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致癌物。2016年6月9日；35(23): 3004–3015.
2015年10月5日在线发布。 数字对象标识：2018年10月10日/2015.363年1月1日
预防性维修识别码：项目经理4705441
EMSID:EMS64868系列
PMID：26434594

PAT4水平控制高尔基体雷帕霉素耐药mTORC1的氨基酸敏感性并影响结直肠癌的临床结局

S-J风机，1中，三 C斯奈尔，2,三 H特雷，2 J-L李，2 R麦考密克，2 S M W佩雷拉，1 S海伯林，1 S卡齐，1 阿扎德，1 C威尔逊，1 A L哈里斯，2和D C I戈伯丹1中，*
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摘要

肿瘤细胞可以使用一些策略，使其能够抵抗营养剥夺，从而战胜邻居。雷帕霉素复合物1（mTORC1）的氨基酸依赖性机制靶点是细胞对饥饿和其他应激反应的关键集合体。溶质结合载体36（SLC36）和SLC38家族中的氨基酸转运蛋白促进晚期内体和溶酶体上mTORC1的活化。在这里，我们分析了SLC36家族成员SLC36A4的功能，也称为第页旋转辅助的一氨基酸t吨转运蛋白4（PAT4）在结直肠癌中的表达。我们的研究表明，独立于其他主要病理因素，PAT4的高表达与结直肠癌手术后无复发生存率降低相关。与此一致，PAT4促进HCT116人结直肠癌细胞在培养物中的增殖和异种移植模型中的肿瘤生长。HCT116细胞中的诱导性敲除表明，PAT4调节mTORC1的一种形式，具有两个不同的性质：第一，它优先靶向真核翻译起始因子4E-结合蛋白1（4E-BP1），第二，它对雷帕霉素治疗有抵抗力。此外，在HCT116细胞中，两种非必需氨基酸谷氨酰胺和丝氨酸通常被肿瘤细胞迅速代谢，以PAT4依赖的方式调节雷帕霉素耐药mTORC1。过度表达的PAT4也能促进人类胚胎肾293细胞对雷帕霉素的耐药性。PAT4在多种细胞类型中主要与高尔基体有关就地邻近连接分析表明，PAT4与高尔基体上的mTORC1及其调节因子Rab1A相互作用。这些发现以及其他研究表明，差异定位的细胞内氨基酸转运蛋白有助于激活mTORC1的替代形式。此外，我们的数据预测，PAT4高表达的结直肠癌细胞对丝氨酸和谷氨酰胺的耗竭具有更强的抵抗力，使其能够存活并生长出邻近的正常细胞和致瘤细胞，并可能为药物干预提供新的途径。

介绍

在肿瘤生长过程中，肿瘤细胞的适应是由缺氧和饥饿等不利的微环境条件驱动的。1雷帕霉素复合物1（mTORC1）的机械靶点通过磷脂酰肌醇3-激酶对局部营养状态和生长因子信号作出反应，以调节蛋白质合成和细胞内环境平衡，从而调节癌细胞的生长、代谢和转移。2，三，4然而，使用变构mTOR抑制剂雷帕霉素或其类似物阻止肿瘤生长的尝试却收效甚微。5尽管这些药物强烈降低两个特性良好的mTORC1靶点之一核糖体蛋白p70-S6激酶1（S6K1）的信号传导，但它们对另一个真核生物翻译起始因子4E-结合蛋白1（4E-BP1）的作用往往更为有限，后者是真核生物起始因子4E（eIF4E）的负调控因子6，7与转移性生长有关。8，9这种耐药性有时可以通过使用三磷酸腺苷（ATP）竞争性mTOR抑制剂来规避，5，6，7也阻断了其他mTOR激酶复合物mTORC2。然而，mTOR结构如何变化10或mTOR调节剂调节雷帕霉素敏感性仍然很有意思。

的成员第页旋转辅助的一氨基酸t吨转运蛋白（PAT）或溶质结合载体36（SLC36）家族11被鉴定为通过体内苍蝇基因过度表达筛查。12，13通过对两个普遍转录的人类的特征分析，这些效应被证明是保守的拍打第页，PAT1型(SLC36A1型)和第四阶段(SLC36A4型)。14原型PAT家族成员PAT1是一种溶酶体氨基酸转运蛋白（AAT）。15，16在快速生长的细胞中，它位于富含营养物质的晚期内体和溶酶体（LEL）室的表面，13其中mTOR在氨基酸刺激下积累。mTOR的招募需要组装一个多蛋白复合物，包括猛禽、Ras相关Rag GTPases的异二聚体对、五聚体Ragulator和液泡H+-隔间表面的ATP酶质子泵（在Bar-Peled和Sabatini中审查2和马利克等。2，三). PAT1还与该复合体相互作用，促进LEL上的mTOR定位和随后的mTORC1信号。PAT的氨基酸感应可能涉及通过所谓的“受体”机制进行转运或信号传递。4，13，17

最近的研究在相关的SLC38家族中发现了一种AAT，即SLC38A9，它也与mTORC1调节机制在LEL上相互作用，可能对精氨酸产生反应，18，19表明不同LEL定位的mTORC1调节性AAT可能感知不同的氨基酸。此外，鉴定Golgi-localised Rab1A等分子，20和ADP核糖基化因子Arf121和磷脂酶D22，23作为Rag非依赖性的调节因子，mTORC1激活表明其他氨基酸感应机制尚待发现。

这里我们研究PAT4在结直肠癌中的功能。结直肠癌通常对雷帕霉素耐药6并且经常转移，严重影响临床结果。24，25我们发现PAT4上调与癌症进展相关。通过使用诱导物第四阶段在HCT116结直肠癌细胞中shRNA敲除，我们发现PAT4对两种快速代谢的非必需氨基酸谷氨酰胺和丝氨酸产生反应，26，27促进雷帕霉素耐药、mTORC1介导的细胞增殖。此外，我们提供证据表明，PAT4与高尔基体上的Rab1A和mTORC1相互作用，表明PAT4在该区的氨基酸感应中起作用。

结果

新型PAT4单克隆抗体的验证

我们产生了针对PAT4的高度特异性小鼠单克隆抗体（抗体PAT4/9/H10）。用该抗体染色显示，PAT4定位于福尔马林固定、石蜡包埋的786-O肾癌细胞中的不对称核周区域，该细胞表达高PAT4水平，而在转染了第四阶段小干扰RNA(图1a和b). 60-75个频段 在细胞裂解物的western blot上观察到kDa分子量(图1c)并且在第四阶段击倒，确认抗体特异性。这个涂片分解成约30条带 用糖苷酶、肽-N-糖苷酶F（PNGase F）预处理裂解产物后的kDa小于预测值55 kDa分子量(图1d)。

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验证“内部”生成的抗PAT4单克隆抗体。(一和b条)用PAT4单克隆抗体（PAT4/9/H10）培养福尔马林固定、石蜡包埋的786-O细胞，并用3,3'-二氨基联苯胺（DAB）进行可视化。在用干扰控制siRNA处理的大多数细胞中，可见明显的核周染色区(一). 当第四阶段使用siRNA敲除转录本第四阶段（si435；海伯林等。;14 b条). (c（c）)细胞裂解物系列稀释液的Western blot分析（15、7.5和3.8 μg蛋白质），由携带IPTG诱导的shPAT4（43587；shPAT5）的786-O细胞池产生，用PAT4单克隆抗体Pat/9/H10进行检测。这显示了一组从60到75的波段 IPTG诱导的kDa强烈降低第四阶段击倒（+IPTG），表明它们是PAT4特有的。Western blot也用抗微管蛋白抗体作为负荷对照进行了检测。(d日)对786-O细胞和GFP-PAT4过度表达的HEK-293细胞系的细胞裂解产物进行Western blot，在电泳前用PNGase F处理以去除糖基。这将未经处理的细胞裂解物中的交叉反应分子分解成更为特异的条带，在约30和50时迁移 kDa分别小于预测分子量55 kDa（PAT4）和85 kDa（GFP-PAT4），其他跨膜蛋白也有报道。43

PAT4高表达与结直肠癌患者预后不良相关

为了检测PAT4在人类结直肠癌中的表达是否发生改变，我们对107例仅接受手术切除治疗的患者的原发肿瘤组织微阵列进行了染色。病理学家（CS）将细胞质染色的强度分为三类(图2a和b; 见材料和方法），均高于正常大肠上皮。统计分析表明，PAT4的高表达与标准临床或病理变量（包括肿瘤部位、肿瘤分期、淋巴结或远端转移、年龄、淋巴管、血管或神经侵袭、分化或性别）无关(补充表S1)。

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PAT4的高表达预示着结肠癌的无复发生存率较差。共有107例原发性结肠癌患者接受了PAT4在肿瘤中的表达评估，并根据PAT4的表达进行了分层。(一和b条)由免疫组织化学测定的低和高PAT4表达水平的代表性图像。用二氨基联苯胺进行棕色染色表明具有免疫反应性。(c（c）)Kaplan–Meier曲线比较高表达水平与低表达水平。P（P）-值是log-rank测试的结果（Mantel–Cox）。(d日)PAT4高表达和低表达患者的病例处理总结。中的比例尺(一)是50 微米。

在单变量分析中，PAT4水平较高(P（P）=0.01）以及高肿瘤分期(P（P）<0.01），肿瘤分期评分(P（P）<0.01），出现肠穿孔(P（P）=0.02），神经侵袭(P（P）<0.01），节点(P（P）<0.01）和同步转移(P（P）<0.01）与较短的无复发生存期显著相关(补充表S2). 与PAT4表达水平较低的癌症患者相比，PAT4高表达癌症患者的平均无复发生存期显著缩短(P（P）<0.01;图2c和d). 此外，较高的PAT4水平在多变量生存分析中具有统计学意义(P（P）<0.01;补充表S3). 多变量模型包括单变量分析中与复发显著相关的所有变量，除了总体分期外，因为这是根据肿瘤分期（T）、淋巴结转移（N）和远处转移（M）分期计算得出的。我们得出结论，PAT4水平升高与结直肠癌患者的预后较差有关。

PAT4调节HCT116细胞增殖

为了分析HCT116结直肠癌细胞中PAT4的功能，我们建立了稳定的转导细胞系，每个细胞系携带三种不同的慢病毒构建物中的一种，表达第四阶段异丙基β作用下的短发夹RNA（shRNA）-d日-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导控制。对于每种结构，代表许多单独转导事件的集合细胞减少了第四阶段转录水平，由定量实时PCR测定(补充图S1A). 两个shRNAs，49 384和49 387人被选为进一步研究对象。诱导一致强大第四阶段从另一shRNA转导中分离出敲除的单细胞克隆，分别命名为shPAT4（4.8）和shPAT5（7.1(补充图S1B)。体外将这些克隆与含有IPTG诱导的非靶向shRNA的HCT116细胞一起培养(shNT公司)该基因显示IPTG诱导特异性抑制shPAT4表达细胞的增殖(P（P）<0.05;图3a)对细胞死亡没有显著影响(补充表S4)。

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PAT4调节HCT116细胞的生长在体外和体内. (一)用靶向PAT4的两种独立IPTG诱导的shRNA结构之一，即shPAT4（4.8）和shPAT5（7.1），或IPTG引导的非靶向对照结构（shNT），在有无IPTG的情况下，对稳定转导的HCT116细胞克隆的增殖进行了测量(n个=3). (b条和c（c）)携带shNT转导细胞池的免疫缺陷小鼠中人HCT116肿瘤异种移植物的平均生长曲线（±s.e.m.）(b条)有（空白圆圈）或无（填充正方形）IPTG诱导，或shPAT4-转导的HCT116细胞(c（c）)有（空白方块，用红色勾勒）或无（填充方块）IPTG感应(n个=7). 中的数据(b条和c（c）)由未配对的双尾独立学生t吨-测试。(d日和e（电子）)七只动物在IPTG诱导和不诱导shNT-的情况下的Kaplan-Meier生存曲线(d日)和shPAT4-包含(e（电子）)HCT116肿瘤；log-rank（Mantel–Cox）测试：P（P）=0.019适用于(e（电子）). 对于shPAT4诱导的细胞，七只非诱导小鼠（填充方块）中除一只外，其余均需在36天内被杀死（中位数生存时间为36天），而七只诱导小鼠（空白方块，用红色勾勒）则从38天开始被杀，中位数存活时间为50天。细胞增殖实验重复三次*P（P）<0.05, **P（P）<0.01.

PAT4在异种移植模型中促进人类肿瘤生长

为了评估PAT4在肿瘤生长中的作用，将携带shPAT4（49 387），用于异种移植实验。我们推断第四阶段敲除这些细胞可能会更好地模拟表达不同PAT4水平的异质性肿瘤中发生的变化。IPTG对肿瘤生长的影响第四阶段在60天的时间里，对小鼠shPAT4 HCT116细胞的敲除进行了评估。在免疫缺陷小鼠的饮用水中提供IPTG以诱导shRNA表达。IPTG没有改变shNT细胞形成的肿瘤大小(图3b). 然而，与未诱导的shPAT4对照相比，IPTG诱导的shPAT4表达显著降低了肿瘤生长(图3c;P（P）<0.01). 此外，shPAT4诱导将小鼠的中位生存时间从36天延长至50天（比率：0.72；比率的95%置信区间：0.36–1.07；Gehan–Breslow–Wilcoxon试验，P（P）=0.008;图3d和e). 诱导第四阶段第二次实验中的击倒也显著降低了平均肿瘤体积(P（P）<0.05）和提高动物存活率(P（P）<0.05），证明PAT4促进HCT116肿瘤生长体内。

PAT4调节抗雷帕霉素的mTORC1

确定如何第四阶段敲除可能抑制肿瘤生长，我们分析了稳定转染HCT116克隆中携带诱导物的mTORC1信号第四阶段shRNA，shPAT4（4.8）和shPAT4（7.1），以及非靶向克隆shNT。与786-O细胞相比，HCT116细胞中PAT4蛋白的表达水平要低得多，因此用PNGase F预处理HCT116大池细胞的裂解液以检测PAT4，PAT4分解成特定的30 在敲除细胞中加入IPTG后，kDa带明显减少(图4a和b)。

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PAT4选择性地影响mTORC1靶点4E-BP1。携带IPTG诱导shNT或shPAT4的HCT116细胞蛋白质提取物的蛋白质印迹（4.8）(一和c（c）)或shNT和shPAT4（7.1）构造(b条和d日)在有无IPTG的情况下培养。(一和b条)第四阶段敲除降低电泳前细胞裂解物与PNGase F孵育后检测到的PAT4蛋白水平。(c（c）–（f）)第四阶段敲除显著降低了4E-BP1最磷酸化γ形式的水平，通过抗磷酸化Ser65-4E-BP1（p-S65-4E-BPl）抗体和pan-4E-BPl抗体的上带可见（箭头所示；在三个独立实验中量化为直方图中4E-BPI总染色的比例(e（电子）)以及(（f）)分别）。磷酸-S6K（p-T389-S6K1）、磷酸-S6（p-S240/244-S6）、磷酸-Akt（p-S473-Akt）和磷酸-ERK（p-T202/Y204-ERK）水平基本上不受以下因素的影响第四阶段击倒。用抗微管蛋白抗体检测印迹作为负荷控制。在三个单独的实验中重现了这些效果*P（P）<0.05; **P（P）<0.01.

IPTG诱导第四阶段敲除选择性地降低4E-BP1的最高度磷酸化形式，在western blot上指定为γ带，28而磷酸化程度较低的形式增加(图4c和f). 人4E-BP1具有至少八个磷酸化位点。28真核启动因子4E结合的关键残基Ser65处4E-BP1的磷酸化，29通常需要形成γ带。抗磷酸化Ser65-4E-BP1抗体证实，该残基（p-S65-4E-BP1）的磷酸化通过第四阶段击倒。相反，p-T37/46-4E-BP1的整体磷酸化保持不变，但在击倒后分布在多个4E-BP1带之间。第4部分敲除对S6K1（p-T389-S6K1）和S6（p-S240/244-S6）磷酸化均无影响(图4c和d)，或有时导致p-S240/244-S6的适度减少（例如。，图5a和补充图S2C)。

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PAT4在HCT116细胞中调节雷帕霉素抗性形式的mTORC1，并增加HEK-293细胞中的雷帕霉素抗性。(一和b条)携带IPTG诱导物的HCT116细胞克隆第四阶段shRNA结构shPAT4（4.8）和IPTG诱导的非靶向对照结构shNT在无IPTG或有IPTG的情况下培养5天，如果需要，在最后24天用雷帕霉素处理 h.雷帕霉素（3 n个M（M）; 看见补充图S2A和B)强烈降低磷酸化S6水平（p-S240/244-S6），并部分影响Ser65磷酸化4E-BP1（p-S65-4E-BPl）γ带（箭头）。这种抗雷帕霉素的磷酸化-4E-BP1γ带在第四阶段击倒(b条). (c（c）)shPAT4（4.8）细胞和shNT对照细胞在没有或存在IPTG的情况下培养8天，并用雷帕霉素处理3天。然后对细胞进行计数，发现雷帕霉素存在时两种细胞系的增殖都降低，IPTG存在时shPAT4（4.8）的增殖也降低(n个=3). 雷帕霉素和IPTG的结合导致shPAT4的细胞数量进一步减少（4.8）。(d日和e（电子）)将正常HEK-293细胞或稳定转染组分表达的GFP-PAT4构建物的细胞培养24小时 有无100时为h n个M（M）雷帕霉素（参见补充图S2F)然后对细胞裂解产物进行西方分析。GFP-PAT4表达减少雷帕霉素对γ-磷酸化4E-BP1带的影响(e（电子）)，但不包括磷-S6（p-S240/244-S6）、磷-Akt（p-S473-Akt）或磷-ERK（p-T202/Y204-ERK）。用抗微管蛋白抗体检测所有印迹，作为负荷对照。(*P（P）<0.05;n个=3). 细胞增殖实验重复进行三次。NS，不显著。

为了确认这一点第四阶段敲除并没有通过抑制上游磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信号而改变4E-BP1磷酸化，评估磷酸化mTORC2-调节的Akt（p-S473-Akt）水平；未观察到任何变化(图4c和d). 细胞外信号调节激酶（ERK）有丝分裂原活化蛋白激酶（p-T202/Y204-ERK）的磷酸化通过致癌形式的KRAS也与结直肠癌对mTOR激酶抑制剂的耐药性有关。30HCT116细胞携带致癌KRAS-G13D等位基因，但第四阶段敲除并没有降低ERK磷酸化(图4c和d)这表明它并不通过ERK调节mTORC1。

The selective action of第四阶段相对于mTORC1途径的S6K/S6信号臂，4E-BP1磷酸化的敲除与雷帕霉素在这些细胞中报道的作用互补，6其中4E-BP1γ-磷酸化对该药物特别耐药。即使在基本上阻止S6磷酸化的雷帕霉素浓度下，仍观察到残留的4E-BP1γ-磷酸化，以及Ser65上磷酸化的低分子量4E-BPl(图5a和补充图S2A和B). 然而，当雷帕霉素和第四阶段结合敲除，磷酸化4E-BP1的γ型和剩余的p-S65-4E-BPl带几乎完全丢失(图5a和b和补充图S2C和D). 与雷帕霉素不同，mTOR的ATP激酶抑制剂PP242强烈影响HCT116细胞的4E-BP1γ-磷酸化和S6K活性(补充图S2E). 综上所述，这些发现表明，在HCT116细胞中，基本上所有4E-BP1γ-磷酸化都是mTORC1依赖性的（参见Ducker等。30)但某些磷酸化是雷帕霉素抗性的，并由PAT4调节。重要的是，雷帕霉素和第四阶段敲除对HCT116细胞增殖也有加性影响(图5c)证明它们抑制不同的mTORC1复合物，这两种复合物都在细胞增殖中起作用。

为了测试PAT4表达与雷帕霉素耐药之间的联系，我们在HEK-293细胞中过度表达了绿色荧光蛋白（GFP）标记的PAT4。我们之前已经在这些细胞中显示，siRNA诱导的PAT4敲除可降低4E-BP1和S6K/S6磷酸化，这一点已通过shRNA敲除得到证实(补充图S3). 我们观察到4E-BP1过度磷酸化在HEK-293细胞中显示出一些雷帕霉素抗性(补充图S2F). GFP-PAT4的强过表达，产生数条蛋白带，分辨率为50 PNGase预处理后western blot上的kDa带(图1d)过度磷酸化的p-Ser65-4E-BP1增强了雷帕霉素抵抗力(图5d和e). 这表明高PAT4水平可诱导多种不同类型细胞对雷帕霉素产生耐药性。

雷帕霉素耐药mTORC1对谷氨酰胺和丝氨酸的PAT4依赖性敏感性

由于PAT与氨基酸依赖性mTORC1激活有关，我们假设PAT4可能感受到调节雷帕霉素耐药mTORC2的特定氨基酸水平。我们使HCT116细胞缺乏特定氨基酸，包括HCT116生长所需的两种非必需氨基酸。非必需丝氨酸被转移到糖酵解中，而谷氨酰胺通过癌细胞（包括HCT116细胞）中的谷氨酰胺解为三羧酸循环提供燃料。26，27，31将任一氨基酸，尤其是谷氨酰胺，减少超过4 与任何必需氨基酸的损失相比，h对4E-BP1过度磷酸化的抑制作用更强(图6a)。

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谷氨酰胺和丝氨酸选择性调节HCT116细胞中依赖于PAT4的雷帕霉素耐药mTORC1信号。(一)HCT116细胞缺乏必需氨基酸、甘氨酸（Gly）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苏氨酸（Thr）和色氨酸（Trp）以及非必需氨基酸丝氨酸（Ser）和谷氨酰胺（Gln）4 h，然后提取蛋白质并进行蛋白质印迹。在此之后，谷氨酰胺消耗使4E-BP1的γ-磷酸化减少最多（箭头所示）；丝氨酸耗竭也会导致更温和的转变。(b条)携带IPTG诱导物的HCT116细胞克隆第四阶段将shRNA构建物shPAT4（4.8）和IPTG诱导的非靶向对照构建物shNT暴露于含有不同浓度谷氨酰胺的培养基中4 h在没有IPTG的情况下。在这些条件下，shPAT4（4.8）细胞表达约50%的正常第四阶段mRNA水平(补充图S1B)因为漏水第四阶段shRNA转录。随着谷氨酰胺浓度下降，shPAT4（4.8）细胞中4E-BP1的γ-磷酸化明显降低。S6磷酸化似乎也受到低谷氨酰胺浓度的影响。(c（c）)与相同的实验(b条)除培养基中丝氨酸含量不同外。同样，shPAT4（4.8）细胞在丝氨酸浓度降低时具有较低的4E-BP1γ-磷酸化。(d日和e（电子）)雷帕霉素处理的HCT116细胞受到不同水平谷氨酰胺的影响(d日)和丝氨酸饥饿(e（电子）)，超过4 h、 显示4E-BP1的γ-磷酸化有较大降低。

如果谷氨酰胺和丝氨酸对4E-BP1的某些选择性作用是通过PAT4依赖的传感机制介导的，我们推断PAT4水平的适度变化可能会改变HCT116细胞对谷氨酰胺和丝氨酸饥饿的敏感性。我们的第4部分击倒克隆显示IPTG非依赖性shRNA击倒泄漏(补充图S1B)通常不影响4E-BP1磷酸化(图5a)或扩散(图3a). 我们在没有IPTG的情况下测试了这些细胞的氨基酸敏感性。4E-BP1过度磷酸化对shPAT4中谷氨酰胺和丝氨酸水平的降低更敏感（4.8）(图6b和c)和shPAT4（7.1）(补充图S4)克隆，表明PAT4参与这些代谢重要氨基酸的传感。有趣的是，在这些实验中，S6磷酸化似乎对减少的谷氨酰胺和丝氨酸更为敏感，这表明抗雷帕霉素的mTORC1在某些条件下可以直接或间接调节S6K活性，或者饥饿影响PAT4对抗雷帕霉素的mTORC的特异性。与单独治疗相比，谷氨酰胺或丝氨酸饥饿联合雷帕霉素治疗对4E-BP1过度磷酸化的影响更大(图6d和e)支持我们的结论，即这些氨基酸由PAT4调节的雷帕霉素耐药mTORC1感应。

Golgi-localised PAT4与mTORC1相互作用

HCT116细胞的免疫荧光染色显示PAT4集中于反式-高尔基网络(图7a). 在786-O细胞中观察到类似的定位(补充图S5A). 此前的一份报告也表明，HEK-293T细胞中PAT4的过度表达并不在LEL上。32有趣的是，尽管在正常培养条件下，大多数mTOR定位在LEL周围，但也观察到一些与转高尔基体网络的共定位(图7b)，增加了它可能与该隔室中的PAT4相关的可能性。

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PAT4和mTOR位于HCT116细胞的高尔基体上。(一)内源性PAT4（绿色）在包括反式-HCT116细胞中的高尔基网络（TGN46；红色）。(b条)虽然大多数mTOR（绿色）位于HCT116细胞中LAMP2阳性的晚期内体和溶酶体（蓝色）上，但一些mTOR染色也与反式-高尔基网络（红色；由合并图像中的箭头指示）。DAPI（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚）标记(一)（蓝色）和(b条)（白色）。比例尺为5 微米。合并图像中的共焦通道显示如下：绿色（G）、蓝色（B）和红色（R）。

为了进一步研究这一点，我们使用了表达GFP标记的PAT4的雷帕霉素耐药HEK-293细胞(图5d). GFP-PAT4也定位于反式-高尔基网络(图8a). Golgi-localised Rab1A是一种参与膜转运事件的单体GTPase，最近被证实与高尔基体mTORC1的氨基酸依赖性激活有关。20我们测试了Rab1A是否可能与PAT4相互作用。我们使用了邻近连接分析（PLA），它检测特定的蛋白质-蛋白质相互作用就地当识别这些分子的抗体非常接近时。33尽管抗Rab1A染色主要局限于顺式-高尔基(图8b)、Rab1A和GFP抗体在相邻隔间产生PLA信号(图8c)，在不表达GFP-PAT4的细胞中不存在(补充图S5B). 该信号经常与GFP-PAT4重叠，并且部分在反式-高尔基网络(图8d)表明Rab1A和PAT4可以在高尔基体上相互作用。此外，PLA使用抗mTOR(图8e)或反猛禽(图8f和补充图S5C)抗GFP抗体也主要在含有GFP-PAT4的隔间产生一个特定信号，包括反式-高尔基体网络。这表明mTORC1与高尔基体上的PAT4相互作用，这与PAT4可以从这个隔室调节mTORC2活性的观点一致。

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PAT4与高尔基体上的Rab1A和mTORC1相互作用。(一)HEK-293细胞中的GFP-PAT4融合蛋白（绿色）显示出与HCT116细胞相似的亚细胞定位反式-高尔基（TGN46；红色）。另一个分辨率更高的细胞用相同的标记物染色(d日). (b条)Rab1A（蓝色）主要位于顺式-高尔基，用GM130标记（红色）标记。(c（c）)现场PLA（红色）显示了Rab1A（蓝色）和GFP-PAT4（绿色）之间的相互作用，主要与包含GFP-PAT_4的隔间有关（GFP-PAT3和PLA信号之间的重叠在合并中为黄色，右上角面板；箭头）。PLA信号也与Rab1A集中在Rab1A和PLA合并处的隔间相邻并部分重叠，右下面板。Rab1A/PAT4 PLA信号仅在GFP-PAT4表达细胞中观察到（参见补充图S5B). (d日)一些GFP-PAT4/Rab1a PLA阳性相互作用隔间（红色）似乎也部分或全部被标记为反式-高尔基网络标记TGN46（蓝色；箭头），但不是反式-缺乏GFP-PAT4的高尔基体区域。(e（电子）)PLA（红色）显示了mTOR（蓝色）和GFP-PAT4（绿色）之间的相互作用，部分与包含GFP-PAT_4的隔间重叠（黄色表示包含绿色和红色通道的合并，包括右上面板中的放大图像；箭头）。在低倍合并图像中，不表达GFP-PAT4的两个上部细胞没有发出PLA信号，表明该分析专门检测GFP-PAT_4/mTOR相互作用。蓝色和红色通道合并（右下方面板）显示，mTOR染色通常与PLA信号非常接近，但也在细胞内的许多其他位置发现。(（f）)PLA（红色）显示了Raptor和GFP-PAT4（绿色）之间的交互作用（红色），位于包含GFP-PAT3的隔间内和相邻隔间内（包含绿色和红色通道的合并中的黄色重叠，包括右上面板中的放大图像；箭头和箭头）。蓝色和红色通道合并（右下面板）显示，一些PLA信号与反式-高尔基（TGN，蓝色；箭头），而其他人没有（箭头）。Raptor/GFP-PAT4 PLA信号仅在GFP-PAT4外显细胞中观察到（见补充图S5C). DAPI标记细胞核(一)（蓝色）和(b条–（f）)（白色）。共焦通道在合并图像中显示如下：绿色（G）、蓝色（B）和红色（R）。比例尺为5 微米。

讨论

尽管mTORC1对抑制剂的耐药性可以部分地解释为差异在体外底物靶位点的灵敏度，34越来越多的证据表明癌细胞中也存在不同的mTORC1复合物，20，21，22，23，35这可能使他们对雷帕霉素等药物有不同的敏感性。在本研究中，我们证明PAT4调节HCT116细胞中的雷帕霉素耐药mTORC1，并且在HEK-293细胞中过度表达时可以诱导雷帕霉素耐药性增加。PAT4和雷帕霉素耐药mTORC1对正常细胞增殖至关重要在体外此外，PAT4表达水平可预测结直肠癌的早期复发，提示在获得更具侵袭性的肿瘤表型方面具有病理生理作用。

我们的发现支持了一种模型，即雷帕霉素耐药和敏感型mTORC1可以独立控制，并提供了一种新的遗传工具来分离这两种信号传递功能(图9). 雷帕霉素耐药的mTORC1选择性地（但不仅限于）调节4E-BP1过度磷酸化，而4E-BPl过度磷酸化也是小鼠红白血病细胞中P53活化的特异靶点，27进一步支持了这是一个独特的综合体的观点。然而，这种选择性效应(图4和补充图S2C)不是普遍的。在其他类型的细胞中，PAT4主要调控mTORC1复合物，控制4E-BP1和S6K(补充图S3; 休伯莱恩等。14)表明细胞类型特异性调节因子或PAT4表达水平调节该转运蛋白控制mTORC1的特异性。事实上，只有当PAT4过度表达时，HEK-293细胞才会表现出可检测到的PAT4依赖性雷帕霉素耐药性(图5d)。

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HCT116细胞中雷帕霉素敏感和耐药mTORC1复合物的示意图。S6K和4E-BP1是真核生物起始因子4E（eIF4E）的负调控因子，是mTORC1最具特征的下游靶点。尽管雷帕霉素治疗强烈抑制S6K磷酸化，但它对Ser65处4E-BP1γ带磷酸化的影响较弱。较少磷酸化形式的4E-BP1与eIF4E结合，导致翻译抑制。8降低PAT4活性主要影响抗雷帕霉素的mTORC1形式。这导致4E-BP1的Ser65磷酸化形式减少，但对S6K磷酸化的影响较小。SLC36（PAT）和/或SLC38家族中的其他AAT可能参与雷帕霉素敏感性mTORC1调节，例如PAT1和SLC38A9。PP242是一种mTORC1 ATP激酶抑制剂，对雷帕霉素敏感型和耐药型mTORC1都有作用。箭头表示正信号，横线表示抑制信号事件。

有人认为，PAT4通过跨膜转运氨基酸来调节mTORC1信号。36然而，这在我们的细胞模型中似乎不太可能，原因有三：第一，细胞表面PAT4蛋白水平很低(图1a，​,77和​和88);32，36其次，PAT4似乎是一种低容量的转运蛋白；37第三，很难解释细胞表面转运蛋白如何仅影响雷帕霉素抗性mTORC1。我们支持PAT4与高尔基体上的mTOR相互作用的模型，尽管它也可能从其他亚细胞亚区调节mTORC1。

我们的研究还揭示了HCT116细胞中mTORC1靶点4E-BP1对谷氨酰胺和丝氨酸这两种非必需氨基酸的还原具有选择性敏感性，但对mTORC1-调节因子亮氨酸没有选择性敏感性，后者的细胞内水平可由谷氨酰胺调节。38Arf1 GTPase调节包括高尔基在内的多个隔室的贩运，最近也被mTORC1牵连到谷氨酰胺传感中。22一个关键问题是PAT4和Arf1是否参与常见的mTORC1调节机制。由于PAT4的氨基酸特异性不同于精氨酸敏感性，mTORC1调节SLC38A918，19和PAT1，15似乎一系列的AAT可能决定mTORC1对不同氨基酸的敏感性。与其他转运蛋白相比，SLC38A9独特的N末端结构域似乎能以更高的亲和力结合Ragulator复合物。18SLC38A9也以较低的亲和力与液泡H相互作用+-ATP酶通过包括其跨膜结构域在内的序列，与其他SLC38和SLC36（PAT）家族成员具有相似性。这可能解释了为什么这些转运体中有几个能够调节mTORC1，但有些，如PAT4，即使PLA表明它们相互作用，也不能降低其他mTORC1超复杂成分就地。

4E-BP1过度磷酸化对4的PAT4依赖性敏感性 谷氨酰胺或丝氨酸饥饿h可能反映了这两种非必需氨基酸在HCT116细胞中的快速代谢。23，27尽管它的名字，当异源表达在爪蟾卵母细胞，PAT4可以通过非质子耦合机制运输氨基酸。它似乎对脯氨酸和色氨酸具有很高的底物亲和力，但容量很低。37其他几种氨基酸，包括谷氨酰胺和丝氨酸，以较低的亲和力结合，可以与高亲和力PAT4底物竞争，尽管它们可能不会被转运。这可能提供一种运输依赖性、氨基酸敏感的“受体”机制，与先前对PAT的建议一致。17通过表达更多的PAT4，细胞将对高代谢氨基酸的消耗具有更强的抵抗力，这解释了结直肠癌患者的临床数据。

总之，我们的研究表明，通过阻断雷帕霉素耐药的4E-BP1选择性途径，对结直肠癌中上游mTORC1激活物（如PAT4）的药理抑制可以补充雷帕霉素的作用。PAT4还可能为雷帕霉素耐药的侵袭性更强的大肠肿瘤提供新的生物标记物。

材料和方法

细胞培养

除非另有规定，HCT116细胞在McCoy的5A改良培养基（Gibco，Invitrogen，Paisley，UK）中培养，该培养基含有10%的胎牛血清（Gibco-Invitrogen）。将786-O和HEK-293细胞培养在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基中。细胞在37°C和5%CO中培养2.进行雷帕霉素治疗24 播种后h。细胞处理24 通常为h，或72 h用于细胞增殖分析，3 n个M（M）（HCT116）或100 n个M（M）（HEK-293）雷帕霉素，从二甲基亚砜（R8781；Sigma，Gillingham，UK）的储备溶液中稀释，或按剂量-反应曲线规定。Founder细胞系取自ATCC（英国泰丁顿LGC Standards），并在复苏后6个月内使用（<25代）。用于击倒的si435第四阶段表达和干扰控制siRNA(图1)之前在Heublein中描述过等。14

诱导性shRNA-表达慢病毒

携带以下克隆的Sigma Mission慢病毒颗粒：TRCN0000043984，5′-CCGCCTTGATAATGAGCAGAATTCGAGATTGCTCATTTATCAAGGTTTTTG-3′（称为shPAT4（43 984)); TRCN0000043985，5′-CCGGCCTTGGAGTAAAGTGTTTATCCGAGATAAACACTTACTCTCCAGGTTTG-3′（shPAT4（43 985））和TRCN0000043987，5′-CCGGCGAGTGTTGTCAGAGACATCTCGAGATCGATTTTG-3′（shPAT4（43 将IPTG诱导慢病毒载体pLKO IPTG_1xLacO中的非靶向控制结构（SHC312V；shNT）转导到HCT116细胞。尽管shPAT4（43 984）与siRNA（435）、shPAT4（43）部分重叠 985）和（43 987）与以前使用的siRNA没有重叠。14在大多数实验中，克隆shPAT4（7.1）与克隆shPAT 4（4.8）相比产生更强的敲除作用，对增殖和mTORC1信号传递的影响更大。

shRNA株的产生和诱导

用慢病毒载体转导细胞，在聚brene存在下，以三种病毒颗粒对细胞的多重感染。在转导后2天开始选择嘌呤霉素，以产生来自多个转导事件的细胞池。转导后不久，用限制稀释法分离出单细胞克隆。IPTG（100 μ米)添加用于诱导。IPTG处理的细胞在电镀前预诱导5天。

氨基酸饥饿培养基

培养基基于Dulbecco改良的Eagle培养基（11995-065；Invitrogen），但内部制作，因此可以单独省略不同的氨基酸。对于谷氨酰胺，已经有一种缺乏这种氨基酸的培养基（McCoy的5A不含谷氨酰胺（M8403；Sigma））。细胞缺乏氨基酸达4 小时。

GFP-PAT4稳定细胞系的建立

将来自IMAGE Clone ID:531323的PAT4开放阅读帧重组为pOPINE载体，其中包含帧内C端GFP序列（pOPINE-GFPc；来自J Beale和S Newstead的礼物）。中的以下错误第四阶段cDNA序列（与注释的转录序列相比）使用Quickchange Site-Directed Mutagenesis Kit（Invitrogen）：I209L（ATA->CTA）H376P（CCT->CAT）I429L（ATA->CTA）进行校正。通过PCR扩增PAT4-GFP融合并克隆到pcDNA3.1（+）中千磅我和Xba公司I站点。将扩增的PAT4和GFP开放阅读框作为GFP-PAT4融合物重新克隆到pcDNA3.1（+）中。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将该构建物或空pcDNA3.1（+）载体转染HEK-293细胞。选择稳定转染细胞48 小时后使用800 μg/ml Geneticin（Gibco，Invitrogen），如Heublein所述等。14

异种移植研究

所有协议均根据30/2771号项目许可证按照内政部规定执行39使用6至7周龄雌性BALB/c SCID努/努老鼠（英国比斯特哈兰·斯普拉格·道利公司）。总计2.5×10650个HCT116细胞 μl无血清培养基和50 μl Matrigel（BD Bioscience，Oxford，UK）皮下注射到一侧（每组7只小鼠；动物未随机分组，研究者未失明；数量基于先前的异种移植物研究）。总共10个 米M（M）将IPTG（Carbosynth Inc.，英国康普顿）添加到处理小鼠的饮用水中。每周使用卡尺测量肿瘤生长三次，并根据公式1/6πx长度x宽度x高度计算体积。重复该实验，生长和存活时间的影响也发生了类似的显著降低。

定量实时PCR

如前所述进行RNA提取和定量实时PCR，14的Ct值第四阶段根据HPRT1型家政基因。

细胞增殖分析

细胞增殖实验重复三次，每次至少使用三个孔。如果发现具有统计意义的结果，则在所有情况下都会观察到这些结果。根据Heublein中描述的方法对细胞进行计数等。14

蛋白质斑点

蛋白质裂解物通常装在10%聚丙烯酰胺凝胶上。对于免疫印迹，在推荐的稀释液中使用以下主要抗体：磷酸化S6K1 Thr308（英国Hitchin细胞信号技术（CST；编号9205））、S6K1（CST，编号9202）、磷酸化Ser240/244-核糖体S6蛋白（CST：编号2215）、S6核糖体蛋白（CSC；编号2217）、磷酸盐化Ser65-4E-BP1兔多克隆（CST）、，4E-BP1（CST；编号9644）、磷酸化-Ser473-Akt（CST，编号4060）、Akt。使用二级抗体（英国南安普敦Promega；编号W401B和W402B）检测它们，并使用SuperSignal West Pico化学发光底物试剂盒（英国拉夫堡Thermoscific）进行可视化。根据制造商的说明，用PNGase F（英国希钦新英格兰生物实验室，编号P0704）对PAT4进行脱糖。

PAT4单克隆抗体的制备

通过使用基于PAT4 N末端内抗原氨基酸序列（REELDMDVMRPLINE-C）的锁孔帽贝血蓝蛋白结合半胱氨酸偶联肽（英国基德明斯特赛文生物技术有限公司）免疫小鼠，制备了抗PAT4的单克隆抗体。

免疫组织化学

使用了以下商业一级抗体：mTOR（CST；编号2983；1/100）、LAMP2小鼠单克隆抗体（Abcam，Cambridge，UK；ab25631；1/100，GM130小鼠多克隆（Novus Biologicals；H00002801-B01P；1/25）、猛禽-兔子多克隆（Merck Millipore，Watford，UK；09-217；1/100）和驴体内产生的二级抗体（Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA；1/500）。按照Ogmundsdottir中的描述对细胞进行处理和成像等。13和桑卡等。40使用Duolink进行PLA现场橙色初级鼠标/兔子套件（DUO92102；Sigma），符合制造商的说明。

对于患者样本，使用柠檬酸缓冲液pH 6.0（英国吉林厄姆Sigma-Aldrich）和加压脱泡室（美国加利福尼亚州康科德市Biocare Medical）对载玻片进行脱蜡和复水，并进行抗原回收。细胞质染色的强度由病理学家（CS）以0到3的半定量等级进行评估。肿瘤切片中的高表达评分为3，低表达评分为0、1或2。

如前所述进行免疫组织化学。41使用标准技术对福尔马林固定肿瘤样品中的石蜡包埋组织块进行切片、脱蜡和再水化 μm截面。

患者材料

1997年至2000年，在英国牛津约翰拉德克利夫医院（John Radcliffe Hospital，UK）接受手术切除的111名结肠癌患者的知情同意下，获得了福尔马林固定和石蜡包埋组织。由于有完整的临床病理数据、随访数据和伦理批准，样本量限制为107个。牛津组织病理学研究中心（项目编号12/A172）和当地研究伦理委员会（C02.216）批准在本项目中使用组织。没有患者接受术前化疗。手术时的平均年龄为71岁（37-96岁），64名患者为男性（58%），平均随访时间为4.1年（截至2009年1月）。根据肿瘤、淋巴结和远处转移，切除患者的癌症分期如下：10例（9%）为1期；2期55例（49%）；35名患者（32%）处于3期，11名患者（10%）处于4期。所有的切除都产生了清晰的边缘。无复发生存期被定义为肿瘤切除和任何部位首次记录肿瘤复发之间的时间。排除因无关原因死亡的患者。如前所述组装组织微阵列42每个患者使用两个肿瘤代表性核心和两个相邻正常结肠粘膜上皮代表性核心。

统计

所有数据（平均值±s.e.m.（异种移植）或s.d(在体外))使用Excel或GraphPad Prism 5（美国加利福尼亚州拉霍亚市GraphPad-Software）进行分析。对于肿瘤生长分析，使用GraphPad Prism 4.0b软件执行参数化广义线性模型。对于western blot分析、细胞增殖和定量实时PCR，使用Kruskal–Wallis单向方差分析确定统计显著性。全部在体外实验重复了至少三次。对于患者数据χ2该测试用于确定PAT4表达和分类临床变量之间的关联(补充表S1). Cox回归分析用于确定单变量预后因素(补充表S2)和多元生存模型(补充表S3). 采用log-rank（Mantel–Cox）检验评估Kaplan–Meier曲线之间无复发生存率差异的显著性。使用SPSS统计学（21.0版，美国纽约州纽约市IBM）进行统计分析。

鸣谢

我们感谢Alan McIntyre、Elena Favaro、Thomas Roberts、Aaron Leiblich和Margretgmundsdóttir在本研究期间提供的建议和技术帮助，感谢Katharine Carr、Kristie McCormick和Dan Stevens对手稿的批判性阅读，特别感谢Richard Boyd为关键合作互动提供的便利。这项工作得到了英国癌症研究所（C191591/A6181、C19591/A9093、C7713/A6174）和C38302/A12278的资助，这些资助是通过英国癌症研究牛津中心发展基金、威康信托基金（WT093326MA）、英国癌症研究中心（BB/L007096/1）、CS Nuffield医学奖学金、，德国沃尔克斯研究院和拜仁马克斯·韦伯项目向SH提供资金，英国耶稣会省（626791）向SMWP提供奖学金。

笔记

作者声明没有利益冲突。

脚注

补充信息随附在Oncogene网站上的这篇论文(网址：http://www.nature.com/onc)

补充材料

补充图S1

补充图S2

补充图S3

补充图S4

补充图S5

补充图形图例

补充表格

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