Alpha-synuclein promotes SNARE-complex assembly in vivo and in vitro

doi:10.1126/science.1195227

.2010年9月24日；329(5999):1663-7.

doi:10.1126/science.1195227。 Epub 2010年8月26日。

Alpha-synuclein在体内外促进SNARE-复合物组装

杰奎琳·伯雷¹, 曼鲁·夏马, 西奥多罗斯·塞特塞尼斯, 弗拉基米尔·布赫曼, Mark R Etherton公司, 托马斯·苏多夫

附属机构

采购管理信息： 20798282
PMCID公司： PMC3235365型
内政部： 10.1126/科学.1195227

Alpha-synuclein在体内外促进SNARE-复合物组装

杰奎琳·伯雷等。科学类. 2010.

.2010年9月24日；329(5999):1663-7.

doi:10.1126/science.1195227。 Epub 2010年8月26日。

作者

杰奎琳·伯雷¹, 曼鲁·夏马, 西奥多罗斯·塞特塞尼斯, 弗拉基米尔·布赫曼, Mark R Etherton公司, 托马斯·苏多夫

附属

¹斯坦福大学分子和细胞生理学系和霍华德·休斯医学院，地址：1050 Arastradero Road，Palo Alto，CA 94304-5543，USA。

采购管理信息： 20798282
PMCID公司： PMC3235365型
内政部： 10.1126/科学.1195227

摘要

突触前神经末梢反复释放神经递质，通常频率很高，与神经元细胞体相对隔离。重复释放需要可溶N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）复合物的组装和拆卸周期，并持续产生反应性SNARE-蛋白中间产物。尽管许多形式的神经退行性变都是通过突触前启动的，但致病机制尚不清楚，与神经退行变性相关的突触前蛋白（如α-突触核蛋白）的功能尚不清楚。在这里，我们表明维持持续的突触前SNARE复合物组装需要由突触核蛋白介导的非经典伴侣活性。具体而言，α-突触核蛋白直接与SNARE-protein synaptobevin-2/囊泡相关膜蛋白2（VAMP2）结合，促进SNARE-complex组装。此外，缺乏突触核蛋白的三敲除小鼠出现了年龄依赖性神经损伤，SNARE复合物组装减少，并过早死亡。因此，突触前末端的突触核蛋白在衰老过程中可能起到维持正常SNARE-复合体组装的作用。

PubMed免责声明

数字

**图1。在SNARE复合物中，α-突触核蛋白直接与synaptobevin-2/VAMP2结合**
(**A-D公司**)α-突触核蛋白与来自野生型（WT）和CSPαKO（CSP）的SNAP-25抗体免疫沉淀的SNARE-复合物相关^-/-)含有或缺乏转基因α-突触核蛋白（tSyn）的小鼠大脑。面板显示了代表性免疫印迹（A；-Ab=来自WT大脑的不含初级抗体的对照IP；Synt-1=syntaxin-1；Syb2=syntobevin-2；α-Syn=α-synuclein），以及输入水平（B）、免疫沉淀SNAP-25（C）和共免疫沉淀蛋白（D）的定量，通过使用¹²⁵I标记的二级抗体（平均值±SEM，*p<0.05；**p<0.01；**p<0.001，每个学生的t检验；n=3-5）。(E类)α-突触核蛋白与转染HEK293T细胞中重建的SNARE-复合物的共免疫沉淀。用α-突触核蛋白或SNAP-25抗体免疫沉淀细胞裂解物，并用免疫印迹法进行分析。(F类&**G公司**)α-突触核蛋白C端直接与突触蛋白2 N端结合。α-突触核蛋白从共表达全长（α-Syn）或C末端截短的α-Synuclein（α-Sun）的HEK293T细胞中免疫沉淀^1-95)带有全长（Syb2）或N末端截短的synaptobrevin-2^29-116). 通过免疫印迹法分析免疫沉淀物中的α-synuclein和synaptobrevin-2（见图S1和S2）。(**H（H）**)突触小泡（SV）上的α-synuclein/synaptobrevin-2复合物示意图。(**I-K公司**)无论是CSPαKO还是转基因α-突触核蛋白过表达都不能检测到突触强度的改变。数据显示了急性海马切片中输入输出测量（I和J）或成对脉冲促进实验（K）的细胞外记录的样本轨迹（I和K顶部）和汇总图（J和K底部；平均值±SEM）（另见图S3）。

**图2。α-突触核蛋白直接催化SNARE-复合物组装**
(**A-C公司**)α-突触核蛋白以剂量依赖性方式促进SNARE-复合物组装。HEK293T细胞联合转染恒定量的syntaxin-1（Synt-1）、syntobevin-2（Syb2）和SNAP-25，以及增加量的α-synuclein（α-Syn）。细胞裂解物在没有（A）和煮沸的情况下进行免疫印迹（图S4）；SNARE复合物和α-突触核蛋白被定量（B），并绘制为彼此的函数（C）。(**D&E公司**)全长而非C末端截短的α-突触核蛋白促进SNARE复合物组装。SNARE复合物与来自HEK293T细胞的SNAP-25（左）或synaptobrevin-2（右）抗体免疫沉淀，这些细胞与翡翠（对照）、全长α-突触核蛋白（α-Syn）或C末端截短的α-突触核蛋白（^1-95)，并通过免疫印迹分析（D，代表性印迹；E，SNARE-复合物定量）。(F类)纯化重组α-突触核蛋白（α-Syn）、H A-标记突触蛋白-2（HA-Syb2）、SNAP-25、C-末端截短突触蛋白-1（Synt-1）的考马斯染色SDS凝胶^1-264)或synaptobrevin-2（Syb2^1-96)和全长HA-标记的syntaxin-1（HA-Synt-1）。(**G公司**)体外SNARE-复合物组装试验。含有或缺乏重组联会蛋白-2的脂质体与SNAP-25和C-末端截短的联会蛋白-1混合，有或没有α-联核蛋白，并通过密度梯度离心漂浮。SNARE-复合物组装通过SNAP-25和syntaxin-1与脂质体在前两个组分中的共浮选进行测量。(**H（H）**&我)SNARE和α-突触核蛋白在脂质体浮选梯度中的分布，如代表性免疫印迹（H）和脂质体结合蛋白的定量（I）所示。注意，虽然α-突触核蛋白（α-Syn）和突触蛋白-2直接与脂质体结合，但SNAP-25和突触结合蛋白-1（Synt-1）仅通过SNARE复合物的形成与脂质体相结合。数据为平均值±SEM（通过Student t检验，*p<0.05；**p<0.01；**p<0.001；n=3-8）。

**图3。αβγ-Synuclein TKO小鼠的存活率受损，SNARE-复合物组装减少**
(A类&B类)αβγ-突触核蛋白TKO小鼠的神经损伤（P300）。数据显示：（A）从倒钢丝网上掉落的延迟时间（握网时间；WT，n=6；TKO，n=7），前肢握力（使用数字握力仪测量；WT（n=9；TKOs，n=11），以及波束行走过程中的脚滑（WT，n=9；TKO，n=11）和（B）从加速旋转木马上掉下的延迟时间。(C类)WT和TKO小鼠的后肢扣肢与年龄的关系（左，代表性图像；右，扣肢发生率；WT，n=41；TKO，n=57）。(D类)WT和TKO小鼠的年龄依赖性死亡率（WT，n=41；TKO，n=57）。(E类)TKO小鼠蛋白质水平的年龄依赖性变化（左，代表性斑点；右，定量）。(F类)在P40（顶部）和P200（底部），通过共同免疫沉淀WT和TKO小鼠脑裂解物中的SNARE来分析SNARE复合物组装。左侧面板显示代表性斑点，右侧面板显示来自多个独立实验的定量结果（n=3-5；Syb2=syntopobrevin-2；Synt-1=syntaxin-1）。更多数据见图S6-S9。数据为平均值±SEMs，*p<0.05**p<0.01***通过Student t检验（A、E和F）、双向方差分析（B）或Mantel-Cox检验（C），p＜0.001。

**图4。α-突触核蛋白在突触活动中促进SNARE-复合物组装**
(A类)在DIV4感染的αβγ-synuclein TKO神经元中，随着表达α-synuclean的慢病毒数量的增加，α-syn核心蛋白水平与SNARE-复合物组装之间的线性关系，并通过DIV17（n=3-6）未煮沸样品的免疫印迹进行分析。(B类)全长（α-Syn）但未截短的α-synuclein（α-Sun^1-95)通过syntaxin-1（Synt-1）和SNAP-25与syntopobrevin-2（Syb2；对照=普通病毒；左侧为代表性斑点；右侧为定量；n=3-6）的共同免疫沉淀，增强TKO神经元中SNARE-复合物的组装。(C类)培养WT和TKO神经元中SNARE-复合物组装的活性依赖性。神经元在DIV10培养基、0.5μM河豚毒素（TTX）或4 mM Ca中培养36小时²⁺（钙²⁺). SNARE-复合物组装通过SNARE-proteins与SNAP-25和synaptobrevin-2的共同免疫沉淀来测量。代表性的斑点显示在顶部（Pre-Imm=免疫前控制），以及底部多个独立实验的定量（n=3-6）。(D类)WT和TKO神经元以及感染表达全长（α-Syn）或C末端截短的α-synuclein（α-Sn-^1-95). 神经元在对照培养基、0.5μM TTX或4 mM Ca2+中孵育指定时间，并通过免疫印迹法测量未包装样品（n=3）中SNAP-25的SNARE-复合物组装。更多数据见图S10和S11。数据为平均值±SEM，*p<0.05**p<0.01***通过Student t检验（A-C）或单因素方差分析（D），p<0.001。

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