DRG神经元对ETS转录因子信号反应的发育开关

EWS-项目3可以替换第81页Ia传入投射的控制作用

我们首先定义了一种ETS转录调节器，该转录调节器能够取代本体感受性传入神经中Er81的功能，将投射物导向脊髓腹侧。Er81、Pea3和Erm构成ETS转录因子的Pea3亚家族，具有高度的氨基酸同源性，并与非常相似的DNA靶序列结合[17,18,19]. 然而，当引入第81页与以前使用的目标定位策略相似的位置（未显示数据[14])，两者都不是豌豆3也不是Erm（错误）可以挽救Ia本体感受传入投射，从而广泛侵犯脊髓腹角（数据未显示）。这些发现促使我们分析我们整合的小鼠EWS-Pea3，尤因肉瘤（EWS）基因氨基末端结构域和Pea3 DNA结合结构域之间的一个断点融合产物[20,21]，进入第81页轨迹(图1). 我们发现，在基于荧光素酶的细胞培养转染试验中，EWS-Pea3表现出比Er81或Pea3更强的反式激活活性(图1J；数据未显示），与之前的研究一致[22,23,24]. 此外，EWS-Pea3的反式激活被报告质粒中ETS结合位点的突变所消除，表明ETS结合部位依赖性（数据未显示）。

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图1

更换第81页通过EWS-项目3

（A） 的生成第81页^EWS第3页突变小鼠。以上是二81同源重组靶区的基因组位点[14]. 外显子1-4显示为浅蓝色框第81页外显子2的起始密码子表示为ATG。用于检测同源重组的探针显示为灰色方框。以下是替换第81页通过EWS-项目3通过整合EWS-项目3在带有第81页外显子2中的位点（类似于[14]).

（B） PCR和Southern blot分析第81页^EWS-项目3野生型(+/+)，杂合子(+/−)和纯合子(−/−)基因组DNA检测突变等位基因。PCR引物对（EWS-Pea3ki）用于特异性检测重组等位基因，外显子2的引物对用于检测野生型等位基因的存在[14]。

（C–E）E16.5野生型（C）腰椎DRG神经元Er81表达分析，第81页^−/−（D） 、和第81页^EWS-Pea3/−（E） 胚胎。每个面板右下角的插图显示了各自DRG中的Isl1表达。

E16.5野生型（F）腰椎DRG中（F–H）PV的表达，第81页^−/−（G） 、和第81页^EWS-Pea3/−（H） 胚胎。以相同的增益强度进行共焦扫描。

（J） 包含五个一致ETS DNA结合位点的最小报告构建物中荧光素酶表达的转录激活(GCCGGAAGC；[18,19])和Er81瞬时转染后的最小TK启动子(n个≥ 7; 3.03±0.66）或EWS-Pea3(n个≥ 7; 20.3 ± 2.7). 相对荧光素酶活性归一化为对照（Con）。

比例尺：80μm。

Er81在含有融合蛋白的胚胎DRG神经元中的表达EWS-项目3在中第81页轨迹(第81页^EWS-Pea3/−)被废除了(图1E） 以及本体感受性传入纤维中钙结合蛋白Parvalbumin（PV）的表达水平，在第81页突变体[14]，与野生型水平相当第81页^EWS-Pea3/−胚胎(图1F–1H） ●●●●。为了进一步定义DRG神经元的分化EWS-项目3在体内本体感受传入中，我们评估了第81页通过EWS-项目3对神经元存活或本体感受不同特异性基因的表达有影响。第81页^EWS-Pea3/−在L1至L5的DRG内本体感受传入细胞体的数量、本体感受传入正常表达的几个基因的表达以及本体感受传入中不正常表达的基因的缺乏方面，小鼠与野生型小鼠没有差异(图S1; 数据未显示）。总之，这些发现表明，正常发病时间的EWS-Pea3表达与通过本体感觉传入内基因表达的诱导和维持来评估的Er81功能相似。

确定Ia本体感受传入投射到脊髓腹侧的挽救程度第81页通过表达EWS-Pea3，我们通过PV的轴突标记追踪椎管内传入投射(图2A–2C） ●●●●。此外，为了分析与DRG神经元PV表达水平无关的轴突长入，我们使用荧光标记右旋糖酐顺行标记传入纤维切断背根(图2D–2F） ●●●●。通过这两种分析，我们发现在二81^EWS-Pea3/−老鼠(图2C和​和2F）。2F） ●●●●。在腹角内，Ia传入在野生型和第81页^EWS-Pea3/−小鼠形成vGlut1⁺中缺少的端子第81页突变小鼠(图2G–2一） ●●●●。评估Ia传入和运动神经元之间的突触是否在第81页^EWS-Pea3/−在小鼠中，我们在刺激支配股四头肌群的神经后，对识别出的股四头运动神经元进行细胞内记录。当比较野生型和野生型时，我们发现股四头肌运动神经元的输入振幅没有显著差异第81页^EWS-Pea3/−老鼠(图S2; 野生型，10.6±0.9 mV，n个= 11;第81页^EWS-Pea3/−，10.9±1毫伏，n个= 8). 总之，这些发现表明，在缺乏Er81，EWS-Pea3可以指导脊髓腹侧正确终止层流的复杂生物过程以及与运动神经元形成突触(图2J–2五十） 从而确定了一种适合DRG神经元异慢性表达实验的ETS转录因子。

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图2

Ia本体感觉传入投射入脊髓腹侧的抢救第81页^EWS-项目3突变体

（A–F）PV腰椎L3水平中央投射的形态学分析⁺在P0.5（A–C）或P5（D–F）野生型（A和D）中，将荧光标记的右旋糖酐应用于单个背根（D–F）后的DRG神经元（A–C）或所有DRG感觉传入，第81页^−/−（B和E），以及二81^EWS-Pea3/−（C和F）小鼠。红色虚线表示脊髓处于中间水平。

（G–I）P0.5野生型（G）腹角vGlut1免疫细胞化学分析，第81页^−/−（H） 、和第81页^EWS-Pea3/−（一） 老鼠。（A）中的黄色虚线框表示（G–I）中所示图像的大小。

（J–L）野生型（J）观察到的Ia本体感受传入投射物（蓝色）进入脊髓腹侧的形态学拯救示意图，第81页^−/−（K） 、和第81页^EWS-Pea3/−（五十） 老鼠。用灰色虚线表示的DRG；运动神经元以黑色显示。

比例尺：（A–C），150μm；（D–F），160μm；（G-I），70μm。

早熟表达EWS-项目3DRG内神经元导致轴突投射缺陷

为了解决早熟ETS信号对本体感觉传入分化的影响，我们接下来在DRG神经元有丝分裂后立即表达EWS-Pea3。我们使用了一个二元小鼠遗传系统，该系统基于Cre重组介导的对两侧的转录终止盒的切除液氧磷网站。靶向暗盒被整合到陶（Tau）产生两种有条件表达其中一种的小鼠的基因座EWS-项目3或膜靶向绿色荧光蛋白（mGFP）追踪DRG神经元的轴突投射(图S3; [25]). 胚胎对任何一种都呈阳性以色列1^Cre公司/+和陶（Tau）^{EWS-项目3/+}或以色列1^Cre公司/+和陶（Tau）^mGFP基因/+等位基因显示沉默的有效激活陶（Tau）所有DRG神经元中95%或更多的等位基因，包括本体感受传入，在所有节段水平(图S3).

我们首先评估了EWS-项目3在有丝分裂后早期DRG神经元中使用陶（Tau）^{百万绿色荧光蛋白/+}等位基因或a您的1-启动子驱动的突触素绿色荧光蛋白（spGFP）在胚胎期（E）13.5的表达谱仅限于DRG感觉神经元(您的1^spGFP公司；[25]) (图3). 与野生型本体感受传入投射相反(图3A–三C） 、GFP⁺感觉传入陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+胚胎未能侵入脊髓，而是在背根进入区的极外侧位置发现，观察到的表型至少高达E18.5(图3A–三C和3G–3I；数据未显示）。接下来，我们观察了感觉传入投射到背根进入区的路径陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+通过向单个DRG（L3；n个= 3;图3M–三Q） ●●●●。E13.5野生型胚胎的感觉传入在其脊髓外侧入口点分叉，并在逐渐接近中线的同时，在六个或更多节段水平上投射到头部和尾部(图3M） ●●●●。感觉传入陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+胚胎也在进入点分叉，尽管大约5%的传入纤维继续向中线生长(图3O和​和3Q）。三Q） ●●●●。虽然罗斯特罗·卡达尔投影出现在陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+胚胎，传入纤维未能接近远端的中线，并继续占据极端的外侧位置(图3O） 与横截面分析一致。

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图3

早熟表达时感觉传入投射建立的缺陷EWS-项目3在DRG神经元中

（A-C和G-I）野生型（A-C）脊髓感觉传入投射（绿色）的可视化和陶（Tau）^EWS第3页/+以色列1^Cre公司/+E13.5（A、C、G和I）和E16.5（B和H）的（G-I）胚胎通过Cre重组介导激活mGFP表达陶（Tau）轨迹（A、B、G和H）或通过您的1^spGFP公司转基因（C和I[25]). 灰色箭头表示脊髓传入投射的正常模式，而红色箭头表示脊髓外侧边缘的感觉传入异常积聚陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+胚胎。

（D-F和J-L）分析野生型（D-F）和陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+（J–L）胚胎在E16.5通过Cre重组介导激活mGFP（D、E、J和K）表达陶（Tau）轨迹。（F和L）显示出口风险3使用原位杂交在梭内肌纤维中表达（显示[E和K]的连续切片）。

（M–Q）E13.5野生型（M）和陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+将荧光标记的右旋糖酐（绿色）注射到一个DRG（腰椎L3级）后的（O和Q）胚胎。（M和O）的共焦扫描平面如（N）所示。插图（O）也显示在较深的共焦扫描平面（P和Q），以可视化异常轴突投影。

比例尺：（A和G），60μm；（B和H），80μm；（C和I），100μm；（D和J），160μm；（E、F、K和L），70μm；（M、O和Q），240μM。

接下来我们研究了早熟时外周投射的建立EWS-项目3DRG神经元表达。而感觉轴突陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^克里/+胚胎通过E16.5到达皮肤并建立主要神经干，皮肤内只建立了基本的感觉轴突分支(图3D和​和3J）。三J） 。此外，在陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^克里/+胚胎（约占野生型补体的25%；n个=3）通过神经支配和梭内肌纤维特异基因的表达进行评估，如出口风险3(图3E、，​E、 第三层，三F、，​F、 3公里，三K、 和3L；[26]). 总之，尽管等时表达EWS-项目3促进脊髓腹侧本体感觉传入投射的建立，DRG神经元中相同ETS信号因子的早熟表达干扰了投射到脊髓和外周靶点的建立。

早熟的EWS-项目3表达促进神经营养素非依赖性生存和神经生长

开始研究与不同生物作用有关的细胞和分子机制EWS-项目3在不同的发育阶段，我们首先转向体外培养实验。这些实验可以评估早熟ETS转录因子信号是否影响神经元存活和DRG神经元体外突起生长，这两个参数受靶向源性神经营养因子及其受体的显著影响。

我们从野生型和陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+在有NGF或NT-3或无神经营养素的胚胎中，分析体外48小时后神经存活和基质凝胶基质上的神经突起生长。没有神经营养支持，很少野生型DRG神经元存活(图4A） ●●●●。相反，用神经营养因子培养野生型DRG可导致神经元存活和神经突起生长。添加支持皮肤传入神经存活的NGF，导致直突起和不分枝突起的生长(图4B） 而培养物在支持本体感受性传入神经存活的NT-3存在下生长时，在体外48小时后产生了高度分支的神经突起生长模式(图4C） ●●●●。令人惊讶的是，DRG神经元从陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+胚胎和无神经营养支持培养的胚胎在体外48h后存活，并建立了长且高度分支的神经突起(图4D） ●●●●。应用NGF或NT-3后，神经突起生长模式和神经元存活率均无明显变化(图4E和​和44F） ●●●●。

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图4

提前表达EWS-Pea3的DRG神经元体外神经营养素非依赖性突起生长

E13.5来自野生型（A、B和C）的腰椎DRG，陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+（D、E和F），或巴克斯^−/−（G、H和I）胚胎在没有神经营养支持（A、D和G）或在NGF（B、E和H）或NT-3（C、F和I）存在的情况下培养48小时，对其进行染色，以观察神经丝的表达，从而观察轴突延伸。

比例尺：130μm。

直接比较DRG神经元表达的神经营养素依赖性EWS-项目3来自陶（Tau）在早熟与等时发病时间的基因座上，我们产生了一种小鼠菌株，其中Cre公司重组酶由光伏轨迹(图S4). GFP在陶（Tau）^{百万绿色荧光蛋白/+}光伏^Cre公司/+仅限于PV⁺本体感受性DRG神经元，反映了PV在E14左右开始表达(图S4; 数据未显示）。接下来，我们培养了E14.5全DRG外植体陶（Tau）^{EWS-项目3/+}光伏^Cre公司/+和陶（Tau）^{百万绿色荧光蛋白/+}光伏^Cre公司/+在有或无NT-3的情况下，小鼠体外培养48小时(图5). 我们发现，两种基因型的DRG神经元仅在NT-3存在时存活并延伸轴突，而在NT-3缺失时死亡(图5). 总之，这些发现表明，只有DRG神经元中的早熟ETS信号，而非等时ETS信号能够将存活和轴突生长与野生型DRG中正常观察到的神经营养素信号的需求解耦。

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图5

表达EWS-Pea3的DRG神经元等时依赖神经营养素生存

E14.5腰部DRG来自陶（Tau）^{百万绿色荧光蛋白/+}光伏^Cre公司/+（A和B）和陶（Tau）^{EWS-项目3/+}光伏^Cre公司/+（C和D）胚胎在没有神经营养支持（A和C）或NT-3（B和D）的情况下培养48小时，对其进行染色，以观察神经丝（红色）和LacZ（绿色）的表达，从而观察轴突延伸和PV表达本体感受传入的存活。

比例尺：150μm。

确定DRG神经元的神经元存活是否来自陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+没有神经营养支持的胚胎足以解释观察到的神经元生长，我们分析了从促凋亡基因突变的小鼠中分离出的DRG巴克斯[27]. 与之前的结果一致，巴克斯^−/−DRG神经元在没有神经营养支持的情况下存活[28]. 相反，神经突起生长巴克斯^−/−DRG神经元显著减少（参见图4G） 比来自陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^克里/+在缺乏神经营养支持的情况下培养的胚胎（参见图4D） 或巴克斯^−/−在神经营养支持下培养的DRG神经元（参见图4H和​和4I）。4一） ●●●●。这些发现表明，除了介导神经营养素非依赖性神经元存活外EWS-项目3在有丝分裂早期，神经元也以非依赖于神经营养素的方式促进神经突起的生长。

开始评估神经营养素信号在哪一步级联DRG神经元陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+胚胎对添加神经营养素无反应，我们检测了胚胎中神经营养素受体的表达陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+胚胎(图6). 而神经营养素受体的表达神经生长因子受体,TrkB、，和TrkC公司标记野生型胚胎DRG中不同感觉方式的传入(图6A–6C）[4,29],陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+胚胎完全没有表达神经生长因子受体,TrkB、，和TrkC公司在E16.5的DRG神经元中(图6G–6一） ●●●●。DRG中Trk受体表达缺失陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+胚胎为这些神经元对添加神经营养因子缺乏反应性提供了可能的解释。

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图6

早熟ETS信号转导导致DRG神经元Trk受体表达缺失和存活率增加

（A–C和G–I）原位杂交分析神经生长因子受体（A和G），TrkB型（B和H），以及TrkC公司（C和I）在E16.5野生型腰椎DRG中的表达（A–C）和陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+（G–I）胚胎。

（D–F和J–L）野生型（D）腰椎DRG分析，陶（Tau）^mGFP基因/+Isl岛^Cre公司/+（E和F），以及陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+（J、K和L）胚胎用于（1）TUNEL（绿色；D和J）在E13.5处的神经元细胞死亡，（2）LacZ（蓝色）全染色在E16.5处的细胞存活和增殖（E和K；显示腰椎水平L1和L2），以及（3）BrdU（绿色）/LacZ（红色）双标记（F和L）。

（M和N）定量分析(n个与野生型水平相关的凋亡事件平均数的≥3个独立实验）如（M）所示，（N）的神经元存活率为连续切片上定量的L1至L5腰椎水平野生型DRG的百分比。

（O） E16.5野生型（wt）和陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+使用以下抗体的（mut）胚胎：Akt、p-Akt（Ser473）、CREB、p-CREB（Ser133）、Bax、Bcl2和Bcl-xl。

（P） 右侧显示了相对于野生型蛋白质水平的定量分析（百分比）(n个=3个独立实验）。

比例尺：（A–C和G–I），35μm；（D和J），40μm；（E和K），200μm；（F和L），50μm。

接下来我们分析了Trk公司受体表达陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+在DRG切片上使用TUNEL，胚胎对体内自然发生的细胞死亡有影响。令人惊讶的是，我们发现凋亡减少了大约50%(n个=3个胚胎，平均>50节）陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+胚胎与野生型的比较(图6D、，​D、 6J、，6J、 和6M）。腰椎DRG神经元数量的定量分析陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^克里/+胚胎显示野生型水平显著增加至约170%(图6E、，​E、 6公里，6K、 和6N）。此外，BrdU脉冲相实验排除了DRG神经元参与陶（Tau）^EWS第3页/+以色列1^Cre公司/+胚胎重新进入细胞周期（无BrdU⁺/LacZ公司⁺细胞，n个=3个胚胎，每个胚胎分析>50个切片；图6F和​和6L）。6五十） ●●●●。结合体外培养实验，这些发现表明DRG神经元陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+胚胎仍处于有丝分裂后，但对自然发生的细胞死亡不敏感，并且在缺乏Trk公司受体和神经营养支持。

接下来，我们分析了已知参与调节神经元存活或细胞死亡的蛋白质的表达变化是否可以在DRG中检测到陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+胚胎。我们发现DRG中Akt/p-Akt或CREB/p-CREB水平没有显著的定量变化(图6O和​和6P）6P） 两者都被证明是神经元存活的关键调节器[29]. 此外，促凋亡Bcl2家族成员Bax的水平没有显著降低(图6O和​和6P）。6P） ●●●●。相反，与野生型水平相比，抗凋亡Bcl2家族成员Bcl-xl和Bcl2的表达水平显著增加（Bcl2，157%；Bcl-x1，259%；平均n个=3个独立实验；图6O和​和6P），6P） ，为增强DRG神经元存活率提供了潜在的分子解释陶（Tau）^{EWS-项目3/+}以色列1^Cre公司/+缺少胚胎Trk公司受体表达[30]。

的生成和初始特征第81页^EWS-Pea3/−在芭芭拉·哈恩（Barbara Hahn）和莫妮卡·门德尔松（Monica Mendelsohn）的专家协助下，在哥伦比亚大学托马斯·杰塞尔（Thomas Jessell）的实验室对小鼠进行了实验。我们感谢托马斯·杰塞尔（Thomas Jessell）的鼓励和许多激动人心的讨论，并感谢他和皮科·卡罗尼（Pico Caroni）对手稿的有益评论。我们感谢Jean-Francois Spetz、Patrick Kopp、Bernard Kuchemann和Monika Mielich提供了出色的技术援助，Ina Kramer提供了Runx3抗体，Pico Caroni提供了百万绿色荧光蛋白cDNA，John A.Hassell提供EWS-项目3cDNA和关于ETS基因功能的富有成果的讨论，Y.A.Barde和K.Tucker提供了陶（Tau）靶向构建体。SH、EV、MS、TP、CL、DRL和SA得到了瑞士国家科学基金会、Basel-Stadt的Katon和诺华研究基金会的资助。此外，DRL还得到了罗氏研究基金会的研究奖学金的支持。

利益冲突。提交人声明，不存在利益冲突。