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.2013年11月19日2:e00940。
doi:10.7554/eLife.00940。

人胰腺导管细胞向胰岛素分泌内分泌细胞的扩增和转化

Jonghyeob Lee先生 1, Takuya Sugiyama先生, 刘英华, 王静（音译）, 顾雪英, 季磊, 詹姆斯·马克曼, 宫崎骏, 宫崎骏一, 格雷戈里·L·绍特, 丽塔·博蒂诺, 金承克
附属公司

人胰腺导管细胞向胰岛素分泌内分泌细胞的扩增和转化

Jonghyeob Lee先生等。 埃利夫. .

摘要

胰岛β细胞功能不全是糖尿病发病机制的基础；因此，从可再生资源中替代功能性β细胞是世界范围内努力的焦点。然而，在体外生产能够根据原始人类细胞的生理信号分泌胰岛素的子代已被证明是难以捉摸的。这里我们描述了原始成人胰腺导管细胞的分离、扩增和转化为类似于天然β细胞的子代。FACS分类的成人导管细胞在培养中克隆性扩增为球形，同时保留导管特征。主要胰岛发育调节因子Neurog3、MafA、Pdx1和Pax6的表达将外分泌管细胞转化为具有标志性β细胞特性的内分泌子代，包括合成、处理和储存胰岛素的能力，并根据葡萄糖或其他去极化刺激分泌胰岛素。这些研究提供了证据表明，对具有特定因子的可膨胀人类胰腺细胞进行基因重组可能是糖尿病患者胰岛置换的一般策略。内政部：http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00940.001。

关键词：β细胞；转换；糖尿病；胰岛素；胰岛；胰腺。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1。
图1.导管细胞表面标记CD133丰富了分离的成人胰腺的球形细胞。
(A类)左侧面板，游离成人胰腺的FACS图，用CD133特异性抗体染色（灰色）或不染色（蓝色）。右面板，球体文化系统示意图和一个代表性的球体文化。(B类)CD133生成球体的量化+，CD133否定和未排序的单元格。数据表示为平均值±SEM（n=4）。(C类)用导管标记物KRT19（红色）和C肽（红色）对成人胰腺CD133（绿色）进行免疫染色。(D类)FACS分类的成人胰腺细胞和分离胰岛的基因表达谱（胰岛值标准化为1）。数据表示为平均值±SEM（n=3）。(E类)带有KRT19（绿色）或C肽（绿色）的分选细胞的代表性免疫染色图片。(如果)FACS后细胞免疫染色定量≥每个染色条件下计算7200个细胞。n.d.=未检测到。比例尺，50µm。另请参见补充文件1D。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00940.004
图1——图补充1。
图1补充图1。分类CD133+细胞来源于胰腺导管。
(A类)实验程序示意图。如前所述，将分离的胰腺细胞嵌入并培养（Lawson等人，2007年）。比例尺，200µm。(B类)成人胰腺组织中CD133（绿色）和CPA1（红色）共同染色的共焦图像。比例尺，20µm。(C类)CEL公司FACS分类的成人胰腺细胞和分离胰岛的表达谱（胰岛值标准化为1）。数据表示为平均值±SEM（n=3）。(D类)分选细胞的代表性免疫染色图片。比例尺，50µm。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00940.005
图2。
图2导管球的克隆扩张和传代。
(A类)用KRT19、CD133、Ki-67和磷酸组蛋白H3免疫染色的2周龄球体的共聚焦图像（均为绿色）。注意CD133的顶端定位。比例尺，50µm。(B类)单细胞球体形成的代表性延时图像（箭头）。显示了连续9天每12小时拍摄的图像。箭头指向一个用作地标的非球体形成单元(C类)每段文章后面的球体的代表性图片。比例尺，100µm。(D类)每个指定通道后球体中细胞数量的量化。Y轴表示相对于第一代球体（G1）中测得的细胞总数的倍数增加。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00940.006
图2——图补充1。
图2-图补充1。球体生长和通过的量化。
(A类)人类球体的代表性图像在培养基中生长了2周。注意不同的球体尺寸。比例尺，100µm。(B类)图2A所示Ki-67表达细胞的数量占总细胞数的百分比。每片玻片中有200多个细胞，每个样品中有三个或更多玻片。数据表示为平均值±S.D(C类)图2D所示单个样品每一通道中总细胞数的量化。Y轴表示相对于第一代球体（G1）中测得的细胞总数的倍数增加。(D类)用KRT19（红色）和CD133（绿色）联合免疫染色的G1和G7球体的典型共焦图像。比例尺，50µm。(E类)CD133总细胞数的量化+G1和G7球体中的细胞。数据表示为平均值±S.D。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00940.007
图3。
图3 Neurog3足以将胰腺导管球转化为表达激素的内分泌样细胞。
(A类)生长和重新编程策略示意图。有关详细信息，请参阅“材料和方法”。(B类)使用的腺病毒构建体示意图。(C类)Neurog3靶点的相对mRNA水平(神经元1，INSM1、和射频6)，内分泌细胞特异性基因(PAX4、NKX2.2、和CHGA公司)和胰腺激素(不锈钢和GHRL公司). 数据表示为平均值±SEM（n≥3）。(D类)用小鼠Neurog3、NEUROD1、NKX2.2、SST和GHRL特异性抗体免疫染色后，Ad-RFP-Neurog3感染球体的典型共焦图像。注意，所有激素阳性细胞均为CHGA阳性。右：SST和GHRL的共同染色。比例尺，20µm。(E类)染色结果的量化(D类). 饼图表示荷尔蒙的百分比+细胞。(如果)感染Ad-RFP-Neurog3腺病毒（红色）或未感染对照（灰色）的游离导管球的典型FACS图。根据RFP荧光强度对P1至P5组分进行分类。(G公司)来自(如果). ‘U’表示未排序的单元格。显示了分析副本。数据以平均值±标准差表示。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00940.008
图3——图补充1。
图3-图补充1。感染对照病毒（Ad-RFP）球体的典型共焦图像。
（A） 用小鼠Neurog3、NEUROD1、NKX2.2、SST和GHRL特异性抗体进行免疫染色后，控制病毒（Ad-RFP）感染球体的典型共焦图像。右：免疫染色检测共表达SST和GHRL的细胞。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00940.009
图4。
图4.四种转录因子的诱导（Neurog3、MafA、Pdx1和Pax6）产生胰岛素+体外胰腺导管球中的内分泌细胞。
(A类)使用的腺病毒示意图。(B类)INS（惯性导航系统）qRT-PCR分析感染对照组（R=RFP）或MafA（M）、Neurog3（N）和Pdx1（P）（MNP）组合的人类球体N=4。(C类)qRT-PCR分析INS（惯性导航系统）,不锈钢、和CHGA公司带有新分拣的CD133+用编码Neurog3或所有四个基因（4V）的腺病毒感染的导管细胞（n＝2）。(D类)感染腺病毒组合的球体的qRT-PCR分析。第6页缩写为'6'，（n≥3）。(E类)用4V感染的球体的qRT-PCR分析减去每个指示因子n＝2。所有条形图数据均以平均值±SEM表示，纯化成人胰岛的mRNA水平标准化为1。(如果)用识别C肽的抗体染色后感染球体的共焦图像。注意，腺病毒编码神经元3（N） 和Pdx1页（P） 也表示RFP。比例尺，20µm。(G公司)定量感染所示腺病毒组合的球体中CHGA-、SST-和C-肽免疫活性细胞。请注意，4V中C肽阳性细胞的数量比MNP增加了18–20倍。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00940.010
图4——图补充1。
图4补充了腺病毒组合球形感染后的GCG、PPY和PAX6 mRNA水平。
(A类)感染腺病毒组合的球体的qRT-PCR分析。PAX6缩写为'6'，（n≥3）。请注意PAX6qRT-PCR探针识别内源性和外源性PAX6mRNA。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00940.011
图5。
图5诱导的胰岛素分泌细胞类似于功能性β细胞。
(A类)使用的腺病毒结构示意图。详见“材料和方法”和图5补充图5。(B类)生长、转化和成熟过程的示意图。(C类)经扩大培养后感染Ad-eGFP（黑色）或Ad-4TF（灰色）的球体的qRT-PCR分析。数据标准化为成人胰岛样本（红色虚线）。(D类)用所示抗体免疫染色的4TFM球的典型共焦图像。比例尺，20µm。(E类)GFP、4TF、4TFM球体和成人胰岛中总胰岛素原和C肽含量的定量（顶部）。总蛋白质水平（pmol）通过总基因组DNA含量（µg）进行标准化。胰岛素原和C肽含量的比率以%表示（底部）。转速=球体。(如果)4TFM球体的典型电子显微镜图像。白点线标记了转化细胞、颗粒细胞（左侧）和非转化细胞（右侧）之间的细胞边界。转化细胞中具有不同形态的致密核心囊泡如右图所示。比例尺，1µm。(G公司)由指定促分泌剂和药物刺激的4TFM球的人C肽分泌测定。Gluc=葡萄糖，Tol=甲苯磺丁脲，直径=重氮氧化物。数据表示为平均值±SEM（对于直径，n=2；对于所有其他条件，n≥3）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00940.012
图5——图补充1。
图5补充1。诱导胰岛素分泌细胞的表型。
(A类)qRT-PCR分析INS（惯性导航系统）和IAPP公司带有GFP、4TF或4TFM球体。请注意，来自扩展培养物（4TFM）的球体显著增加了INS（惯性导航系统）和IAPP公司（n=6）。(B类)4TFM球中CHGA和C肽免疫活性细胞的定量。(C类)4TFM球体与NKX6.1和SST的典型共焦图像。注意不重叠的染色。蓝色=DAPI。(D类和E类)电子显微镜的代表性图像。(D类)靠近质膜的致密核心小泡。(E类)罕见的细胞含有形状不规则的小泡，类似δ细胞。(如果)本研究使用四种不同的培养基。有关详细信息，请参阅“实验程序”。(G公司)C肽分泌量显示为总C肽含量的百分比（n=4）。(H（H）)葡萄糖浓度逐步升高的人C肽分泌试验（左）和有无细胞外钙（右）（n≥3）的KCl。所有条形图均以平均值±SEM表示。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00940.013
图5——图补充2。
图5补充图2。移植的IPC长期存活并在葡萄糖刺激下分泌胰岛素C肽。
(A类)用指定抗体免疫染色的肾移植IPC的代表性共焦图像（HuNu=人细胞核特异性抗体）。(B类)IPC-grafted小鼠（ID51）在葡萄糖激发（葡萄糖注射）前（禁食）或30分钟后血清中的人胰岛素水平。数据表示为平均值±S.D(C类)用指定抗体免疫染色的肝移植IPC的代表性共焦图像。(D类)移植到指定部位（肾脏或EFP）并用指定抗体进行免疫染色的人类胰岛的典型共焦图像。(E类)葡萄糖激发前（灰色）或激发后30分钟（黑色）人胰岛颗粒小鼠血清中的人胰岛素水平。数据以平均值±标准偏差比例尺表示，20µm。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00940.014
图5——补充图3。
图5补充图3。成熟期后外源因子的持续表达。
(A类)针对所用腺病毒构建物设计的qRT-PCR探针示意图。(B类)感染Ad-eGFP（eGFP）或Ad-Neurog3-IRES-eGFP和Ad-eGFP-M6P（4TF）的球体的qRT-PCR，有或没有扩展培养。注意，胰岛素表达显著升高，与转基因表达无关。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00940.015
图5——补充图4。
图5补充图4。人类皮肤成纤维细胞的转化。
感染Ad-eGFP（GFP）或Ad-Neurog3-IRES-eGFP和Ad-eGFP-M6P（4TFM）并培养的人皮肤成纤维细胞或球体的qRT-PCR。qRT-PCR探针INS（惯性导航系统）(A类)和CHGA公司(B类)用于评估细胞转化。有关详细信息，请参阅“材料和方法”。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00940.016
图5——补充图5。
图5补充图5.病毒转基因的蛋白质表达。
(A类)使用的腺病毒结构示意图。为了将病毒转基因与内源性编码蛋白区分开来，MAFA、PAX6和PDX1分别用Myc（N末端）、HA（C末端）和Flag（C-末端）进行epotpe-标记。(B类)4TFM球体与抗小鼠Neurog3、Myc、HA和Flag抗体的典型共焦图像。比例尺，20µm。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00940.017
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    1. Alipio Z、Liao W、Roemer EJ、Waner M、Fink LM、Ward DC等，2010年。使用诱导多能干细胞（iPS）衍生的胰岛β样细胞逆转糖尿病小鼠模型中的高血糖。美国国家科学院院刊107:13426–31.10.1073/pnas.1007884107-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Ashcroft FM，Rorsman P.2012。糖尿病与β细胞：过去十年。手机148:1160–71.10.1016/j.Cell.2012.02.010-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Benitez CM、Goodyer WR、Kim SK，2012年。解构胰腺发育生物学。冷泉港展望生物4:a012401.10.1101/cshperspect.a012401-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Blum B、Hrvatin SS、Schuetz C、Bonal C、Rezania A、Melton DA。2012年。功能性β细胞成熟的标志是葡萄糖阈值增加和尿皮质醇3的表达。国家生物技术30:261–4.10.1038/nbt.2141-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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