触核蛋白在与质膜对接之前与LDCV结合，因此可能在融合之前发挥作用，从而影响其性质。事实上，以前的研究表明，突触核蛋白增加了SNARE复合物的数量14提示了本文报道的突触核蛋白作用的一种机制。增加SNARE复合物的形成可能会增加驱动融合孔扩张的力，从而促进货物释放47然而，突触核蛋白的过度表达也抑制了突触小泡胞吐的程度11，这里的结果证实了这种影响延伸到LDCV10很难将观察到的释放抑制与突触核蛋白作为SNARE复合物的伴侣的作用相协调14的确，突触核蛋白抑制膜的融合在体外以及体内通过直接作用于脂质双层22,48–50.
或者，突触核蛋白可以通过抑制胞吐来促进SNARE复合物的积累，从而阻止融合囊泡上存在的复合物的分解。在任何一种情况下，突触核蛋白似乎都有双重作用。生理上，突触核蛋白促进融合孔的扩张，这是内源性和过度表达的蛋白质共同的一种剂量依赖性效应。另一方面，抑制胞吐可能仅限于synuclein过度表达13,15表明其具有病理作用。尽管如此，抑制胞吐似乎具有剂量依赖性11与熔孔动力学的影响非常相似。
与PD相关的突变效应表明，突触核蛋白的两种活性，即促进孔扩张和抑制胞吐，是可区分的。A30P和A53T突变不会削弱同核蛋白过度表达对胞吐的抑制作用。然而，它们都消除了联核蛋白对融合孔扩张的影响。由于突触核蛋白的丢失影响融合孔的扩张，但不影响细胞外事件的数量，因此PD突变似乎会导致蛋白质正常功能的选择性丧失。可能需要过度表达的突变体和野生型突触核蛋白保持抑制胞吐的能力才能产生退化。
方法
啮齿动物菌株
通过将α/β-突触核蛋白双KO小鼠（Jackson实验室，库存#006390）与γ-突触核蛋白KO系杂交产生突触核蛋白三敲除（TKO）小鼠51由L.Lustig慷慨提供。TKO小鼠被保留为纯合子，C57Bl/6动物被用作野生型（wt）对照，因为该菌株贡献了约90%的同核TKO系遗传背景（K.Nakamura，个人通信）。所有啮齿动物程序均按照UCSF IACUC制定的指南进行。
抗体
大鼠抗人α-突触核蛋白（15G7）单克隆抗体来自Alexis生化公司52BD Biosciences的鼠抗啮齿动物α-突触核蛋白（Syn-1）单克隆抗体53，Santa Cruz Biotechnology的山羊TOM20（C-20）多克隆抗体54，来自EMD Millipore的豚鼠囊泡谷氨酸转运体1（VGLUT1）多克隆抗体55以及来自Meridian Life Science的分泌颗粒蛋白II（K55101R）兔多克隆抗体56从Sigma到肌动蛋白（A2066）57J.George开发的针对突触核蛋白的H3C抗体是从发育研究杂交瘤库中获得的，该库由NIH NICHD创建，并由爱荷华大学爱荷华市生物系保存，IA 52242。Alexa Fluor 488偶联的抗鼠抗体、Alexa Fluor 488交联的抗小鼠抗体、Alexa Fluor594交联的抗山羊抗体和Alexa Floor 594偶联的抗兔抗体均来自Thermo Fisher Scientific。与Cy5结合的抗鼠抗体和与Cy3结合的抗豚鼠抗体均来自Jackson ImmunoResearch。从Rockland Immunochemicals获得了与IRDye800偶联的抗鼠抗体和与IRDy680偶联的抗兔抗体。
嗜铬细胞培养
如前所述分离肾上腺嗜铬细胞58简单地说，从4-6周大的小鼠身上切下整个肾上腺，放在冰冷的Ca中++-，镁++-补充青霉素和链霉素（pen/strep）的游离（CMF）Hank平衡盐溶液（HBSS）。分离肾上腺髓质并在含有I型胶原酶（2.6 mg/ml，沃辛顿实验室）、BSA（3 mg/ml）、DNase I（0.15 mg/ml，西格玛）和透明质酸酶I（0.15mg/ml，西格马）的同一溶液中在37°C下消化30分钟，在热混合器（Eppendorf）中以800 rpm摇晃。消化的髓质完全悬浮，酶反应用10体积的冷CMF-HBSS淬灭。细胞在300克在4°C下保持10分钟，并在补充有10%FBS（Hyclone）和pen/strep的Dulbecco改良Eagle's培养基（DME-H21）中重新悬浮。细胞悬液在玻璃室（LabTek）上滴镀，涂有聚-L-赖氨酸，并允许在37°C/5%CO下粘附45分钟2然后添加预先加热的慢病毒上清液。连夜进行慢病毒转导，第二天早上更换培养基。
神经元培养和转染
从P0 Sprague-Dawley大鼠幼崽制备原代神经元培养物，并通过电穿孔转染，如前所述（Amaxa）11简单地说，含有NPY-pHfluorin或BDNF-pHfluoin的0.8μg pCAGGS载体与0.1μg突触素-mCherry和0.1μg pCAGGS或0.1μg p CAGGS-α-突触素/4×10共转染5细胞。培养物保存在含有21 mM葡萄糖、5%FBS、2%B27（Gibco）、1%谷氨酰胺（Gibco）和Mito+血清延长剂（BD Biosciences）的最低必需培养基（MEM）中。在第3天添加5-FU和尿苷在体外（DIV3）抑制胶质细胞生长。
从P0只幼鼠中制备小鼠原代神经元培养物，按照上述方法进行电穿孔和电镀，但在研磨前使用半胱氨酸激活的木瓜蛋白酶（沃辛顿）分离海马。在DIV1上，75%的MEM培养基被补充有2%B27和1.5%谷氨酰胺的神经基底培养基（Gibco）取代。在DIV8上添加5-FU和尿苷以抑制胶质细胞生长。
慢病毒的制备
将低代HEK293T细胞接种到6孔板上，并使用编码感兴趣基因的第三代慢病毒载体pJHUMCS以及辅助质粒pREV、pVSVG和pPRE的混合物，使用Fugene HD转染试剂（Promega）和制造商的说明转染过夜。第二天早上将细胞转换到嗜铬细胞培养基中，24小时后收集培养基并在1000克病毒上清液立即使用或等分并在−80°C下冷冻。
免疫荧光
通过向培养基中添加等量的4%甲醛（CMF-PBS中）并在室温下培养20分钟来固定嗜铬细胞。细胞在含有2%牛血清白蛋白、1%鱼皮明胶和0.02%皂苷（封闭缓冲液）的CMF-PBS中被封闭和渗透。一级抗体在封闭缓冲液中稀释为1:13（H3C）、1:500（15G7，Syn-1，C-20）或1:1000（K55101R），并在4°C下培养过夜。荧光染料结合的二级抗体在阻断缓冲液中也稀释为1:500。对于表观荧光，使用带有63×1.25 N.A.油物镜（蔡司）和Coolsnap HQ CCD相机（光度计）的垂直荧光显微镜（Axioskop；Zeiss）观察细胞染色。使用Metamorph软件获取图像，并在ImageJ（NIH）中进行分析。
培养的海马神经元在含4%甲醛和4%蔗糖的PBS中室温固定20分钟，在含5%小牛血清和0.05%皂苷的PBS内封闭和渗透。将固定神经元与单克隆H3C抗突触核蛋白（1:13）和豚鼠抗VGLUT1抗体（1:5000）在同一溶液中孵育，然后使用Cy3-或Cy5-结合抗体进行二次检测。荧光细胞染色的图像是通过使用蔡司LSM510显微镜的共焦激光扫描显微镜获得的。
结构照明显微镜（SIM）
将分离的嗜铬细胞镀在高精度盖玻片（蔡司）上，3-5天后固定，并如上所述进行免疫染色。样品在配备100×1.49 NA Apo TIRF物镜和Andor Xyla sCMOS相机的尼康Ti显微镜上成像。结构化照明图像是以步长为120 nm的15层z堆栈的形式获取的，并使用配备NIS-a N-SIM分析模块的尼康元素软件进行重建。用ImageJ中的Coloc2模块量化Colocalization。
全内反射荧光显微镜
将野生型（wt）或同核型TKO嗜铬细胞涂布在涂有聚-L-赖氨酸的玻片（Lab-Tek）上，立即用慢病毒转导，3-5天后成像为活细胞。使用配备50 mW Agilent MLC400B 488 nm激光器、四路N-STORM TIRF滤波器组（405/488/561/647）、525/50发射滤波器、100×Plan Apo 1.49 N.A.油物镜（Nikon）和Andor iXon Ultra 897高速EMCCD相机（牛津仪器）的倒置TIRF显微镜（Ti-E；Nikon）在20 Hz下采集图像。细胞在含有（mM）140 NaCl、10 HEPES-NaOH、pH 7.4、10葡萄糖、4.5 KCl、5 CaCl的改良Tyrode溶液中成像2，1氯化镁2)以及通过添加等量的高KCl溶液（与NaCl渗透平衡）刺激胞吐，以获得最终的K+浓度为45 mM。在ImageJ软件中，通过在事件中心放置5×5像素感兴趣区域（ROI），以及使用时间序列分析仪插件提取的平均强度剖面，手动识别单个细胞外事件。一种自动算法准确地识别出了相同的事件以及其他一些事件，这些事件没有显著高于背景（>20%），或者反映了具有未受抑制的残余荧光的囊泡的流动性，因此被排除在分析之外（数据未显示）。前20帧的平均ROI强度用于定义事件开始，并减去背景。事件衰减的开始被定义为第一帧下降到既定较高水平以下。使用Graphpad Prism 6.05版进行曲线拟合、事件参数分析和所有后续统计分析。图中所示的代表性痕迹和归一化为峰值ΔF。
为了量化荧光衰减速率（完全衰减事件），衰减符合单个指数。为了量化衰减的潜伏期，将记录道拟合到一个平台，然后是单指数衰减和重叠事件，或者从分析中排除任何短于实验时间分辨率（1帧，50 ms）的潜伏期。为了确定再酸化是否有助于BDNF-pH荧光的衰减，用Bafilmycin A1（0.6μM，EMD Millipore）在成像缓冲液中培养嗜铬细胞2分钟，并用高K刺激+成像缓冲液中也含有0.6μM巴非霉素。
为了评估融合孔的状态，在高K刺激30 s后，使用pH 5.5的成像缓冲液+为了确定防止猝灭的事件比例，使用5×5像素ROI选择在添加低pH溶液之前立即可见的所有稳定的细胞外事件，并减去背景。由于VMAT2-pHfluorin向质膜扩散会影响局部背景荧光，因此需要将其分类为受保护的（i）事件发生前荧光强度高于局部背景，（ii）尽管存在酸性激发，但仍具有点状荧光。
在双色TIRF成像实验中，用编码BDNF-pHfluorin的慢病毒转导的肾上腺嗜铬细胞在含有20μM FFN206的基础成像缓冲液中培养33在5%CO中保持1小时2在37°C下，洗涤两次，刺激并立即成像，如上所述。通过在触发采集模式下用405nm和488nm激光线交替激发30ms来采集双色电影（NIS Elements软件，Nikon）。
为了比较表达α-突触核蛋白点突变体以及β-和γ-亚型的细胞中H3C与SgII的共定位程度，使用100×Plan Apo 1.49 N.a.油物镜（Nikon）和Andor iXon Ultra 897高速EMCCD相机（牛津仪器）在倒置TIRF显微镜（Ti-E；Nikon）上采集图像。然后使用Coloc2插件（ImageJ）确定与H3C结合的SgII阳性穿孔的Manders重叠系数。
Fluo-5F成像
使用无水二甲基亚砜将Fluo-5F AM重新配制成3 mM的储备液。在成像之前，将储备液在成像缓冲液中稀释至最终浓度6μM。用编码空载体或人类α-突触核蛋白的慢病毒转导的野生型和TKO嗜铬细胞在室温下在Fluo-5F中培养15分钟，并在成像前用成像缓冲液冲洗三次。在高钾条件下去极化期间，以20 Hz的采集率通过Fluo-5F荧光成像评估钙内流+使用上述相同的激光和滤光片设置进行pHfluorin成像。F类0数值是通过追踪整个细胞足迹的轮廓并测量刺激前20帧内的平均像素强度来确定的。整个足迹的最大平均强度通常在刺激的前1-2 s内达到，用于计算峰值ΔF/F0.
活细胞成像：神经元
如前所述，在室温（24°C）下于14-20 DIV对转基因神经元进行成像11,59.在标准Tyrode溶液（mM，119 NaCl，2.5 KCl，2 MgCl）中对神经元进行成像2，2氯化钙2，30葡萄糖和25 HEPES，pH 7.4）。在低pH值的Tyrode（pH 5.5和6.4）中，HEPES被替换为25 mM MES。所有缓冲液均含有谷氨酸受体拮抗剂6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮（CNQX，10μM）和D，L-2-氨基-5-磷酸（APV，50μM）。为了诱导LDCV胞吐，在50 Hz下刺激细胞5 s。黄道pHfluorin在470/40 nm激发和525/50 nm发射下成像，mCherry在572/35 nm激发和632/60 nm发射下图像。使用QuantEM:512SC EMCCD相机（Photometrics）和63×1.2 N.a.水物镜以流模式（10 Hz）采集图像。图中所示的代表性痕迹,和归一化为峰值ΔF。
为了通过在低pH下熄灭BDNF-pH荧光来评估融合孔，在50 Hz刺激后立即施加pH 5.5的Tyrode溶液5 s脉冲，然后在标准Tyrode's溶液中进行冲洗。在从大鼠（对照组或+α-突触核蛋白过度表达）或小鼠（wt或突触核TKO）神经元培养物记录的图像时间序列（10 Hz采集频率）中手动识别胞外事件。对表现出快速和单步pHfluorin抑制（胞吐）的固定事件进行评分，以评估其对酸性Tyrode溶液（“猝灭”）或（“未猝灭””）猝灭的敏感性。在应用低氢缓冲液之前衰减的荧光事件被评分为“已经衰减”。
为了进一步探测LDCV融合孔的状态，如前所述，将表达BDNF pH氟的小鼠神经元暴露于快速pH振荡中60在含有标准Tyrode溶液（pH 7.4）的腔室中对神经元进行成像，并在50 Hz下刺激5 s。高pH值（7.8）和低pH值（6.4）的Tyrode's溶液通过θ吸管（尖端直径约100μm）每隔375 ms交替传送至成像场，并在13.3 Hz下连续采集图像。为了减少噪声，对图像堆栈应用了卡尔曼滤波器（图像J）。在pH 5.5下猝灭的实验中，手动确定BDNF-pHfluorin的细胞外事件，并使用ImageJ的时间序列分析仪插件提取荧光，使用4×4像素感兴趣区域（ROI）。pH诱导的pHfluorin荧光振荡突然停止的痕迹被记为“孔隙闭合”事件，并确定了从事件开始到振荡终止的时间。在整个成像过程中出现振荡的事件被评分为“无闭合”。衰减到基线但在其整个生命周期中显示出荧光振荡的事件被评分为“开放直至衰减”。当需要进行评分和定量时，减去ROI附近区域的背景荧光。共对野生型（7个盖玻片）和同核蛋白TKO（9个盖玻片）的100个事件进行了评分。各组通过卡方检验进行比较，闭合时间数据显示为累积频率直方图。
为了分析NPY-pHfluorin动力学，手动识别在10 Hz下成像的BDNF-pHfluoin的细胞外事件，并使用4×4像素ROI提取荧光。对于每一个事件，动力学都适合于平稳期（x秒）和单指数衰减（F=IF（x<x0，F0，高原+F跨度*e（电子）-K*（x-x0）))通过非线性回归（GraphPad Prism）。单个事件的衰变延迟时间（x）和衰变时间常数（τ）值通过3个独立实验进行汇总（每个条件下总计10-11张盖玻片）。未衰减的事件被评为“无衰减”，并纳入分析。为了抑制再酸化，在成像前立即向神经元中添加巴非霉素（0.6μM）。包括非参数“无衰减”事件在内的数据显示为累积概率直方图，并由Kolmogorov-Smirnov对各组进行比较。Mann-Whitney比较了衰减事件的延迟和τ。对于Bafilomycin A1实验，根据衰变动力学（τ<5s，τ>5s或无衰变）对事件进行分组，并通过卡方检验进行比较。
定量免疫印迹
通过电穿孔法将pCAGGS或pCAGGGS-α-突触核蛋白、BDNF-pHfluorin和突触素-mCherry（如上所述）转染原代大鼠海马神经元。培养14天后，细胞在含有1%Triton X-100、1mM EGTA、1mM MgCl的PBS中溶解2和蛋白酶抑制剂（Roche Complete）。裂解液于1300年沉淀克去除细胞核，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离6μg蛋白。转移到硝化纤维素后，对膜进行免疫印迹，以检测α-突触核蛋白（Syn-1；1:500）和肌动蛋白（A2066；1:500。免疫反应性通过荧光扫描仪（LI-COR Biosciences）检测并在ImageJ中量化。
统计分析
没有使用统计方法预先确定样本量，但我们的样本量与之前出版物中报告的样本量相似11,29,31每个实验至少使用两种独立的培养物。使用Kolmogorov-Smirnov检验和正态分布数据对累积频率分布进行比较，使用配对数据的双尾t检验和单向方差分析，使用Tukey的事后检验进行多重比较。对于非正态分布的数据，使用Mann-Whitney U检验进行配对比较，使用Kruskal-Wallis单向方差分析和Dunn的事后比较进行多重比较。在方框图和胡须图中，方框表示中间的两个四分位数，胡须表示事件的10%和90%，线条表示中间值和+平均值。事件比例通过卡方检验进行比较。实验的组织不是随机的。除了神经元的NPY-pHfluorin数据外，数据收集和分析不是针对实验条件进行的，其中>80%的数据是针对基因型进行的。
