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单元格。作者手稿；PMC 2016年1月15日提供。
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单元格。2015年1月15日；160(0): 324–338.
2014年12月31日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.cell.2014.12.021
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NIHMSID公司：NIHMS650394标准
PMID：25557080

人和小鼠胰腺导管癌的器官模型

西尔维亚·博伊,1,2,15 Chang-II黄,三，4,15 林赛·A·贝克,三，4,15 锁定Christine Chio,三，4,15 丹妮尔·恩格尔,三，4,15 文森佐·科尔博,三，4,15 迈斯·贾格尔,1,15 玛丽亚诺·蓬兹·萨维西,三，4 埃尔维·蒂里亚克,三，4 莫娜·斯佩克特,三，4 安娜·格拉卡宁,1,2 托比洛巴·奥尼,三，4,5 Kenneth H.Yu（肯尼思·H·余）,三，4,6,7 鲁本·范·博克斯特尔,1 Meritxell Huch公司,1,8 基思·D·里维拉,三 约翰·威尔逊,三 迈克尔·E·费金,三，4 丹尼尔·奥赫隆德,三，4 亚伯兰·汉德利·桑塔纳,4,9 克里斯汀·阿尔迪托·阿布拉罕,三，4 迈克尔·路德维希,三，4 埃拉·埃利亚达,三，4 布林达·阿拉格桑,三，4,10 朱利娅·比菲,三，4 乔治·尤丹诺夫,4,9 贝萨尼·德尔库泽,三，4 布莱安娜·克里顿,三，4 凯文·赖特,三，4 Youngkyu公园,三，4 Folkert H.M.Morsink公司,11 I.昆特斯·莫勒纳,12 Inne H.Borel Rinkes酒店,12 埃德温·库彭,1 袁浩,三 英金,三 艾萨克·J·奈曼,1 克里斯汀·亚科布齐奥·多纳休,6 史蒂芬·D·利奇,6 达里尔·帕平,三 莫莉·哈梅尔,三 大卫·S·克里姆斯特拉,13 奥尔卡·巴斯特克,13 拉尔夫·赫鲁班,14 乔治·约翰·奥弗豪斯,11 罗伯特·G·J·弗里斯,1,2 汉斯·克莱弗斯,1,*和大卫·塔维森三，4,6,*
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关联数据

补充资料

总结

胰腺癌是最致命的恶性肿瘤之一，由于其诊断较晚，治疗反应有限。迫切需要有可追踪的方法来识别和询问与胰腺肿瘤发生有关的途径。我们从正常和肿瘤小鼠及人类胰腺组织建立了类器官模型。胰腺类器官可以从切除的肿瘤和活检中快速生成，在冷冻保存后存活，并表现出导管和疾病阶段的特定特征。原位移植的肿瘤类器官通过形成早期肿瘤，发展为局部浸润性和转移性癌，重演了肿瘤发展的全过程。由于其能够被基因操纵，类有机物是一个探索基因合作的平台。对小鼠胰腺类器官的全面转录和蛋白质组分析揭示了疾病进展过程中基因和通路的改变。对人体组织中许多蛋白质变化的确认表明，类有机物是一个容易发现这种致命恶性肿瘤特征的模型系统。

简介

预计到2030年，美国胰腺癌死亡率将超过乳腺癌和结直肠癌死亡率(Rahib等人，2014年;Siegel等人，2013年). 这种可怕的情况反映了人口老龄化、乳腺癌和结直肠癌患者预后的改善、大多数胰腺癌患者被诊断为晚期，以及胰腺癌患者缺乏持久的治疗反应。事实上，胰腺导管腺癌（PDA）患者的有效治疗策略一直难以确定(Abbruzzese和Hess，2014年).

PDA的治疗耐药性已在多种细胞培养和动物模型系统中进行了研究，但临床上偶尔会出现可操作的结果(Villarroel等人，2011年). 患者源性异种移植物（PDX）已经对PDA产生了深入的认识，但其产生需要大量组织，需要数月才能建立(Kim等人，2009年;Rubio Viqueira等人，2006年). PDA的基因工程小鼠模型（GEMMs）也被生成为一个并行系统，用于研究基础生物学和临床意义(Perez-Mancera 2012年). 这些GEMMs准确地模拟了人类PDA的病理生理特征，包括侵袭性胰腺上皮内肿瘤（PanINs）引发的疾病(Hingorani等人，2003年;Perez-Mancera等人，2012年)，并被用来发现PDA具有损害药物输送的缺陷血管系统(Erkan等人，2009年;Jacobetz等人，2012年;Koong等人，2000年;Olive等人，2009年;Provenzano等人，2012年). 虽然GEMM已告知PDA治疗发展(Beatty等人，2011年;Frese等人，2012年;Neesse等人，2014年)，它们既昂贵又耗时(Perez-Mancera等人，2012年). 此外，人类PDA和GEMMs都表现出广泛的基质成分，减少了肿瘤细胞的数量，因此很难分离和表征小鼠胰腺肿瘤组织中上皮衍生的恶性细胞。

为了研究肿瘤细胞，分离的人类肿瘤通常在二维（2D）培养条件下生长(Sharma等人，2010年)，其不支持未转化的非肿瘤胰腺细胞的生长。已经开发出三维（3D）培养策略来研究正常的未转化细胞，但只允许最小的繁殖(Agbunag和Bar-Sagi，2004年;Lee等人，2013年;Means等人，2005年;Rovira等人，2010年;Seaberg等人，2004年). 鼠和人PDA进展的综合3D细胞培养模型将有助于研究PDA的遗传驱动因素、治疗靶点和诊断。

为了解决这一缺陷，我们试图通过改进我们之前开创的肠道培养方法来生成正常和肿瘤性胰腺类器官(Sato等人，2009年)，胃(Barker等人，2010年)，结肠癌(佐藤等人，2011年)，肝脏(Huch等人，2013年b)，胰腺(Huch等人，2013年a)和前列腺类有机物(Gao等人，2014年;Karthaus等人，2014年). 我们从正常和恶性小鼠胰腺组织中开发出3D类器官，并使用该模型系统研究PDA的发病机制。来自野生型小鼠和PDA GEMMs的胰腺类有机物准确地概括了疾病进展的生理相关方面在体外原位移植后，与其他3D模型系统不同，野生型小鼠正常胰腺的类器官能够再生正常的导管结构。我们进一步开发了从正常和疾病人体组织以及内窥镜针活检中生成胰腺类器官的方法。移植后，来自小鼠和人类PDA的类器官产生类似于PanIN的损伤，并发展为侵袭性PDA。最后，我们证明了类有机物在识别与疾病进展相关的分子途径以及代表治疗和诊断机会方面的作用。

结果

表达致癌Kras的小鼠胰腺导管类器官重述了PanINs的特征

最近，我们从成年小鼠导管细胞中获得了持续增殖的正常胰腺类器官(Huch等人，2013年a). 我们优化了这种方法来生成PDA进展模型。我们从C57Bl/6小鼠正常胰腺和胰腺组织中手动分离小叶内小导管并建立类器官培养物，这些组织含有来自K（K）ras（拉斯维加斯）+/LSL-G12D型;Pdx1页-C类重新（“KC”）小鼠(图1A). KC小鼠发展出一系列与人类PanINs相似的侵袭前导管病变，随着年龄增长，随机发展出原发性和转移性PDA(Hingorani等人，2003年). 与野生型小鼠相比，KC胰腺的导管通常更大，显示出更高等级的异型增生(图1A). 在培养1–3天后，从分离的导管中观察到类器官生长(图1A). 我们收集了10个小鼠正常（mN）和9个PanIN（mP）类器官培养物，我们已经连续繁殖了20多次，并成功冷冻保存(表S1A). mP类有机物表现出条件重组喀斯特LSL-G12D型与mN类有机物相比，Kras-GTP的等位基因和更高水平(图1B).

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致癌的喀斯特G12D系列胰腺导管类器官的表达足以诱导浸润前肿瘤

（A） 用于制备类有机物的小鼠胰腺组织的苏木精和伊红（H&E）染色（上图）。箭头表示鼠标正常或PanIN导管结构。隔离后立即嵌入Matrigel中的导管（中间）和隔离后3天的类器官（底部）。箭头标记孤立的导管和生长的类器官。比例尺，50μm。

（B） 小鼠正常（mN）和mPanIN（mP）类器官中Kras、pan-Ras、Kras-GTP的RBD-GST下拉免疫印迹和Tubulin。PCR证实Cre介导的重组喀斯特LSL-G12D型等位基因（底部）。

（C） 导管的qRT-PCR(Pdx1、Ck19、Sox9、Hnf6)，腺泡(Ptf1a、Cpa1、Amy)和内分泌(Ngn3、Chga、Ins2)mN和mP类器官中的谱系标记。显示了3个生物复制的平均值。误差条描述了平均值标准误差（SEM）。将数值标准化为小鼠正常胰腺。

（D） 指示PanIN病变基因的qRT-PCR(Muc5ac、Muc6、Tff1、Klf4)mN和mP类有机物。数值归一化为mN类有机物。显示了3个生物复制的平均值。误差条描述SEM。**：第页<0.01由双尾学生得出t吨-测试。

（E） 转导GFP的mN和mP类器官的原位同系移植的H&E、Alcian Blue染色和免疫组织化学（IHC）。比例尺，200μm。

（F） 通过RBD-GST下拉和Tubulin对Kras、pan Ras、Kras GTP的免疫印迹喀斯特+/LSL-G12D型用腺病毒-Cre（Ad-Cre）或腺病毒空白（Ad-Bl）转导的类器官。PCR证实Cre介导的重组喀斯特LSL-G12D型等位基因（底部）。

（G） Ad-Bl转导的类器官原位同种移植的H&E、Alcian Blue染色和IHC(喀斯特+/LSL-G12D型;R26-LSL-YFP型)和Ad-Cre(喀斯特+/LSL-G12D型;R26-YFP型)移植后2周。比例尺，200μm。

另请参见图S1和表S1.

为了确定不同胰腺谱系对类器官的贡献，我们评估了类器官中胰腺谱系标记的表达。导管谱系相关基因(Ck19、Sox9) (克利夫兰等人，2012年)与含有相对较少导管细胞的胰腺组织相比，mN和mP类有机物含量较高(图1C). 此外，mP类有机物上调基因指示PanIN疾病状态(Muc5ac、Muc6、Tff1)相对于mN，无差异Klf4公司(图1D) (Prasad等人，2005年). 将GFP转导的mN和mP类有机物原位移植到同基因C57Bl/6或努/努老鼠。mN类器官迅速形成由简单立方细胞组成的导管结构，持续长达一个月（n=9/27次移植），但在2个月后未观察到（n=0/13次移植）(图1E,表S1B). 相比之下，mP类器官形成小囊肿，内衬单层简单立方导管细胞，其间点缀着含粘液的柱状上皮细胞。虽然我们不能证明mP移植与自然导管系统相邻，但它们与侵袭前的mPanIN相似(图S1C). 这些发育不良的上皮细胞持续存在2个月或更长时间（n=16/18例移植），GFP和Ck19阳性，表达mPanIN相关的黏蛋白Muc5ac，并用Alcian Blue显著染色(图1E,表S1C). 此外，与mN移植相比，异型增生细胞的增殖增加，基质反应增强，两者都是自体mPanIN组织的特征(图S1A–C). 移植的mPan类器官形成具有mPanIN许多特征的病变的能力证明了该系统作为早期胰腺肿瘤模型的实用性。

PDA的发生有多种细胞来源，胰腺腺泡细胞被认为是PDA发生的主要原因(De La等人，2008年;Gidekel Friedlander等人，2009年;Guerra等人，2003年;Habbe等人，2008年;Kopp等人，2012年;莫里斯等人，2010年;Sawey等人，2007年). 然而，最近的研究表明，胰腺导管细胞的转化也可以引起PDA(Pylayeva-Gupta等人，2012年;Ray等人，2011年;von Figura等人，2014年). 在我们的条件下，从野生型胰腺分离出的Acinar细胞不能形成类有机物(Huch等人，2013年a). 因此，我们的胰腺导管类器官系统为确定导管细胞是否能产生mPanIN提供了一个独特的机会。评估胰腺导管类器官中致癌Kras的表达是否足以诱导mPanIN的形成体内，我们从含有条件喀斯特+/LSL-G12D型等位基因(Hingorani等人，2003年). 腺病毒激活Kras后-Cre公司（广告-Cre公司)感染，喀斯特G12D系列类器官维持导管细胞而非腺泡或内分泌谱系特异基因的表达(图S1D和S1E). 重组喀斯特+/LSL-G12D型等位基因通过聚合酶链式反应得到证实，与对照感染的类器官相比，GTP结合的Kras水平增加(图1F). 此外喀斯特十二国集团D类导致与人类PanIN相关的基因上调(图S1F). 这个喀斯特十二国集团D类-与对照类有机物相比，表达类有机物的细胞增殖增加(图S1G). 最后，喀斯特G12D系列将类有机物原位植入同基因小鼠体内，形成具有柱状细胞形态的mPanIN样结构(图1G). 这种形态与移植形成的正常导管结构形成对比喀斯特+/LSL-G12D型类有机物或野生型mN类有机物(图1E和1G). 类mPanIN结构的发展能力喀斯特G12D系列-移植后表达的导管类器官表明导管细胞也能形成mPanINs。

肿瘤衍生类有机物为小鼠PDA进展提供了模型

我们从多个小鼠原发肿瘤（mT）和KC和K（K）ras（拉斯维加斯）+/LSL-G12D型;Tr公司第页53+/LSL-R172H型;Pdx公司-C类重新（“KPC”）小鼠比KC小鼠发育mPDA更快(图2A,表S2A) (Hingorani等人，2005年). mT和mM类有机物表现出重组喀斯特LSL-G12D型等位基因，Kras-GTP和Kras蛋白水平增加(图2B). mT和mM类有机物S6磷酸化水平增加，但Erk或Akt磷酸化没有增加(图2B).

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用肿瘤和转移衍生的有机物模拟小鼠PDA进展

（A） 肿瘤和转移类器官来源的小鼠组织的H&E染色（上图）。箭头表示转移。比例尺，50μm。分离后立即将消化的小鼠组织包埋在Matrigel中（中间），分离后3天将类器官包埋在其中（底部）。比例尺，200μm。

（B） 通过RBD-GST下拉和Tubulin对选定的信号效应器Kras-GTP和Ras-GTP进行免疫印迹。PCR确认喀斯特LSL-G12D型mP、mT和mM类有机物中的重组（底部）。

（C） mT器官原位移植肿瘤和转移瘤（met）的H&E染色。比例尺，200μm（顶部）和50μm（底部）。

（D） 野生型杂合性缺失Trp53基因通过PCR（top）和Trp53、Smad4、p16和Tubulin的免疫印迹分析确定等位基因。mM3L：来源于肝转移。

（E） 类器官和单层（2D）细胞系的核型。

另请参见图S2和表S2.

mT器官原位移植最初产生类似于mPanIN的低度和高度病变(图2C,表S2B). 经过较长时间（1-6个月），移植发展为侵袭性原发性和转移性mPDA(图2C,表S2B). 同种异体器官原位移植后移植效果相似努/努小鼠（91.7%）与C57Bl/6小鼠（85%）相比，但在努/努主机(表S2B). 虽然大多数mT器官移植需要几个月才能从早期的mPanIN样病变进展到侵袭性和转移性癌症(图2C,表S2B)，mM类器官在1个月内迅速形成侵袭性mPDA(表S2C). 器官移植能够复制疾病进展的离散阶段，与2D细胞系移植后快速形成晚期mPDA形成对比(图S2A-C) (Olive等人，2009年).

该肿瘤在移植的mT和mM类器官中表现出显著的基质反应，与KPC小鼠的本地肿瘤相似(图S2A) (Olive等人，2009年). 这种间质反应在2D细胞系形成的肿瘤中通常不存在(图S2A) (Olive等人，2009年). 还观察到低血管密度和高血管-肿瘤距离，与移植的2D细胞系相比，器官样移植模型与自体mPDA非常相似(图S2A-C) (Olive等人，2009年).

杂合性缺失（LOH）Trp53基因根据2D细胞系的研究，已被报道为mPDA的一个常见特征(Hingorani等人，2005年). 因此，我们分析了Trp53基因我们的小鼠3D类器官中的LOH。从KPC肿瘤中制备的所有mT类有机物都保持p16的表达，没有表现出Trp53基因LOH和保持稳定的核型，而大多数mM类有机物失去野生型Trp53基因等位基因和非整倍体(图2D、2E和S2D系列). 我们从mT和mM类有机物中生成了2D细胞系，但发现mN和mP类有机物无法在2D中繁殖。mT1来自KC小鼠PDA，缺少突变Trp53基因等位基因，也不能在2D中繁殖。所有mT-衍生的2D细胞系均显示Trp53基因LOH和非整倍体(图2E和S2D系列).

为了确定类有机物是否适用于遗传合作实验，将靶向p53和p16/p19的shRNA引入到mP类有机物中(图S2E). 当p53或p16/p19被击倒时，mP类有机物的增殖增加(图S2G)，只有p53基因敲除才能实现2D生长和菌落形成(图S2F,数据未显示). 此外，只有p53基因敲除促进了mP器官样移植在3个月内进展为浸润性癌(图S2H). 这与之前的报道形成了对比，即p16/p19的双等位基因缺失和Kras突变促进了mPDA(Aguirre等人，2003年;Bardeesy等人，2006年)，并可能反映遗传系统或起始细胞室中的差异。然而，p53缺失和致癌Kras之间的合作表明，类有机物是评估PDA进展遗传介质的一个简单系统。

人类胰腺类器官模型PanIN到PDA进展

我们改变了培养条件，以支持人类正常和恶性胰腺组织的增殖。分离导管碎片并不总是可行的，因为一些正常胰腺组织样本在准备胰岛移植时被预先消化。因此，我们直接将消化后的材料嵌入Matrigel中。该方法对人类正常（hN）类有机物的分离效率达到75-80%(图3A和第3章,表S3). hN类有机物需要TGF-β途径抑制剂（A83-01和Noggin）、R-Spondin1和Wnt3a调节介质、EGF和PGE2才能繁殖(图3B和3C). 与mN类有机物在培养中无限增殖不同，hN类有机质在20代或大约6个月后停止增殖，但可以低温保存。

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人胰腺导管类器官概述了正常和肿瘤导管的特征

（A） 从正常组织（hN1-2）、切除的原发性肿瘤（hT1-2）、切除后的肺转移灶（hM1）和转移灶的细针抽吸活检（hFNA2）建立的人类器官样培养的代表性图像（顶部）和H&E染色（中部）。H&E染色法对衍生类器官的切除组织进行染色（底部）。比例尺，500μm（顶部）、250μm（中部）和500μm（底部）。

（B） hN和hT类有机物在人类完全培养基中培养两周（1代）的代表性图像，或在缺乏指示因子的人类完全培养液中培养的代表性图片。比例尺，500μm。

（C） 在没有指示因子的情况下，hN和hT类有机物的传代数可以繁殖。

（D） 人类类器官的靶向测序分析。显示了多个样本中发生改变和/或已知PDA中发生突变的基因。如果在一个基因中发现多个突变，则每个基因只显示一个突变。显示了遗传改变类型的颜色键。Met表示来自转移样本的类有机物。

另请参见图S3,表S3和S4系列

我们修改了上述方法，以适应新切除的PDA标本和生成的人类肿瘤衍生类器官（hT）中广泛的促结缔组织增生反应(图3A和第3章). hT类有机物可以无限期传代并冷冻保存(图3C). 在荷兰和美国，hT类有机物的建立效率分别为75%（n=3/4）和83%（n=5/6）(表S3). 第一个未能生成类器官培养物的标本是从一名接受新辅助化疗的患者身上获得的，该标本的组织学检查显示其广泛坏死。第二个没有生成类器官培养物的标本主要由基质细胞组成，没有足够的活肿瘤细胞来建立培养物。虽然hN类器官具有简单的立方形态，但hT类器官具有不同程度的发育不良的高柱状细胞，类似于低级PanINs(图3A). hT类有机物可耐受从培养基中提取某些生长因子(图3B和3C).

85%的胰腺癌患者没有资格进行肿瘤手术切除(Ryan等人，2014年). 因此，我们确定了hT类器官是否可以由使用细针穿刺（FNA）的内窥镜活检提供的有限数量的细胞材料产生。最初试图从FNA活检中生成类有机物的尝试因消化过程中细胞物质的损失而受阻。在优化这些条件后，从两个在Matrigel中悬浮前未分离的标本中生成人类FNA活检类器官（hFNA）(图3A和第3章). 该方法广泛适用于PDA患者，并可实现连续采样。

对2000个癌相关基因进行了针对性的hN和hT类器官的测序。正如预期的那样，在hN类器官培养物中未检测到突变。这些分析确定了致癌KRAS公司大多数肿瘤衍生样本（n=8）的突变，以及TP53型（n=7）、SMAD4（n=5）,和CDKN2A型（n=4）(图3D,表S4). 我们还注意到已知癌基因的扩增，例如MYC公司（n=4），以及肿瘤抑制因子的丢失，包括TGFBR2型（n=3）和DCC公司（n=5）。重要的是，相同KRAS公司在几种hT类器官中观察到的突变在其来源的初级PDA中得到证实(表S4). 致癌基因的等位基因频率KRAS公司hT1–hT5和hFNA2的变异范围约为50-100%。相比之下KRAS公司G12伏hFNA1的等位基因频率仅为1%(表S4)这可能是野生型导管细胞共存的结果。While期间KRAS公司hT8未检测到突变(图3D,表S4)已知PDA基因的突变(ARID1A公司和MLL3级)表明hT8含有恶性细胞，尽管没有KRAS公司突变(表S4).

为了进一步描述原发性PDA器官中存在的细胞类型，我们评估了胰腺谱系标记物的表达。hN和hT类器官表达导管细胞标记，但不表达其他胰腺谱系(图4A). hT类器官的核型是高度非整倍体，而hN类器官主要是稳定的二倍体(图4B). PDA相关生物标志物CA19-9(马科维茨基，1986年)相对于hN类有机物，hT也升高(图4C). 因此，hN和hT类器官反映了正常和肿瘤性人类胰腺导管细胞，并为在更复杂的人类癌症遗传背景下探索胰腺癌生物学提供了一个模型系统。

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人体类器官的分子特征与原位移植

（A） hN（n=3）和hT（n=4）类器官中胰腺谱系标记的qRT-PCR。将平均表达水平归一化为全胰腺。误差条描述SEM。

（B） 人类类器官（2hN，2hT）在指定代次的核型分析（P）。

（C） hN、hT或hM类有机物中的CA19-9和肌动蛋白水平。实线表示非全等车道。

（D） 原位hT2移植和原发性肿瘤的H&E、Alcian Blue染色和IHC。比例尺，200μm（顶部两个面板）和50μm（底部两个面板。

另请参见图S4和表S4D

原位移植后努/努在小鼠中，hN类器官以低效率产生正常的导管结构（n=2/23），而hT类器官在一个月内有效地产生一系列低级别和高级别的导管外PanIN样病变（n=9/12）(图4D,S4A系列,表S4). hT衍生的移植最初形成界限清楚的中空病变，由单层柱状上皮细胞和顶端粘液构成，细胞核位于基底，相对均匀。细胞核较小，缺乏侵袭性PDA常见的多形性和深染性。这些病变在几个月内发展为浸润性癌，由界限不清的浸润性腺体组成(图4D,S4A系列,表S4). hT衍生的PanIN样结构和PDA中存在显著的促结缔组织增生反应，包括富含胶原蛋白的基质沉积和αSMA阳性细胞的募集(图S4B). 突变或丢失TP53型或座椅模块组件4在这些肿瘤中，IHC也检测到hT1和hT2(图S4C,表S4). 总的来说，hT类器官代表了人类胰腺癌进展的可移植模型。

小鼠胰腺导管类器官的基因表达分析提示PDA进展的候选基因

小鼠类器官由同基因小鼠制备而成，能够识别类器官中的基因表达变化，并确定这些变化是否与PDA进展相关。我们从mN（n=7）、mP（n=6）和mT（n=5）类有机物中获取RNA，并生成了链特异性RNA-sequencing（RNA-seq）文库。序列被映射到小鼠基因组的mm9版本，并测定了29777个小鼠基因的相对转录物丰度（百万分之转录物）(表S5). 主成分分析表明，mN类有机物与mP和mT类有机物不同(图5A和表S5).

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小鼠类器官基因表达分析揭示与胰腺癌进展相关的遗传变化

（A） mN、mP和mT类有机物基因表达数据的主成分分析。

（B） 差异表达的基因数量（DESeq调整第页值<0.05）。

（C） 热图显示了mN、mP和mT类器官之间使用Z评分归一化的相对表达水平。显示Z分数的颜色键。

（D） 维恩图显示，相对于mN类有机物，mP和mT中差异表达的基因重叠显著。这个第页重叠值通过双尾Fisher精确检验确定。

（E） 与mN类有机物相比，mP或mT折叠变化最大的基因。

（F） mN、mP和mT类器官基因表达变化的qRT-PCR验证。将数值归一化为mN类有机物的平均水平。n=8 mN、7 mP和8 mT类有机物培养物。误差条显示SEM。*、**、***、，纳秒：第页<0.05、0.01、0.001，或双尾学生的差异不显著吨-测试。

另请参见图S5和表S5.

确定了mN、mP和mT类有机物水平差异显著的基因。相对于mN类有机物，在mP中发现772个基因下调，863个基因上调(图5B和表S5). 当将mT类有机物与mN类有机物进行比较时，2721个基因表达下调，2695个基因表达上调。此外，相对于mP类器官，mT中有823个基因下调，640个基因上调。在数据集中发现了不同的基因表达模式(图5C). 与mN类有机物相比，mP中差异表达的大多数基因在mT中的变化与mN有机物类似(图5D). 然而，相对于mN而言，mT中的基因表达变化要比相对于mN类器官的mP中的大得多(图5D)，表明mP类有机物代表mN和mT类有机物之间的中间状态。

糖基转移酶Gcnt3公司和推测的蛋白质二硫异构酶年龄2是mP和mT类有机物中表达量最高的基因之一，已证明在人类PDA中表达量升高(图5E) (Dumartin等人，2011年;赵等，2014). 相对于mN类有机物，mP和mT中上调最多的基因是酰基辅酶A合成酶Acsm3公司(图5E). 40个基因中的35个通过qRT-PCR证实了RNA-seq结果(表S5)包括上调年龄2,Acsm3公司,全球碳纳米管1,Gcnt3公司、和Ugdh公司以及下调Ptprd公司mP和mT类器官中的基因(图5F和表S5). 在mP和mT相对于mN类有机物上调的基因中，全球碳纳米管1,Gcnt3公司,Acsm3公司,年龄2,系统16,Nt5e号、和Ugdh公司在Ad-Cre诱导癌基因表达后上调喀斯特G12D系列,表明这些基因在突变株下游被激活喀斯特G12D系列(图S5A). 确定类器官RNA-seq图谱是否与基因表达模式相似体内，我们将我们的器官样RNA-seq数据与已发表的小鼠胰腺肿瘤转录谱进行了比较喀斯特G12D系列灭活(Ying等人，2012年). 致癌Kras激活时差异表达的基因与mP或mT中相对于mN类有机物上调或下调的基因显著重叠(图S5B). 这些分析证明了类器官系统识别PDA进展相关分子改变的能力。

小鼠胰腺导管类器官的蛋白质组变化预测PDA进展相关的途径

作为研究小鼠胰腺类器官分子变化的正交方法，我们对mN（n=5）、mP（n=4）和mT（n=6）类器官的整体蛋白质组进行了表征。蛋白质裂解物使用胺反应等压标签进行相对和绝对定量（iTRAQ）质谱分析(Wiese等人，2007年). 样本在四个8丛实验中运行，并使用一种方法进行合并，该方法将数据标准化为所有实验中包含的常见样本(补充实验程序). 合并后，在所有样本中对6051种独特的蛋白质亚型进行了量化。我们对归一化强度峰值进行了线性回归建模，确定了mN和mP类有机物之间710个蛋白质亚型表达的变化(图6A). 1047个蛋白亚型改变了mN和mT类有机物的表达，在mP和mT之间鉴定出63个差异表达蛋白(图6A). 在mP和mT类有机物之间发现的相对较少的蛋白质表达变化反映了mP和mT之间的生物学相似性(图S6A).

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小鼠类器官的蛋白质组分析揭示了与胰腺癌进展相关的分子途径

（A） 通过iTRAQ蛋白质组学分析小鼠类器官的蛋白质表达变化。包括由同一基因编码的独特蛋白质亚型和蛋白质亚型（经调整第页线性回归分析值<0.1）。

（B） 不同（经调整）的独特蛋白质亚型的热图第页值<0.05）。显示Z分数的颜色键。

（C） 显示差异表达蛋白质之间重叠的维恩图(第页<0.05），相对于mN类有机物，在mP和mT中。第页重叠值通过双尾Fisher精确检验确定。

（D） Venn图显示通过RNA-seq和蛋白质组学分析发现的差异表达的基因和蛋白质之间的重叠（调整第页< 0.05).第页重叠值通过双尾Fisher精确检验确定。

（E） 通过对RNA-seq和蛋白质组数据的GSEA分析发现丰富的分子通路。标准化浓缩分数（NES），第页和q个显示值。

（F） 热图显示了由RNA-seq测定的mN、mP和mT类器官中核穿孔蛋白的相对基因表达水平。显示Z分数的颜色键。

另请参见图S6,表S6和第7部分.

mN类有机物与mP和mT类有机物相比具有独特的蛋白质组特征(图6B和6C). 为了比较蛋白质组和RNA-seq数据，我们将独特的蛋白质亚型分解为相应的4155个基因。一些蛋白质表达的变化（例如，下调的mP蛋白为123/150，上调的mP蛋白质为96/151）没有反映相应的转录变化，这表明蛋白质稳定性可能在癌症进展中发挥作用，特别是在mP类有机物中(图6D). 尽管如此，蛋白质组数据验证了RNA-seq鉴定的许多表达变化(图6D)包括上调Gcnt3、Agr2和Ugdh(表S6). 此外，通过质谱法测量的1599个基因的mT表达水平相对于mN类器官发生了变化，其中301个（19%）显示出相应的蛋白质变化(图6D).

RNA-seq和蛋白质组数据的基因集富集分析（GSEA）(Subramanian等人，2005年)与mN类有机物相比，mP中谷胱甘肽代谢和生物氧化相关的基因和蛋白质表达增加(图6E,S6B、S6C,表S7)与之前报道的活性氧代谢升高相一致喀斯特G12D系列单元格(DeNicola等人，2011年;Ying等人，2012年). 与mN类有机物相比，mT中还发现谷胱甘肽代谢相关的蛋白质富集(表S7). 此外，我们还鉴定了与类固醇生物合成、胆固醇生物合成、叶酸碳库和嘧啶代谢途径有关的蛋白质的显著正富集(图6E,S6B、S6C,表S7)，与之前的报告一致(Ying等人，2012年). 与mN类有机物相比，mP中富集了类似的途径（胆固醇生物合成、叶酸碳库和嘧啶代谢）(图S6B和S6C,表S7)脂肪酸代谢和TCA循环/呼吸电子传递途径下调(图S6B和S6C,表S7). 合成代谢途径的增加和分解代谢途径的减少表明，脂肪酸代谢在PDA进展期间发生复杂变化。

有趣的是，我们还发现，相对于mN类有机物，mT中的核穿孔蛋白家族在RNA和蛋白质水平上广泛上调(图6F,表S6). 单个核孔蛋白NUP214、NUP153和NUPL1先前在胰腺癌细胞系的shRNA缺失筛查中发现(Cheung等人，2011年;Shain等人，2013年). 此外，在人PDA癌细胞系中检测到NUP153的扩增，在人原代PDA中检测到了NUP88的升高(Cheung等人，2011年;Gould等人，2000年;Shain等人，2013年). 对胰腺类器官分子改变的系统分析表明，核转运是与胰腺癌进展相关的途径。

体内小鼠和人类验证与类器官PDA进展相关的候选者

为了证明小鼠类器官培养系统是准确发现PDA进展相关基因的生物资源，我们选择了16个mT类器官中上调的基因，通过IHC和免疫荧光（IF）在初级组织样本中进行验证(图7A). 这16个基因包括酶、膜蛋白、结构蛋白和分泌配体，可以代表候选生物标志物和治疗靶点。在小鼠胰腺组织切片上产生可检测信号的14种抗体中，13种抗体证实mPanIN和mPDA损伤中候选蛋白的表达增加，与RNA-seq和蛋白质组数据一致(图7A、7B和S7A系列). 13种候选抗体中有11种与人体组织中的评估相一致，其中7种候选抗体与正常胰腺导管组织相比在人PDA中上调(图7C、7D和S7B系列). 许多这些标记物的高表达在hT类器官原位移植到努/努老鼠(图7C). 这些结果表明，类器官培养系统准确地模拟了PDA的进展，并可作为发现和遗传解剖人类胰腺肿瘤发生途径的资源。

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ACSM3、NT5E和GCNT3水平升高与小鼠和人类PDA进展相关

（A） 小鼠邻近正常导管、mPanlN和mPDA中14个候选基因的IHC分析。差异表达表示为：-（阴性）、+（弱）、++（中度）或+++（强）。

（B） 小鼠正常导管、mPanlN和mPDA组织中ACSM3、NT5E和GCNT3的IHC分析。箭头表示mPanlN组织中相邻的正常导管。箭头表示mPanlN或mPDA。比例尺，50μm。

（C） 人正常胰腺、hT原位移植和PDA组织中7个候选基因的IHC分析。差异表达表示为：-（阴性）、+（弱）、++（中度）或+++（强）。仅对正常胰腺的导管部分进行评分。

（D） 人类正常胰腺和PDA组织中ACSM3、NT5E和GCNT3的IHC分析。箭头表示正常管道，箭头表示PDA。比例尺，50μm。

另请参见图S7.

讨论

我们已经建立了胰腺类有机物作为一种易处理和可移植的系统，以探索小鼠和人类肿瘤进展的分子和细胞特性。与以前的报告相比(Agbunag和Bar-Sagi，2004年;Rovira等人，2010年;Seaberg等人，2004年)，我们的培养条件阻止了正常导管细胞的快速耗尽在体外，并在原位移植后生成正常的导管结构。重要的是，通过正常和肿瘤导管细胞的传代和移植，可以对分子通路和细胞生物学进行详细分析，这在新生儿胰腺碎片在气液界面中繁殖或使用诱导多能干细胞时是不可能的(Agbunag和Bar-Sagi，2004年;Kim等人，2013年;Li等人，2014年). 例如，我们发现核孔蛋白在肿瘤小鼠器官中广泛上调，再加上核孔蛋白与细胞增殖和细胞转化的已知关联，提出了一类研究胰腺癌进展的蛋白质(Gould等人，2000年;科勒和赫特，2010年). 此外，系统地描述缺乏KRAS突变的人类胰腺癌类器官的能力，如hT8，将揭示PDA的驱动基因。最后，由于器官样物质可以很容易地从小患者活检中确定，因此应加快胰腺癌患者个性化方法的开发。

实验程序

动物

Trp53基因+/LSL-R172H型，克拉斯+/LSL-G12D型和Pdx1-芯将C57Bl/6背景的菌株进行杂交，获得Pdx1-芯；喀斯特+/LSL-G12D型（KC）和Pdx1-芯；喀斯特+/LSL-G12D型; Trp53基因+/LSL-R172H型（KPC）小鼠(Hingorani等人，2005年). 这个26兰特LSL-YFP公司菌株进行杂交以获得所需的基因型。C57Bl/6和非对称努/努小鼠购自查尔斯河实验室和杰克逊实验室。所有动物实验均按照冷泉港实验室（CSHL）IACUC批准的程序进行。

小鼠胰腺导管类器官培养及分析

分离正常胰腺导管的详细程序已在前面描述过(Huch等人，2013年a). 简而言之，在含有1%FBS（Gibco）的DMEM培养基中，用0.012%（w/v）胶原酶XI（Sigma）和0.012%（w/v）dispase（Gibco）对胰腺进行酶消化后，手动提取正常和癌前胰腺导管，并接种在生长因子减少（GFR）Matrigel（BD）中。对于肿瘤和转移，将大块组织切碎，用胶原酶XI和dispase消化过夜，并嵌入GFR基质中。所有RNA-seq数据可在GEO上以登录号获得GSE63348标准蛋白质组学原始数据可从PeptideAtlas获得，登录号为PASS00625。

人体标本

胰腺癌组织和邻近正常胰腺取自在乌得勒支大学医学中心医院、斯隆凯特林纪念癌症中心（MSKCC）、安德森癌症中心（MDACC）和威尔康奈尔医学院（WCMC）接受手术切除的患者。伊利诺伊大学芝加哥分校和迈阿密大学米勒医学院的胰岛移植项目也获得了正常的胰腺组织。所有人体实验均由乌得勒支大学医学中心伦理委员会或MSKCC、MDACC、WCMC和CSHL的IRB批准。在获取标本之前，获得了捐赠者对本研究中组织研究用途的书面知情同意。根据病理评估，样本被确认为肿瘤或正常。

人胰腺肿瘤与正常器官样细胞培养及分析

将肿瘤组织切碎，并在37°C下用胶原酶II（5 mg/mL，Gibco）在人类完全培养基（见下文）中消化最多16小时。将材料在37°C下用TrypLE（Gibco）进一步消化15分钟，包埋在GFR Matrigel中，并在人类完全培养基[AdDMEM/F12培养基中培养，补充HEPES（1x，Invitrogen）、谷氨酰胺（1x）、青霉素/链霉素（1x、Invitrogen）、B27（1x和Invitrogin）、Primocin（1mg/ml，InvivoGen）、N-乙酰-L-半胱氨酸（1 mM，Sigma）、Wnt3a条件培养基（50%v/v）、RSPO1-条件培养基，烟酰胺（10 mM，Sigma）和A83-01（0.5μM，Tocris）]。

除胶原酶消化在大豆胰蛋白酶抑制剂（1 mg/ml，Sigma）存在下最多2小时外，正常样品按上述方法处理。消化后，将细胞嵌入GFR基质中，并在添加PGE2（1μM，Tocris）的人完全培养基中培养。目标DNA测序数据可在Ensembl获得，注册号为ERP006373。

其他实验细节和方法可以在补充扩展实验程序.

补充材料

1

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2

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三

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4

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5

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6

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7

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S1（第一阶段）

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S2系列

单击此处查看。（740万，蒂夫）

第3章

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S4系列

单击此处查看。（1100万，tif）

第5章

单击此处查看。（996K，tif）

S6系列

单击此处查看。（230万tif）

第7部分

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补充信息

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致谢

我们感谢Inspire 2 Live的Peter Kapitein和Jan Schuurman帮助DAT和HC建立合作关系。我们还感谢H.Begthel和J.Korving提供的技术援助。这项工作是在CSHL蛋白质组学、组织学、DNA测序、抗体和生物信息学共享资源的协助下完成的，这些资源由癌症中心支持基金5P30CA045508提供支持。DAT是Lustgarten基金会的杰出学者，也是Lustgaerten基金会胰腺癌研究指定实验室的主任。DAT还得到了冷泉港实验室协会、类癌基金会、PCUK和MSKCC的David Rubinstein胰腺癌研究中心的支持。此外，我们感谢以下各方的支持：挺身而出抗癌/KWF（HC）、STARR基金会（I7-A718用于DAT）、DOD（W81XWH-13-PRCRP-IA用于DAT，Sol Goldman胰腺癌研究中心（RHH）、意大利卫生部（FIRB-RBAP10AHJ用于VC）、Sociedad Española de Oncología Médica（SEOM用于MPS）、，路易·莫林慈善信托基金会（MEF）、瑞典研究委员会（537-2013-7277，代表D）、肯贝基金会（JCK-1301，代表D \58405;）和瑞典医学会（SLS-326921，SLS-250831，代表D\58404;），达蒙·润扬癌症研究基金会（DRG-2165-13，代表IICC），人类前沿科学计划（LT000403/2014，代表EE），魏茨曼科学研究所女性科学奖（EE）、美国癌症协会（PF-13-317-01-CSM for CMAA）、赫斯特基金会（AHS）和NIH（5P30CA45508-26、5P50CA101955-07、1U10CA180944-01、5U01CA168409-3和1R01CA190092-01 for DAT）；CA62924 for RHH；CA134292 for SDL；5T32CA14856 for LAB和DDE；CA101955实验室UAB/UMN孢子）。此外，SFB和MH由KWF/PF-HUBR 2007-3956支持，A.G由EU/232814-StemCellMark支持，RGJV由GenomiCs.nl（CGC）支持。MJ、RB和EC得到CancerGenomics.nl（NWO Gravity）计划的支持。

脚注

利益冲突：

Ralph Hruban博士从Myriad Genetics获得PalB2发明的专利使用费。

Hans Clevers博士和Meritxell Huch在有机物技术方面拥有正在申请和授予的专利。

作者贡献：

SFB公司：启动项目，开发了分离小鼠和人类有机物的方法，以人类有机物为特征：图1A,​,3,三,4B、4D,S4C系列,表S3和S4系列.

中国：开发器官类移植模型，进行shRNA敲除、组织学和核型分析：图1A、1E、1G,2A、2C–E,​，4D中，4D（四维）,​,7;7;S1A–C级,S2A–F、S2H,S4A–B系列,S7A–B级;表S1,S2系列,S4系列.

实验室：对小鼠类器官进行RNA测序，分析RNA-seq和蛋白质组数据：图5,​,6,6,5亿,S6系列;表S5,S6系列,第7部分

IICC公司：小鼠类器官的蛋白质组评估，分析蛋白质组数据：图6.

DDE公司：开发小鼠类器官方法并评估人类类器官中的CA19-9水平：图1A,​、2A、，2安培,​、4C、，4摄氏度,第3章,S6系列,表S6.

风险资本：开发人类类有机物方法，进行类有机物分子分析，制备DNA测序材料，Kras测序：图1C-D,3A、3D,​、4A、，4A级,S1D–F级,第5页;表S3,S4系列,第5章.

乔丹：人类类有机物的DNA测序：图3D,表S4.

其他贡献者：

小鼠和人类类有机物的制备和表征：MPS、HT、MSS、TO、DØ、AHS、CMAA、ML、EE、BA、MEF、GY、GB、BD、BC、KW、KHY、YP、EC、MH、AG、RVB、FHMM、SL

序列分析：YH、YJ、MH、IN

病理分析：GJO、RHH、DK、OB、CID

手术切除和组织剥离：IQM、IHBR

蛋白质组开发：DJP、KDR、JPW

总体研究管理：DAT、HC、RGJV

手稿撰写：SFB、DDE、LAB、MEF、CH、HT、VC、MPS、RGJV、HC、IICC、DAT

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出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们提供这份手稿的早期版本。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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