PAT4水平控制高尔基体Rapamycin耐药mTORC1的氨基酸敏感性并影响结直肠癌的临床预后

PAT4高表达与结直肠癌患者预后不良相关

为了检测PAT4在人类结直肠癌中的表达是否发生改变，我们对107例仅接受手术切除治疗的患者的原发肿瘤组织微阵列进行了染色。病理学家（CS）将细胞质染色的强度分为三类(图2A和B；见材料和方法），均高于正常大肠上皮。统计分析表明，PAT4的高表达与标准临床或病理变量（包括肿瘤部位、肿瘤分期、淋巴结或远端转移、年龄、淋巴管、血管或神经侵袭、分化或性别）无关(补充表S1).

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图2

PAT4的高表达预示着结肠癌的无复发生存率较差。对107例原发性结肠癌患者肿瘤中PAT4的表达进行评估，并根据PAT4表达进行分层。A类,B类由免疫组织化学测定的低和高PAT4表达水平的代表性图像。二氨基联苯胺棕色染色显示免疫反应。C类Kaplan-Meier曲线比较高表达水平与低表达水平。P值是对数库测试（Mantel-Cox）的结果。D类，高表达和低表达PAT4的患者的病例处理总结。A中的比例尺为50μm。

在单变量分析中，高PAT4水平（P=0.01）、高肿瘤分期（P<0.01）、肿瘤分期评分（P<0.01）、肠穿孔（P=0.02）、神经侵袭（P<0.01(补充表S2). PAT4表达较高的癌症患者的平均无复发生存期明显短于表达较低的癌症患者（P<0.01；图2C和D). 此外，在多变量生存分析中，较高的PAT4水平具有统计学意义（P<0.01；补充表S3). 多变量模型包括了单变量分析中除总体分期外与复发显著相关的所有变量，因为这是根据肿瘤分期（T）、淋巴结转移（N）和远处转移（M）分期计算的。我们得出结论，PAT4水平升高与结直肠癌患者的预后较差有关。

PAT4调节HCT116细胞增殖

为了分析HCT116结直肠癌细胞中PAT4的功能，我们建立了稳定的转导细胞系，每个细胞系携带三种不同的慢病毒构建物中的一种，表达第四阶段异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导控制下的短发夹（sh）RNA。对于每种结构，代表许多单独转导事件的集合细胞减少了第4部分转录水平，由定量实时PCR（qRT-PCR）测定；补充图S1A). 选择两个shRNAs，49384和49387进行进一步研究。诱发一致强烈的第四阶段从另一shRNA转导中分离到敲除的单细胞克隆，分别命名为shPAT4（4.8）和shPAT5（7.1(补充图S1B).体外这些克隆与含有IPTG诱导的非靶向shRNA基因（shNT）的HCT116细胞的培养显示，IPTG的诱导特异性抑制了shPAT4表达细胞的增殖（P<0.05；图3A)对细胞死亡没有显著影响(补充表S4).

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图3

PAT4调节HCT116细胞的生长在体外和体内.A类用靶向PAT4的两个独立IPTG诱导shRNA结构之一，即shPAT4（4.8）和shPAT7（7.1），或IPTG引导的非靶向对照结构（shNT），在IPTG存在和不存在的情况下，测量稳定转导的HCT116细胞克隆的增殖（n=3）。B类和C类，人类HCT116肿瘤异种移植物在免疫缺陷小鼠体内的平均生长曲线（±SEM），该免疫缺陷小鼠携带用shNT（B）转导的细胞池，具有（空白圆圈）或不具有（填充正方形）IPTG诱导，或shPAT4转导的HCT116细胞（C）具有（空白正方形，用红色勾勒）或不具备（填充正方体）IPTG-诱导（n=7）。（B，C）中的数据通过非配对双尾独立Student t检验进行分析。D类和E类，七只动物的Kaplan-Meier生存曲线，包括IPTG诱导和不诱导shNT-（D）和shPAT4-（E）HCT116肿瘤；对数库（Mantel-Cox）测试：（E）的P=0.019。对于shPAT4诱导的细胞，需要在36天内（中位数生存时间为36天）处死七只非诱导小鼠（填充方块）中的所有一只，而从38天起处死所有七只诱导小鼠（空白方块，用红色表示），中位数生存期为50天。细胞增殖实验重复三次*P<0.05。

PAT4在异种移植模型中促进人类肿瘤生长

为了评估PAT4在肿瘤生长中的作用，在异种移植实验中使用了携带shPAT4（49387）的HCT116细胞的混合克隆。我们推断第4部分敲除这些细胞可能会更好地模拟表达不同PAT4水平的异质性肿瘤中发生的变化。IPTG对肿瘤生长的影响第四阶段在60天的时间内评估小鼠shPAT4 HCT116细胞的敲除。在免疫缺陷小鼠的饮用水中提供IPTG以诱导shRNA表达。IPTG没有改变shNT细胞形成的肿瘤大小(图3B). 然而，与非诱导shPAT4对照组相比，IPTG诱导的shPAT5表达显著降低了肿瘤生长(图3C；P<0.01）。此外，shPAT4诱导将小鼠的中位生存时间从36天延长到50天（比值：0.72，95%CI比值：0.36到1.07；Gehan-Breslow-Wilcoxon试验，P=0.008；图3D和E). 诱导第四阶段第二次实验中的敲除也显著降低了平均肿瘤体积（P<0.05）并提高了动物存活率（P<0.05体内.

PAT4调节抗雷帕霉素的mTORC1

确定如何第4部分敲除可能抑制肿瘤生长，我们分析了稳定转染HCT116克隆中携带诱导物的mTORC1信号-第四阶段shRNA，shPAT4（4.8）和shPAT4（7.1），以及非靶向克隆shNT。与786-O细胞相比，HCT116细胞中PAT4蛋白的表达水平要低得多，因此用PNGase F预处理HCT116大池细胞的裂解液以检测PAT4，PAT4分解成一个特定的30kDa带，在敲除细胞中加入IPTG后，该带明显减少(图4A和B).

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图4

PAT4选择性地影响mTORC1靶点4E-BP1。携带IPTG诱导的shNT或shPAT4（4.8）（A，C）或shNT的HCT116细胞蛋白质提取物的蛋白质印迹，以及在有和无IPTG的情况下培养的shPAT5（7.1）结构体（B，D）。A类和B类,第四阶段敲除降低了电泳前用PNGase F培养细胞裂解物后检测到的PAT4蛋白水平。C类-F类,第四阶段敲除显著降低了4E-BP1最磷酸化γ形式的水平，这既可以通过抗磷酸化Ser65-4E-BP1（p-S65-4E-BPl）抗体观察到，也可以通过pan-4E-BPl抗体观察到上层带（箭头所示；在三个独立实验中分别以直方图E和F中4E-BPI总染色的比例进行量化）。磷酸-S6K（p-T389-S6K1）、磷酸-S6（p-S240/244-S6）、磷酸-Akt（p-S473-Akt）和磷酸-ERK（p-T202/Y204-ERK）水平基本上不受第四阶段击倒。用抗微管蛋白抗体检测印迹作为负荷控制。在三个单独的实验中重现了这些效果*P<0.05**P<0.01。

IPTG诱导第四阶段敲除选择性地减少4E-BP1的最高度磷酸化形式，在western blot上指定为γ带(28)而磷酸化程度较低的形式增加(图4C-F). 人类4E-BP1至少有八个磷酸化位点(28). eIF4E结合的关键残基Ser65处4E-BP1的磷酸化(29)，通常需要形成γ-带。抗磷酸化Ser65-4E-BP1抗体证实，该残基（p-S65-4E-BP1）的磷酸化通过第四阶段击倒。相反，p-T37/46-4E-BP1的整体磷酸化保持不变，但在击倒后分布在多个4E-BP1带之间。第四阶段敲除对S6K1（p-T389-S6K1）和S6（p-S240/244-S6）磷酸化均无影响(图4C和D)，或有时导致p-S240/244-S6的适度减少（例如。，图5A和补充图S2C).

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图5

PAT4调节HCT116细胞中抗雷帕霉素的mTORC1形式，并增加HEK-293细胞中的雷帕霉素抗性。A类和B类，携带IPTG诱导物的HCT116细胞克隆第四阶段shRNA结构shPAT4（4.8）和IPTG诱导的非靶向对照结构shNT在无IPTG或有IPTG的情况下培养5天，如果需要，在最后24小时内用雷帕霉素处理。雷帕霉素（3 nM；参见补充图S2A和S2B)强烈降低磷酸化S6水平（p-S240/244-S6），并部分影响Ser65磷酸化4E-BP1（p-S65-4E-BPl）γ带（箭头）。这种雷帕霉素抗性磷酸-4E-BP1γ带在第四阶段击倒（B）。C类shPAT4（4.8）细胞和shNT对照细胞在没有或存在IPTG的情况下培养8天，并用雷帕霉素处理3天。然后对细胞进行计数，发现两种细胞系在雷帕霉素存在下的增殖都降低，在IPTG存在下shPAT4（4.8）的增殖也降低（n=3）。雷帕霉素和IPTG的结合导致shPAT4的细胞数量进一步减少（4.8）。D类和E类正常HEK-293细胞或稳定转染有组成性表达的GFP-PAT4构建物的细胞在存在或不存在100 nM雷帕霉素的情况下培养24小时（参见补充图S2F)然后对细胞裂解产物进行西方分析。GFP-PAT4的表达降低了雷帕霉素对γ-磷酸化4E-BP1带（E）的影响，但不降低磷酸化S6（p-S240/244-S6）、磷酸化Akt（p-S473-Akt）或磷酸化ERK（p-T202/Y204-ERK）的影响。用抗微管蛋白抗体检测所有印迹，作为负荷对照。（*P<0.05；n=3）。细胞增殖实验重复三次。

为了确认这一点第四阶段敲除并不是通过抑制上游PI3K/Akt信号而改变4E-BP1磷酸化，而是评估磷酸化mTORC2-reregulated Akt（p-S473-Akt）的水平；未观察到任何变化(图4C和D). 致癌形式的KRAS对ERK MAPK（p-T202/Y204-ERK）的磷酸化也与结直肠癌对mTOR激酶抑制剂的耐药性有关(30). HCT116细胞携带致癌KRAS-G13D等位基因，但第四阶段敲低并没有减少ERK磷酸化(图4C和D)这表明它并不通过ERK调节mTORC1。

The selective action of第四阶段与mTORC1通路的S6K/S6信号臂相比，4E-BP1磷酸化的敲除与雷帕霉素在这些细胞中的作用是互补的(6)其中4E-BP1γ-磷酸化对该药物特别耐药。即使在基本上阻止S6磷酸化的雷帕霉素浓度下，仍观察到残留的4E-BP1γ-磷酸化，以及Ser65上磷酸化的低分子量4E-BPl(图5A,补充图S2A和B). 然而，当雷帕霉素和第四阶段结合敲除，磷酸化4E-BP1的γ型和剩余的p-S65-4E-BPl带几乎完全丢失(图5A和B和补充图S2C和S2D). 与雷帕霉素不同，mTOR的ATP激酶抑制剂PP242强烈影响HCT116细胞中4E-BP1γ磷酸化和S6K活性(补充图S2E). 总之，这些发现表明，在HCT116细胞中，基本上所有4E-BP1γ-磷酸化都依赖于mTORC1（另见参考文献。30)，但某些磷酸化是雷帕霉素抗性的，并受PAT4的调节。重要的是，雷帕霉素和第四阶段敲除对HCT116细胞增殖也有加性影响(图5C)证明它们抑制不同的mTORC1复合物，这两种复合物都在细胞增殖中发挥作用。

为了测试PAT4表达与雷帕霉素耐药之间的联系，我们在HEK-293细胞中过度表达了GFP标记的PAT4。我们之前已经在这些细胞中显示，siRNA诱导的PAT4敲除可降低4E-BP1和S6K/S6磷酸化，这一点已通过shRNA敲除得到证实(补充图S3). 我们观察到4E-BP1过度磷酸化在HEK-293细胞中显示出一些雷帕霉素抵抗(补充图S2F). GFP-PAT4的强过表达，在PNGase预处理后，在western blot上产生几个蛋白带，分辨率为50kDa带(图1D)过度磷酸化的p-Ser65-4E-BP1增强了雷帕霉素抵抗力(图5D和E). 这表明高PAT4水平可诱导多种不同类型细胞对雷帕霉素产生耐药性。

雷帕霉素耐药mTORC1对谷氨酰胺和丝氨酸的PAT4依赖性敏感性

由于PAT与氨基酸依赖性mTORC1激活有关，我们假设PAT4可能感受到调节雷帕霉素耐药mTORC2的特定氨基酸水平。我们使HCT116细胞缺乏特定氨基酸，包括HCT116生长所需的两种非必需氨基酸。非必需丝氨酸被转移到糖酵解中，而谷氨酰胺通过谷氨酰胺水解作用为癌细胞（包括HCT116细胞）的三羧酸（TCA）循环提供燃料(26,27,31). 在四个小时内减少任一氨基酸，尤其是谷氨酰胺，对4E-BP1过度磷酸化的抑制作用强于任何必需氨基酸的损失(图6A).

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图6

谷氨酰胺和丝氨酸选择性调节HCT116细胞中依赖于PAT4的雷帕霉素耐药mTORC1信号。A类HCT116细胞在不同的培养物中饥饿必需氨基酸、甘氨酸（Gly）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苏氨酸（Thr）和色氨酸（Trp）以及非必需氨基酸、丝氨酸（Ser）和谷氨酰胺（Gln）四小时，然后提取蛋白质并进行western blotting。在这段时间之后，谷氨酰胺耗竭导致4E-BP1的γ-磷酸化最大程度的减少（箭头）；丝氨酸耗竭也会导致更温和的转变。B类，携带IPTG诱导物的HCT116细胞克隆第四阶段shRNA构建物shPAT4（4.8）和IPTG诱导的非靶向对照构建物shNT在不含IPTG的情况下暴露于含有不同浓度谷氨酰胺的培养基中4小时。在这些条件下，shPAT4（4.8）细胞表达约50%的正常第四阶段mRNA水平(补充图S1B)由于泄漏第四阶段shRNA转录。随着谷氨酰胺浓度下降，shPAT4（4.8）细胞中4E-BP1的γ-磷酸化明显降低。S6磷酸化似乎也受到低谷氨酰胺浓度的影响。C类，与（B）相同的实验，不同之处在于培养基中丝氨酸的水平不同。同样，shPAT4（4.8）细胞在丝氨酸浓度降低时具有较低的4E-BP1γ-磷酸化。D类和E类经雷帕霉素处理的HCT116细胞在经历不同水平的谷氨酰胺（D）和丝氨酸饥饿（E）四个小时后，4E-BP1的γ-磷酸化水平显著降低。

如果谷氨酰胺和丝氨酸对4E-BP1的一些选择性作用是通过PAT4依赖性传感机制介导的，我们推断PAT4水平的适度变化可能会改变HCT116细胞对谷氨酰胺和丝氨酸饥饿的敏感性。我们的第四阶段击倒克隆显示IPTG非依赖性shRNA击倒泄漏(补充图S1B)通常不影响4E-BP1磷酸化(图5A)或扩散(图3A). 我们在没有IPTG的情况下测试了这些细胞的氨基酸敏感性。4E-BP1过度磷酸化对shPAT4中谷氨酰胺和丝氨酸水平的降低更敏感（4.8）(图6B和C)和shPAT4（7.1）(补充图S4)克隆，表明PAT4参与这些代谢重要氨基酸的传感。有趣的是，在这些实验中，S6磷酸化似乎对减少的谷氨酰胺和丝氨酸更为敏感，这表明抗雷帕霉素的mTORC1在某些条件下可以直接或间接调节S6K活性，或者饥饿影响PAT4对抗雷帕霉素的mTORC的特异性。谷氨酰胺或丝氨酸饥饿与雷帕霉素联合治疗对4E-BP1过度磷酸化的影响大于单独治疗(图6D和6E)支持我们的结论，即这些氨基酸由PAT4调节的雷帕霉素耐药mTORC1感应。

诱导性shRNA-表达慢病毒

西格玛使命^®携带以下克隆的慢病毒颗粒：TRCN0000043984 5′-CCGCCTTGATAATGAGCAGAATT-CTCGAATTGCTCATTCAAGGTTTTTG-3′，称为shPAT4（43984），TRCN0000043985 5′-CCGG-CCTTGGAGAGAGTAAGTTTTTTTCGAG-ATAAACACTTTACTCCAGGTTTTTTTG-3′（shPAT4[43985]）]将IPTG诱导慢病毒载体pLKO IPTG_1×LacO中的TRCN00000439887 5′-CCGGCAGATGTTGTCAGGAACATCTCGAG-ATGTCGAG-ATGTCGACACATGGTTTTG-3′（shPAT4[43987]）和非靶向控制结构（SHC312V；shNT）转导至HCT116细胞。虽然shPAT4（43984）与siRNA（435）部分重叠，但shPAT5（43985）和（43987）与以前使用的siRNA没有重叠(14). 在大多数实验中，克隆shPAT4（7.1）比克隆shPAT_4（4.8）产生更强的敲除作用，对增殖和mTORC1信号传导的影响更大。

shRNA株的产生和诱导

用慢病毒载体转导细胞，在聚brene存在下，以三种病毒颗粒对细胞的多重感染。在转导后两天开始选择嘌呤霉素，以产生来自多个转导事件的细胞池。转导后不久，用极限稀释法分离出单细胞克隆。添加100μM IPTG进行诱导。IPTG处理的细胞在电镀前提前诱导五天。

氨基酸饥饿培养基

培养基基于DMEM（11995-065；Invitrogen），但内部制作，因此可以单独省略不同的氨基酸。对于谷氨酰胺，已经有一种缺乏这种氨基酸的培养基（McCoy的5A不含谷氨酰胺[M8403；Sigma]）。细胞连续四个小时缺乏氨基酸。

GFP-PAT4稳定细胞系的产生

将来自IMAGE Clone ID:531323的PAT4开放阅读帧重组为pOPINE载体，其中包含帧内C端GFP序列（pOPINE-GFPc；来自J Beale和S Newstead的礼物）。中的以下错误第4部分cDNA序列（与带注释的转录序列相比）使用Quickchange进行更正^®定点突变试剂盒（Invitrogen）：I209L（ATA->CTA）H376P（CCT->CAT）I429L（ATA->CTA）。通过PCR扩增PAT4-GFP融合并克隆到pcDNA3.1（+）中千磅我和Xba公司I站点。扩增的PAT4和GFP ORF作为GFP-PAT4融合物重新接入pcDNA3.1（+）。用该构建物或空pcDNA3.1（+）载体用脂质体转染HEK-293细胞^®2000（Invitrogen）。48小时后，使用800μg/ml Geneticin（Gibco）筛选稳定转染细胞^®；Invitrogen），如中所述(14).

异种移植研究

所有协议均根据30/2771号项目许可证按照内政部规定执行(39)使用6-7周龄女性BALB/c SCID努/努老鼠（Harlan Sprague Dawley，Inc）。2.5 × 10⁶将50μl无血清培养基中的HCT116细胞和50μl Matrigel（BD Bioscience）皮下注射到一侧（每组7只小鼠；动物未随机，研究人员未盲法；数量基于之前的异种移植研究）。将10 mM IPTG（Carbosynth Inc）添加到治疗小鼠的饮用水中。每周使用卡尺测量肿瘤生长三次，并根据公式1/6π×长×宽×高计算体积。重复该实验，生长和存活时间的影响也发生了类似的显著降低。

定量实时PCR

如前所述进行RNA提取和定量实时PCR（qRT-PCR）(14)，具有的Ct值第4部分根据HPRT1型家政基因。

细胞增殖分析

细胞增殖实验重复三次，每次至少使用三个孔。如果发现具有统计意义的结果，则在所有情况下都会观察到这些结果。根据中描述的方法对细胞进行计数(14)

蛋白质斑点

蛋白质裂解物通常装在10%聚丙烯酰胺凝胶上。为了进行免疫印迹，在推荐的稀释液中使用了以下主要抗体：磷酸化-S6K1 Thr308（细胞信号技术[CST#9205]）、S6K1（CST#9202）、磷酸化-Ser240/244-核糖体S6蛋白（细胞信号技术[CST#2215]），S6核糖体蛋白（CST#2217），磷酸化-Ser 65-4E-BP1兔多克隆（CST#19451），4E-BP1（CST#9644）、磷酸化-Ser473-Akt（CST#4060）、Akt、磷酸化-Thr202/Tyr204-p44/42 MAPK（Erk1/2；CST#4370）、p44/42 MAPK（Erk 1/2；CST#4695）和α-微管蛋白（Sigma#T6199）。用二级抗体（Promega#W401B，#W402B）检测并使用SuperSignal进行可视化^®West Pico化学发光基板套件（Thermoscific）。根据制造商的说明，用PNGase F（新英格兰生物实验室；#P0704）对PAT4进行脱糖。

PAT4单克隆抗体的制备

通过用钥匙孔帽贝血蓝蛋白-（KLH−）偶联的半胱氨酸偶联肽（Severn Biotech Ltd）免疫小鼠，产生了针对PAT4的单克隆抗体，该肽基于PAT4 N末端的抗原氨基酸序列（REELDMDVMRPLINEC）。

免疫组织化学

使用了以下商业一级抗体：mTOR（CST#2983；1/100）、LAMP2小鼠单克隆抗体（Abcam，ab25631:1/100）、TGN46绵羊多克隆抗体（Novus Biologicals NB110-40767:1/200）、Rab1a兔单克隆抗体，猛禽兔多克隆（Merck Millipore，09-217:1/100）和驴体内产生的二级抗体（Jackson ImmunoResearch:1/500）。如中所述对细胞进行处理和成像(13,40). 使用Duolink进行近端结扎分析^® 现场橙色初级鼠标/兔子套件（DUO92102，Sigma）符合制造商的说明。

对于患者样本，使用柠檬酸缓冲液pH 6.0（Sigma-Aldrich）和加压脱浊室（Biocare Medical）对载玻片进行脱蜡和再水化，并进行抗原回收。细胞质染色的强度由病理学家（CS）以0-3的半定量等级进行评估。肿瘤切片中的高表达量为3分，低表达量为0分、1分或2分。

如前所述进行免疫组织化学(41). 使用标准技术和4μm切片对福尔马林固定肿瘤样品中的石蜡包埋组织块进行切片、脱蜡和再水化。

患者材料

1997年至2000年，在牛津约翰·拉德克利夫医院接受手术切除治疗的111名结肠癌患者的知情同意下，获得了福尔马林固定和石蜡包埋组织。由于有完整的临床病理数据、随访数据和伦理批准，样本量限制为107个。牛津组织病理学研究中心（项目编号12/A172）和当地研究伦理委员会（C02.216）批准在本项目中使用组织。没有患者接受术前化疗。手术时的平均年龄为71岁（37-96岁），64名患者为男性（58%），平均随访时间为4.1年（截至2009年1月）。根据肿瘤、淋巴结转移和远处转移（TNM），切除时患者的癌症分期如下：；1期患者10例（9%）；55例（49%）2期患者；35名患者（32%）为3期患者，11名患者（10%）为4期患者。所有的切除都产生了清晰的边缘。无复发生存期定义为肿瘤切除和首次记录的任何部位肿瘤复发之间的时间。排除因无关原因死亡的患者。如前所述组装组织微阵列(42)每个患者使用两个肿瘤代表性核心和两个相邻正常结肠粘膜上皮代表性核心。

我们感谢Alan McIntyre、Elena Favaro、Thomas Roberts、Aaron Leiblich和Margretgmundsdóttir在本研究期间提供的建议和技术帮助，感谢Katharine Carr、Kristie McCormick和Dan Stevens对手稿的批判性阅读，特别感谢Richard Boyd为关键合作互动提供的便利。这项工作得到了英国癌症研究所（C191591/A6181、C19591/A9093、C7713/A6174）和C38302/A12278的资助，这些资助是通过英国癌症研究牛津中心发展基金、威康信托基金（WT093326MA）、英国癌症研究中心（BB/L007096/1）、CS Nuffield医学奖学金、，德国沃尔克斯研究院和拜仁马克斯·韦伯项目向SH提供资金，英国耶稣会省（626791）向SMWP提供奖学金。