结果
识别和靶向功能不同的高级皮质区
我们使用以下方法描述了清醒小鼠视觉皮层区域神经元的功能特性（另请参阅实验程序）。首先，我们在视觉皮层上植入了一个5毫米的颅骨窗。恢复后，小鼠逐渐习惯头枕(安德曼等人，2010年)同时可以在单轴轨迹球上自由行走（实验程序）。然后，我们对固有的自体荧光信号进行宽视野成像，以获得多个视觉区域的视网膜主题图(和图S1在线可用；卡拉茨基和斯特里克，2003年;Schuett等人，2002年; 囊性纤维变性。Wang和Burkhalter，2007年). 随后，我们在麻醉下取出颅骨窗，并注射腺相关病毒AAV2/1-突触素-1-GCaMP3位于皮质表面以下250µm深度处，以获得钙指示剂GCaMP1的神经元特异性表达(Tian等人，2009年;Dombeck等人，2010年;O'Connor等人，2010年)在一个或两个视觉皮层区域中近似匹配的视网膜异位位置。细胞GCaMP3荧光的变化提供了与神经放电率增加相关的视觉驱动的钙内流增加的估计(Tian等人，2009年; 实验程序）。我们使用宽场钙成像测量了大脑皮层区域的人群视觉反应()然后使用双光子钙成像对单个神经元进行更详细的映射(–). 具体来说，我们评估了神经元在多个刺激维度上的调谐，包括空间和时间频率、速度、方向和运动方向。中的调整估计–包括所有试验，与鼠标是移动还是静止无关，因为运动对调谐没有很大影响（参见,S2系列、和S6系列，见下文）。
清醒小鼠的宽视野功能成像显示不同视觉区域的差异（A） 为了将钙指示剂的表达靶向更高的视觉区域，我们首先绘制了清醒小鼠在上视野两个空间位置（14°仰角；60°或96°方位角；底部面板A中较暗的区域反映了96°时对刺激的区域反应）。使用对两个刺激位置的反应的蓝色/红色伪彩色图像生成视网膜图（A，上图）。这些图可靠地描绘了初级视觉皮层（V1）和几个高级视觉区域（LM：侧内侧；AL：前外侧；RL：头外侧；A：前；AM：前内侧；PM：后内侧；比较。Wang和Burkhalter，2007年). 请参见图S1了解更多详细信息。
（B） 对于空间频率（左侧面板）和时间频率（右侧面板）不同的刺激，外侧视觉区域（顶部面板，参见A中的米色矩形）和内侧视觉区域（底部面板，参见B中的橙色矩形）之间的固有自体荧光信号差异。数据在三次成像过程中取平均值（与A中的鼠标相同）。注意，V1、LM和AM区域的反应相似，而AL和PM区域的反应不同。
（C） GCaMP3钙指示剂在AL和PM区域的靶向病毒表达（紫色和绿色虚线区域）。
（D） 使用宽场GCaMP3成像的平均钙反应（较轻的斑点）证实，在600µm宽的感兴趣区域中，包括AL区域（上图）和PM区域（下图），在空间和时间频率调谐方面存在明显差异。高斯平滑：σ=12µm。ΔF/F：荧光变化百分比。黄色对角线是等速线。刻度条（A）和（C），1 mm。
空间和时间频率响应的细胞成像（A） 基线双光子荧光体积（GCaMP3）的最大强度投影，记录在同一只小鼠的AL区（左侧面板）和PM区（右侧面板）。比例尺，50µm。中间面板：AL和PM区域靶向GCaMP3表达的外荧光图像（绿色光晕），叠加在亮场图像上。比例尺，1 mm。
（B和C）在以不同的空间和时间频率呈现刺激期间，来自区域AL（B）和PM（C）的单个神经元（A中的黄色圆圈）的平均荧光时间过程（上图）。ΔF/F：荧光变化百分比。阴影区域为±SEM。在呈现每个刺激物（蓝色条、顶部面板）期间，荧光的平均变化用于生成响应图（左下面板），然后将其拟合为二维高斯（中下面板）。分别以60%峰值（红色，σ半宽）和88%峰值（蓝色，σ/2半宽）拟合模型的等高线图，覆盖在同一模型拟合上，用较高的采样进行渲染（右下角面板；实验程序）。另请参见图S2.
视觉区域之间方向选择性相似，但方向选择性不相似在第二个方案中，在8个方向和5-6个空间频率中的一个方向上进行刺激。
（A） 顶行：以神经元的首选空间频率进行方向调谐的极坐标图，用于同时记录V1中的神经元。阴影区域为±SEM。右下方的值为最大响应强度（ΔF/F）。中间/底部行：同一只小鼠AL和PM中的神经元示例。
（B） 方向选择性（左侧面板）和方向选择性（右侧面板）在区域之间的分布。
（C） 跨区域的平均方向选择性（顶部面板）和方向选择性（底部面板）。数值为±SEM。细胞数量：V1中78个，AL中40个，PM中43个。另见图S5.
峰值速度的区域差异在很大程度上与运动无关（A） 显示了PM（左侧面板）和AL（右侧面板）中神经元跨时间频率（首选空间频率）的神经响应示例，说明了响应强度（左侧）和首选时间频率和速度（右侧）随运动的变化。
（B和C）如行为条件散点图（B）和人群平均值（C；平均值±SEM；见结果）所示，所有区域的反应强度都有所增加。
（D和E）在散点图（D）和总体平均值（E，顶面板；平均值±SEM，以倍频程为单位；见结果）中也观察到峰值速度小而持续的增加。峰值速度的增加主要是由于首选时间频率的增加（E，中间面板），而不是空间频率的增加。包含的神经元数量：V1为35，AL为27，PM为8。另见图S6和S2系列.
我们首先询问V1区的主要皮质靶区AL、PM和LM区域的神经元对向上驱动正弦光栅刺激的时空频率是否表现出不同的敏感性(; 光栅由一个具有光滑边缘的约40°贴片开窗，中心位于70°–115°离心率处；看见和实验程序）。固有自荧光成像反应(和S1B级)这表明，在这三个较高的视觉区域中，AL和PM区域受到不同时空频率组合的强烈驱动，而LM区域的反应曲线与V1区域的更相似(; 另请参见Van den Bergh等人，2010年;Wang和Burkhalter，2007年). 因此，我们将钙成像实验的目标对准了AL、PM和V1区域().
钙成像期间——整个区域的宽场荧光成像()单个神经元的双光子激光扫描显微镜(–)–我们以五个空间频率和七个时间频率中的一个频率呈现刺激，对应于几乎三个数量级的刺激速度范围。使用宽场钙成像显示了示例小鼠AL和PM区域内GCaMP3标记神经元的平均视觉反应。我们观察到不同地区的时空频率敏感性存在明显差异。具体而言，区域AL倾向于较低的空间频率和较高的时间频率（因此，速度较高），而区域PM倾向于较高的空间和较低的时间频率。虽然宽场成像可以揭示这种群体偏见，但它无法评估单个相邻神经元之间调谐的多样性。因此，我们集中精力对GCaMP3荧光进行双光子细胞成像。
调节单个神经元的速度（A） 顶部面板：黄色等速线，时间频率与空间频率之比固定。底部面板：在空间频率（右下角）上具有相同峰值速度的神经元被“调整速度”（时间和空间频率之间的幂律关系，模型拟合中的指数ξ≈1，见实验程序）。
（B） 顶部面板：PM中的示例神经元，其大致调整为速度（右上角；首选速度的灰条；ξ=1.18），但不调整为时间频率（左上角）。底部面板：AL中的示例神经元未针对速度进行调整（右下角；ξ=−0.07），但针对时间频率进行了调整（左下角；首选时间频率的灰条）。左侧面板中的插图：跨空间和时间频率的细胞响应（参见。).
（C和D）ξ在各区域的分布（C）和平均值（D，平均值±SEM）。仅包括能够准确估计ξ的神经元（即，采样范围中包含峰值空间和时间频率，且空间和时间频宽大于1倍频程采样分辨率的神经元）。
（E） 速度（ξ）与峰值速度调谐的散点图显示了区域内和区域内的反向关系（见结果；黑线：所有区域神经元的最小二乘拟合）。包含的细胞数量：V1中20个，AL中46个，PM中13个。另请参阅实验程序和图S4.
V1、AL和PM区域时空频率调谐的细胞成像
为了确定清醒小鼠区域内和跨区域神经元刺激偏好的多样性，我们使用双光子成像记录了大脑皮层区域V1、AL和PM第II/III层的细胞钙反应(). 我们通过比较双光子图像和宽场图像中的表面血管结构来确定成像体积的精确位置（参见实验程序）。我们以1 Hz的频率同时记录了几十个神经元的钙信号，其体积跨度为～200µm×200µmx45µm（使用压电物镜Z扫描仪；Kerlin等人，2010年). 通过校正成像体积（<10µm）内神经元位置的缓慢漂移，我们能够在数小时内记录来自相同神经元的强烈诱发反应，从而估计单个神经元的空间和时间频率调谐，如图所示（顶部面板）。时间频率平面的空间响应与定向二维高斯拟合(，底部面板；看见Priebe等人，2006年和实验程序），以量化时空频率和速度的调谐。这些估计值是在老鼠静止或在轨迹球上自由行走的试验中获得的。
我们观察到偶尔的大水平眼球运动（>5°）通常与运动的开始有关(图S2). 然而，任何视觉刺激的呈现都不会显著改变运动的概率(图S2D–S2F). 此外，与运动相关的眼球运动方向与这些实验中使用的水平定向正弦光栅平行，这表明它们对调谐的影响很小。事实上，当我们删除了对一部分神经元进行的所有眨眼或大眼运动试验时，反应调节没有什么不同(图S2G和S2H)它也没有受到运动本身的强烈影响（参见,S2系列、和S6系列).
对6只小鼠V1、AL和PM区的241个响应神经元进行了空间和时间频率调谐估计（参见). 同时成像的V1细胞显示出明显不同的刺激偏好(，顶部）。尽管与V1相比，AL和PM神经元之间存在一些反应多样性(、中间和底部）。每个区域中所有模型拟合的等高线图(，左）和频率偏好的散点图(（右）显示V1神经元跨越了广泛的首选空间和时间频率，而AL和PM神经元表现出较少的多样性。AL神经元对高时间频率和低空间频率的反应最好，而PM神经元对低时间频率和高空间频率的响应最好(). 事实上，在成对区域之间（AL与PM、AL与V1、PM与V1，Kolmogorov-Smirnov[K-S]检验），首选空间和时间频率（以及50%的高截止频率）的分布都存在显著差异，除V1与AL的首选时间频率外，所有p值均<0.01，p=0.06；见中位数）。
AL和PM神经元喜欢V1跨越的几乎不重叠的速度范围（A） 每个皮层区域相同局部体积的神经元亚群的反应谱示例。V1中同时记录的神经元通常喜欢非常不同的空间和时间频率组合。相比之下，大多数AL神经元倾向于低空间频率和高时间频率，而PM神经元倾向于高空间频率和低时间频率。蓝色和红色椭圆是模型拟合的轮廓，分别为峰值的88%和60%。
（B） V1、AL和PM种群对时空频率平面的覆盖通过阴影等高线（峰值的88%；左侧面板）和神经元首选时空频率的散点图（右侧面板）进行说明。（A）和（B）中的黄色线表示时空频率平面中的线，该线将反应偏好最佳分类为属于AL或PM神经元（41.9°/s的等速线）。
（C和D）跨区域的中位数优先和高截止（50%峰值响应）空间和时间频率条形图。
（E） 峰值速度分布（首选时间频率与空间频率之比）。较深的条（以及B右侧面板散点图边缘的较深符号）表示神经元具有低或高的空间或时间频率调谐。
（F） 跨区域的中位数峰值速度条形图。（C）、（D）和（F）中的误差条是估计中值的95%置信区间（对数正态分布的最大似然估计）。细胞数：AL中V1107为87，PM中为46。ΔF/F峰值，例如（A）中的神经元，从左上角顺时针方向，V1:28，9，12，27，11，8；铝：56、14、74、22、34、41；下午7点、4点、8点、8点、15点、13点。另请参见图S3.
表1
| #单元格 | #会话 | #老鼠 | 首选SF
（cpd） | TF前缀
（赫兹） | 首选速度
（°/s） | 50%高碳
平方英尺（cpd） | 50%高碳
TF（赫兹） | 最大值
ΔF/F（%） |
|---|
| 第1版 | 87 | 4 | 2 | 0.076 | 3 | 39.9 | 0.16 | 9.9 | 11.4 ± 0.8 |
| 美国铝业公司 | 107 | 5 | 4 | 0.045 | 3.8 | 84.8 | 0.12 | 13.7 | 14.5±1.4 |
| 颗粒物 | 46 | 6 | 5 | 0.11 | 1.2 | 10.9 | 0.22 | 7.2 | 9.4 ± 1.2 |
AL和PM中的神经种群具有不同的峰值速度范围
以上结果表明，当仅考虑空间频率偏好或时间频率偏好时，AL和PM区域之间存在明显的视觉调谐差异。然而，检查中的散点图也表明神经元的空间和时间频率偏好之间存在一定程度的相关性。例如，偏爱较高时间频率的PM神经元也偏爱较高空间频率，而偏爱较低时间频率的AL神经元也偏袒较低空间频率。通过这种方式，PM中的神经元具有较低的峰值速度（较低的首选时间频率/首选空间频率比率，出现在; 另请参见)而AL中的神经元具有较高的峰值速度（平面右下方三角形部分）。
与这些观察结果一致，我们发现峰值速度能更好地区分AL和PM中的神经元，而不仅仅是首选的空间频率或时间频率。我们使用基于线性鉴别的分类器来找到时空频率平面中线条的位置和倾斜度，从而将AL响应偏好和PM偏好最好地分开(，黄线）。令人惊讶的是，AL与PM峰值响应的最佳分类出现在精确恒定的刺激速度线上（41.9°/s；参见和实验程序），分类准确率为88%（相比之下，仅使用首选的空间或时间频率时，分别为79%和82%）。此外，高峰值速度为80°/s−1000°/s的神经元几乎只出现在AL区，而低峰值速度为1°/s−的神经元几乎仅出现在PM区(). 相比之下，V1中的神经元表现出更大范围的峰值速度(). 这些差异在各地区峰值速度的中值中也很明显(和; 峰值速度分布之间的所有区域差异都非常显著，K–S检验，所有p值均<10−5).
峰值速度的区域差异不能用反应神经元密度或不同区域反应强度的差异来解释(表S1). 区域间标记细胞的估计百分比差异不大（范围为63%–70%），视觉驱动的标记细胞估计百分比在PM区域显著但仅略低于AL或V1区域（PM:3.5%；AL:8.5%；V1:8%；参见表S1和相关文本）。此外，驱动细胞的峰值响应强度在不同区域之间没有显著差异(K–S测试，所有p值均>0.05）。虽然每个区域的大多数钙信号是从已确认的第II/III层细胞体中获得的（范围为72%-77%），但少数信号是从同一皮质柱内的局部神经元的假定树突中获得的。当仅包括已确认的细胞体时，在AL和PM区域之间观察到峰值速度的显著差异（K-S检验，p＜10−13; 有关详细信息，请参见图S3)或仅推测树突（p<10−3).
单个神经元的速度调谐与时间或空间频率调谐
鉴于峰值速度是区分AL神经元和PM神经元的有用指标，我们测试了AL和PM中的单个神经元是否调节了速度。当刺激空间频率的变化导致时间频率偏好的成比例变化时，可以认为神经元的速度是可调的，这样对于共同速度的响应总是最强的（例如。，Priebe等人，2006年). 空间频率和时间频率之间的关系由幂律指数ξ捕捉，在椭圆高斯拟合中，用于每个神经元(和实验程序）。如果ξ≈1，则神经元被调速(，顶部）；如果ξ≈0，则所有空间频率的首选时间频率都是恒定的，因此神经元没有速度调节(，底部）。与V1和AL的神经元相比，PM区的神经元在速度上的调谐程度更高(; 所有p值<0.0003，K–S检验），尽管我们观察到所有皮层区域的速度都有一定程度的调整（即ξ的平均值>0，所有p值<10−6在PM和AL中，V1中p<0.02，双尾t检验；). 此外，速度调谐与峰值速度成反比()，跨区域（散点图中的所有神经元，r=−0.57，p<10−4、ξ与对数的皮尔逊相关2[速度]）和每个区域内（V1:r=-0.46，p=0.04；AL:r=−0.46，p=0.001；PM的类似趋势：r=-0.26，p=0.39）。这可能部分解释了为什么PM神经元的峰值速度往往较低，但其速度调节能力更强。与速度调谐和峰值速度之间的反向关系一致，速度调谐也与时间频率呈负相关（所有神经元，r=0.65，p<0.0001），与空间频率呈正相关（所有神经细胞，r=0.32，p<0.02）。
最后，我们还考虑了是否根据速度调整了每个视觉区域的平均输出（由每个区域中所有峰值归一化响应曲线的平均值估计）(图S4A). 我们拟合了每个区域的平均响应曲线（使用2D高斯拟合，与单细胞分析一样），发现PM区域的平均时空响应表现出相当大的速度调谐（ξ=0.64），而AL和V1区域没有（AL:ξ=0.23；V1:ξ=−0.23）。有趣的是，PM区域的平均反应曲线与通过以下方法获得的行为敏感性曲线具有相似的速度调谐和形状Umino等人（2008）在实验中，在不同时空频率下呈现正弦光栅时，估计C57BL/6小鼠的视觉运动头部跟踪阈值(图S4B; ξ表示光动灵敏度=0.88；用线性相关法估计视运动行为敏感性和面神经反应之间的相似性：r光动力，PM=0.88，r视运动，AL=−0.20，r视运动，V1=0.56，所有p值<10−4).
视觉区域之间方向选择性相似，但方向选择性不相似
运动中的物体通常由多个空间频率分量组成，每个分量以相似的速度运动。因此，参与运动物体处理的皮层区域（见讨论）可能具有神经元，具有（1）在多个空间频率上调谐相同的速度（见上文）和（2）一定程度的定向和方向选择性(奥尔班，2008年;Priebe等人，2006年). 因此，我们确定了四只小鼠V1、AL和PM区域额外161个神经元对刺激方向和方向的选择性（参见和S1（第一阶段）). 我们提供了与中相同的平滑边缘光栅贴片–，但在八个方向之一和五个或六个空间频率中的一个方向漂移（实验程序；V1和PM实验的时间频率固定为2 Hz，AL实验为8 Hz，以便有效地驱动神经元）。
表2
| #单元格 | #会话 | #老鼠 | 方向选择性 | 方向选择性 | 最大ΔF/F（%） |
|---|
| 第1版 | 78 | 三 | 三 | 0.54 ± 0.03 | 0.45 ± 0.02 | 15.4 ± 1.0 |
| 美国铝业公司 | 40 | 2 | 2 | 0.53 ± 0.04 | 0.16 ± 0.02 | 18.9 ± 2.3 |
| 颗粒物 | 43 | 三 | 三 | 0.54 ± 0.03 | 0.30 ± 0.03 | 17.6 ± 2.1 |
首选空间频率下的响应极坐标图示例()说明V1、AL和PM区域神经元的定向和方向选择性。首先，我们发现跨区域的定向选择性没有显著差异(和; K–S测试，所有p值>0.1）。V1区（58/78=74%）、PM区（30/43=70%）和AL区（31/40=78%）的方向选择性神经元百分比（选择性指数>0.33，即峰值：零反应>2:1）相似。我们对方向选择性的估计并不强烈依赖于刺激的空间频率（数据未显示），也不太可能依赖于时间频率(Moore等人，2005年).
接下来，我们考虑了跨区域的方向选择性。69%的V1神经元（54/78）具有较强的方向选择性（指数>0.33，即峰值：零反应>2:1），而PM神经元（18/43）和AL神经元（6/40）分别为42%和15%。V1神经元对方向的选择性明显高于PM神经元（p＜0.02，和). AL神经元的方向选择性低于V1神经元（K-S试验，p<10−7)和PM（p<0.01）。V1、PM和AL之间的方向选择性差异不能用峰值响应强度的差异来解释，而峰值响应强度在不同区域之间没有差异(K–S测试，所有p值均>0.4；参见讨论）。然而，与PM和V1相比，AL中较低的方向选择性可以通过我们使用不同的刺激时间频率来解释（AL中为8 Hz，PM和V1中为2 Hz；参见Moore等人，2005年)选择这些药物以在每个领域提供可比较的疗效(表S1).
我们还调查了这些领域的反应是否偏向于特定的方向或方向。所有神经元的平均归一化反应在AL区（八个方向的方差分析，p<0.001；参见图S5A). 当考虑到AL区单个神经元的首选方向和方向时，也观察到类似的结果(图S5B和S5C). 在PM或V1区域，人口方向偏差不那么明显（所有p值均>0.1）。
运动和眼动对反应强度和偏好的影响
总之，这些数据表明，AL和PM区域之间的反应调节存在很大差异，这表明这些区域对不同的视觉行为有不同的贡献（见讨论）。我们测试了在小鼠静止的试验和小鼠在线性轨迹球上移动的试验中，区域之间的反应调节是否存在这些差异。在这项分析中，我们选择了所有在小鼠“静止”和“移动”时（与; V1:n=35个神经元，AL:27，PM:8；实验程序）。
静止和运动状态下两个代表性神经元的时间频率调谐曲线如所示与之前的研究一致(Niell和Stryker，2010年)，运动导致V1神经元的峰值反应幅度显著增加（76%；配对t检验，p<10−4;). AL（35%，p<0.01；显著低于V1，K-S试验，p<0.02）和PM（109%，p=0.12；缺乏显著性可能是因为PM中八个神经元的样本量较小）的峰值响应幅度随运动而增加。为了解决运动过程中神经反应的调节可能是由于眼球运动增加的可能性，我们在这些记录的子集中监测眼球运动(图S2). 大幅度眼球运动（>5°）或眨眼的消除试验对运动对反应幅度的调节几乎没有影响(图S2G和S2H，底部面板）。
除了响应幅度的变化外，我们还发现在运动过程中峰值速度有微小但显著的增加()V1（24%或0.3倍频程，t检验，p<0.003）和AL（36%，0.4倍频程−4)PM也有类似的趋势（32%，0.4倍频程，p=0.09）。峰值速度的增加可归因于时间频率偏好的增加(; t检验，p值<10−3在V1和AL中，p=0.22（PM中），但不是空间频率偏好（所有p值>0.1）。峰值速度的这些微小增加并不是由于高速刺激引起的运动发生率增加，因为这些局部刺激的出现并没有改变运动发生率(图S2D和S2F)也不可能是由于跑步和非跑步试验之间的平均眼位差异，而这些差异非常小（<1°−2°，图S2C). 关键的是，频率偏好的变化在不同区域之间没有显著差异（所有p值均>0.1），这表明无论小鼠是否在运动，AL区域对空间和时间频率的响应都与PM区域的响应非常不同。区域差异对运动影响的稳健性也可以从每个区域的平均归一化响应曲线中看出(图S6).
讨论
我们使用双光子钙成像技术对处于警戒状态的小鼠的局部神经元体积进行成像，以评估高级视觉区域AL和PM的功能特化的存在和程度。这两个区域几乎完全没有重叠的刺激偏好：AL神经元对低空间频率和高时间频率或快速移动的刺激反应最好，而PM神经元对高空间频率和低时间频率或缓慢移动的刺激反应最好。相比之下，为这两个区域提供主要输入源的V1区域的神经元对广泛的频率和速度敏感。这些发现在很大程度上与小鼠是静止还是奔跑无关：尽管在所有三个区域的运动都增强了反应（参见。Niell和Stryker，2010年)，仅观察到峰值速度的微小均匀增加。此外，PM、AL和V1的神经元群具有相似的方向选择性，但方向选择性不同。这些结果表明，较高的视觉区域AL和PM对处理不同类型的视觉信息具有较强的特异性。
啮齿动物区AL和PM的功能差异
我们的主要发现是，AL区和PM区的神经元群体倾向于快速（20°/s−1000°/s）和慢速（1°/s−的40°/s）刺激速度的几乎不重叠的范围，并且V1跨越了这两个速度范围（1°/s-1000°/s；和). 通过峰值速度对神经元进行分类比仅通过空间或时间频率更有效，因为AL中偏好最低时间频率的神经元也偏好最低空间频率，因此对较高速度保持响应(). 相反，偏爱最高时间频率的PM神经元也偏爱最高空间频率，因此对较低速度保持响应。
清醒小鼠视皮层区域特化模型我们的结果显示，V1中的插入群神经元喜欢广泛的刺激速度，而PM中的神经元对低速反应，AL中的神经元则对高速反应。我们预测，AL和PM的这种专门化可能部分来自速度敏感性与靶区匹配的V1神经元亚群的选择性输入。峰值速度、解剖位置和连接性的差异也表明，区域AL可能有助于涉及高速刺激的行为（例如，导航过程中的光流），而PM可能会有助于监测缓慢移动物体的行为（参见图S4).
我们发现AL的峰值速度高于PM，这与一项对麻醉小鼠进行的广泛内源性自体荧光成像研究相一致，该研究发现，在包括AL在内的前部视觉皮层区域，对高速刺激（50°/s）的反应强于低速刺激（10°/s），但PM没有反应(Tohmi等人，2009年). 类似地c-fos公司在大鼠身上进行的研究发现，AL区被运动而非静止刺激强烈激活(Montero和Jian，1995年). 来自其他几个实验室的麻醉小鼠AL和/或PM区域的初步发现也与我们关于时空调谐特性的发现大体一致（E.Gao、G.DeAngelis和A.Burkhalter，2006，Soc.Neurosci.，摘要；M.Roth、F.Helmchen和B.Kampa，2010，Soc.Neurosci，摘要；M.Garrett，J。Marshall，L.Nauhaus和E.Callaway，2010年，神经科学学会。，文摘）。
小鼠V1的有效刺激速度上限（1000°/s）是灵长类区域MT的20倍以上（例如。，Perrone和Thiele，2001年;Priebe等人，2006年)但与早期对轻度麻醉小鼠V1的神经元（皮质内未知深度）的研究一致(Dräger，1975年). 偏好最高峰值速度的小鼠V1神经元也优选显著低于灵长类视觉皮层神经元的空间频率（例如。，Priebe等人，2006年). 在导航过程中，高速视觉提示可能对鼠标有用。例如，当老鼠高速穿过地板或沿着墙壁奔跑时（在2-4厘米的距离上，典型速度为10-50厘米/秒；Lipkind等人，2004年;Harvey等人，2009年)，由此产生的光流模式主要由高达～1000°/s的速度控制。尽管有这些考虑，刺激速度的维度可能不是我们研究中所有神经元的计算相关变量。事实上，虽然大多数峰值速度较低的神经元在空间频率上的调谐速度相同(;Priebe等人，2006年)，峰值速度较高的神经元并非如此。
实验程序
颅骨窗植入、习惯和钙指示剂的靶向表达
所有程序都是根据美国国立卫生研究院的道德准则进行的，并得到了哈佛医学院IACUC的批准。本研究使用了八只雄性和雌性成年小鼠（2-6个月龄；各种菌株，C57BL/6初级背景）。其中5只小鼠是Pvalb-IRES-Cre系的杂交小鼠(Hippenmeyer等人，2005年; Jax no.008069）和Rosa-CAG-LSL-tdTomato-WPRE:：deltaNeo线(Madisen等人，2010年; Jax编号007914）。在这些小鼠中，通过红色td番茄荧光标记小白蛋白表达神经元未在当前研究中使用。对于颅骨窗植入手术，用异氟醚（1.2%–2%）麻醉动物2). 手术前一天给予地塞米松（3.2 mg/kg，IM），手术开始时给予阿托品（0.2 mg/kg，IP）。使用无菌技术，使用氰基丙烯酸酯、牙科丙烯酸树脂和C&B Metabond（Parkell）将头柱和脑电图导线固定到位，并在左视皮层（中心~2.8 mm横向，lambda前方0.5 mm）上进行5 mm开颅手术，如前所述(安德曼等人，2010年). 我们植入了一个5 mm的玻璃颅骨窗，包括一个8 mm的盖玻片，固化为两个5 mm盖玻片（Warner#1；总厚度：～0.5 mm；颅骨下厚度：～200µm），使用指数匹配粘合剂（Norland#71）。用氰基丙烯酸酯和牙科丙烯酸树脂将窗户固定到位，让小鼠恢复至少4天。
习惯包括用水调度，以便仅在头枕训练期间和训练后立即供水。头枕的持续时间在1-2周内增加，从3分钟增加到2小时(安德曼等人，2010年). 此时，使用宽视野固有自体荧光成像（见下文）对清醒小鼠的视觉皮层区域进行视网膜标测。钙指示剂GCaMP3的靶向表达如下：麻醉小鼠（异氟烷，1.5%–2%），用酒精消毒颅骨窗，并取下盖玻片。然后，我们使用体积注射系统（100µl/min，Stoelting）注射100–1000 nl（取决于批次滴度）的7:3 AAV2/1.hSynap混合物。GCaMP3.3.SV40型(Tian等人，2009年; Penn Vector Core）和D-甘露醇(Mastakov等人，2001年). 以宽视野成像期间观察到的血管模式为指导，我们在V1区的后部/中部（颞视野/上视野）注射一次，或在AL区和PM区的视网膜匹配区域注射两次。所有注射都在软脑膜表面以下200-300µm的深度。注射后，一个新的颅骨窗被密封到位，小鼠被救出。实验在注射后10天至6周进行。
宽场成像
为了绘制视觉皮层区域，我们使用了外荧光成像(Husson等人，2007年;Tohmi等人，2009年)测量固有自荧光信号的变化。通过绿色/红色发射滤光片（长通，500nm截止）测量由蓝色激发（470nm中心，40nm带，Chroma）产生的自身荧光。使用CCD摄像机（Sensicam，Cooke，344×260像素，跨度4×3 mm；2 Hz采集率）通过5×空中物镜（0.14 NA，Mitituyo）使用ImageJ采集软件采集图像。对于视网膜标测，我们在2-6个视网膜标测位置分别刺激5秒，试验之间使用15秒的空白监视器屏幕（平均亮度）。自体荧光视觉反应由微弱的阳性信号组成（代谢增加时黄素蛋白氧化；Tohmi等人，2009年)随后是较强的负信号（由于血容量和脱氧血红蛋白浓度延迟增加，光吸收增加，Schuett等人，2002年). 因此，对刺激的反应被计算为刺激开始后0-3s所有帧的平均值与刺激开始后9-19 s的平均值之间的荧光分数变化(). 用于GCaMP3的广域成像()除总试验时间缩短至10s外，采用相同的程序，荧光变化计算为刺激开始后[-2s，0s]至[0s，5s]的平均荧光分数变化。请参见图S1，图例，了解更多详细信息。
双光子钙成像
成像是用一个定制的双光子显微镜进行的，该显微镜由ScanImage的修改版本控制(Pologruto等人，2003年)，如前所述(Andermann等人，2010年;Kerlin等人，2010年). 利用电流计（剑桥技术公司）通过25×1.05 NA物镜（奥林巴斯）扫描具有群延迟色散补偿的Mai Tai DeepSee激光器（纽波特公司）的激发光。三维成像是通过使用压电Z扫描仪（P-721.LLQ，Physik Instrumente）以1 Hz的频率梯形扫描显微镜物镜实现的，同时以16 Hz的频率采集帧（128×128像素帧，双向扫描，像素驻留时间～3µs）；每体积共使用15帧，帧之间深度为3µm；目标反飞期间的一帧被丢弃）。体积通常为200µm×200µm×45µm。离开物镜的激光功率范围为12-60 mW，并根据瞬时焦距不断调整。GCaMP3在960 nm处激发，用绿色2收集发射″通过GaAsP光电倍增管（滨松）的滤光片（542 nm中心；50 nm波段；Semrock）。通过将成像部位上方表面血管的双光子图像与宽视野（固有自荧光信号）视网膜定位的表面血管进行比较，确认神经元位于特定的皮层区域。录音时间为3-5小时。GCaMP3的病毒表达允许在不同的日子从同一只小鼠的多个皮层区域的神经元进行记录(安德曼等人，2010年;Dombeck等人，2010年;Mank等人，2008年;O'Connor等人，2010年;Tian等人，2009年). 当多天从同一皮层区域记录时，先前成像的神经元被重新定位，并选择相邻的体积，以确保样本中的所有神经元都是唯一的。
在成像过程中，小鼠被放置在一个6″泡沫轨迹球（Plasteel）可以在滚珠轴承上无声无息地旋转（McMaster-Carr）。我们使用定制的光电探测器电路监测轨迹球的旋转。在一组实验中，我们使用CMOS相机（Mightex；20 Hz）和红外照明（720-900 nm带通滤波器，Edmund）记录了眼球运动。
视觉刺激
为了在0.5–24 Hz的时间频率下实现精确刺激，我们使用了120 Hz LCD显示器（三星2233RZ，22″)使用分光光度计（Photoresearch PR-650；另见Wang和Nikolić，2011年). 通过测量全场正弦调制刺激的亮度波动（使用光电倍增管哈马松），也证实了波形是正弦的。显示器的位置应确保刺激贴片距离对侧眼睛21厘米。刺激集中在偏心率为70°至115°、仰角为−5°至14°的单眼位置（这使得视觉皮层区域的反应区域最大程度分离，). 对于细胞成像，显示包含正弦波漂移光栅（80%对比度）的局部40°Gabor样圆形斑块（10°内10%–90%的s形衰减）5 s，然后是5 s的均匀平均亮度（46 cd/m2). 在空间频率×时间频率协议中()，我们提出了5个空间频率（0.02、0.04、0.08、0.16和0.32周期/度，cpd）和7个时间频率（0.5、1、2、4、8、15和24 Hz）的向上驱动光栅，共有35种刺激类型，外加10%的空白试验。在空间频率×方向协议中()，我们提供了多达6个空间频率（0.02,0.04,0.08,0.16和0.32，有时为0.64cpd）和8个运动方向（45°间距）以及10%的空白。在该方案中，V1和PM区域的光栅时间频率为2 Hz，而AL区域的光栅频率为8 Hz，以驱动相当比例的细胞。给定方案中的所有刺激都是随机的（不进行替换抽样），并呈现9–28次（对于空间频率×时间频率和空间频率×方向方案，每个刺激的中位数分别为20和15次试验）。
数据分析
数据分析在Matlab（MathWorks）和ImageJ（NIH）中进行。如前所述，将双光子成像堆栈逐体积对齐（使用刚体变换），以校正缓慢漂移(Kerlin等人，2010年). 对于成像体积中的每个像素，每种刺激类型的诱发反应被定义为在5s刺激开始后[--2s，0s]和[0s，5s]之间荧光（ΔF/F）的分数变化，在试验中平均。由于基线荧光有时是暗淡的，通过对所有刺激类型的平均反应体积取荧光的最大分数变化（ΔF/F），并使用定制的半自动分割算法（参见图S3，图例，了解更多详细信息）。
细胞荧光时间进程是通过平均细胞掩模中的所有像素生成的。首先选择围绕每个神经元（不包括相邻的细胞膜；Kerlin等人，2010年)，估算体积（1）中所有此类壳的共同时间进程标准时间主成分），并从每个细胞的时间进程中移除该成分（根据周围外壳的基线荧光进行缩放）。在随后的分析中，只包括由至少一种刺激类型显著驱动的细胞（采用Bonferroni校正的t检验，p<（0.05/n），其中n=35-48取决于刺激方案）。
对于空间频率×时间频率协议()，响应通过二维椭圆高斯拟合良好(Priebe等人，2006年):
其中A是神经元的峰值响应，平方英尺0和tf公司0是神经元的首选空间和时间频率，σ平方英尺和σtf公司是空间和时间频率调谐宽度。时间频率偏好对空间频率的依赖性由幂律指数壯表示，如对数2
tf公司第页(平方英尺)=ξ（对数2
平方英尺–日志2
平方英尺0)+日志2tf公司0。对于该协议，我们估计了平方英尺0和tf公司0通过执行500次蒙特卡罗模拟（随机抽样每种刺激类型的试验，并进行替换）。只有95%置信区间小于1.5八度的神经元平方英尺0和tf公司0包括在随后的分析中。这一严格标准分别消除了PM、AL和V1中37%、20%和20%的额外记录（如果没有这一标准，结果非常相似，数据未显示）。对于中的分析，只有（1）95%置信区间<1的塣估计值；（2） 采样范围内包含的首选频率；和（3）σ的估计Sf公司和σtf公司两者均超过1倍频程。空间和时间频率50%高截止值的估计()也可从模型拟合中获得（从R（右）(sf、tf0)和R（右）(平方英尺0,tf公司)）。
对于频率偏好的最佳线性分类器的估计(平方英尺0,tf公司0)在AL和PM之间，我们进行了线性判别分析，发现所描述的最佳分类器线由log给出2(平方英尺0)=−5.39+0.997*对数2(tf公司0)，近似于速度给定的等速线=tf/平方英尺=41.9°/s（黄线，).
对于空间频率×方向协议，我们首先找到首选方向（跨空间频率平均），并估计峰值空间频率（在神经元的首选方向）。然后，我们计算方向和方向选择性指数为（R峰−R（右）无效的)/（右峰+R（右）无效的)在神经元的首选空间频率（对于方向估计，R峰=首选方向，R无效的=首选180°响应；方向估计，R峰=首选方向，R无效的=首选90°响应；Kerlin等人，2010年;Niell和Stryker，2008年).
用于分析运动对空间和时间频率响应的影响(,S2系列、和S6系列)，我们将每种刺激类型的试验分为在刺激呈现的5s内观察到任何车轮运动的试验（“运动”试验）和缺乏任何运动的试验。在一组实验中(图S2)，我们使用前面描述的瞳孔跟踪算法的自定义Matlab实现来分析眼睛位置(Zoccolan等人，2010年).
