对乙酰氨基酚诱导人和小鼠肝毒性的机制涉及线粒体损伤和核DNA断裂

过量患者血浆中谷氨酸脱氢酶活性。

我们推断，如果线粒体损伤发生在人类身上，就像发生在啮齿类动物身上一样，那么在MPT和线粒体膜溶解后释放到细胞液中的线粒体内容物应在细胞坏死后在受伤患者的血浆中检测到。考虑到这一点，我们测量了从每个队列获得的血浆中线粒体酶谷氨酸脱氢酶（GDH）的活性。GDH是线粒体基质的酶，在肝脏中高度表达(34). 这些酶催化2-酮戊二酸转化为我-使用NADH和NH的谷氨酸盐₄⁺。我们观察到，随着时间的推移，LTs异常患者的GDH活性明显增加（图​（图1，1，A–C）。健康志愿者、正常LT组和异常LT组的平均GDH活性分别为22±7、10±3和552±113 U/l（图​（图1D）。1D） ●●●●。此外，LTs异常患者GDH活性的平均增加与ALT值的升高相关（皮尔逊系数=0.45；P（P）<0.05）（图​（图1，1E和F）。虽然肝损伤患者（高ALT）的平均PT值（59.2秒）几乎是无相关ALT升高患者（15.3秒）的4倍，但异常LT组的GDH峰值活动与PT值之间没有显著相关性（数据未显示）。

在单独的窗口中打开

图1

APAP过量患者血浆中GDH活性。

在APAP过量患者住院期间，测量其血浆中GDH活性。(A类–C类)来自3名同时显示GDH和ALT活性的代表性患者的时间进程数据。(D类)健康志愿者（V）、正常LT组（正常LT）和异常LT组（异常LT）在ALT峰值时的血浆GDH活性。(E类)LT结果异常患者随时间的平均血浆GDH活性。(F类)LT结果异常患者的平均血浆ALT活性。数据表示为平均值±SEMn个= 20. *P（P）与健康志愿者相比，<0.05。

过量服用药物患者血浆中的线粒体DNA。

大鼠失血性休克后，线粒体DNA（mtDNA）被释放到循环中(35)以及人类的其他身体创伤(36). 除了作为线粒体损伤的另一个标志外，线粒体DNA似乎还作为一种损伤相关分子模式（DAMP），能够通过TLR激活中性粒细胞和先天免疫系统的其他细胞(35–38). 为了确定APAP肝毒性是否导致mtDNA释放到人体循环中，使用绝对定量实时PCR测定这些患者血浆中的mtDNA浓度。为复合物I（NADH脱氢酶）和复合物III（细胞色素）的亚单位设计引物c（c）氧化酶）的电子传递链，它专门编码在线粒体DNA中(39). 随着时间的推移，肝功能异常的过量患者血浆中mtDNA的浓度增加（图​（图2，2，A和B），峰值水平与ALT峰值相关（皮尔逊系数=0.54，P（P）<0.02）（图​（图2C）。2C） 。虽然健康志愿者和正常LT组的血浆中几乎检测不到mtDNA，但受伤患者血浆中mtDNA的平均峰值浓度为45±15 ng/ml（图​（图2D）。2D） ●●●●。同样，尽管与ALT相关，但LT异常组的mtDNA和PT值之间没有显著相关性（数据未显示）。

在单独的窗口中打开

图2

APAP过量患者血浆中的线粒体DNA。

测定APAP过量患者血浆中线粒体DNA的浓度。使用mtDNA中唯一编码的电子传输链的复合物I（NADH-deh）和复合物IV（Cyt-c-ox）亚基的引物，通过绝对定量实时PCR测量浓度。(A类和B类)来自2名代表性患者（Pt）的时间进程数据显示血浆中mtDNA浓度（Cyt c ox）和ALT活性。(C类)LT异常组患者血浆中ALT活性峰值与mtDNA峰值（Cyt c ox）浓度的散点图。显示了皮尔逊相关系数。(D类)健康志愿者血浆中mtDNA平均浓度(n个=6），正常LT组(n个=20）和LT异常组(n个=20），表示为平均值±SEM*P（P）与健康志愿者相比，<0.05。

服药过量患者血浆中的细胞核DNA断裂。

经毒性剂量的APAP治疗后，小鼠的细胞核DNA片段已被证实，并且在这些动物的肝毒性机制中起着重要作用(22,40). 此外，由于负责核DNA断裂的内切酶来自线粒体功能障碍期间的线粒体膜间隙(22)核DNA片段化可被视为线粒体功能障碍的另一个间接标志。我们使用带有抗DNA二级抗体的抗组蛋白ELISA，观察到异常LT组患者血浆中的核DNA片段随着时间的推移而增加（图​（图3）。三). 同样，这一密切跟踪的ALT活动（图​（图3，三，A–C）。结合GDH和mtDNA数据，这些结果为线粒体内容物和核DNA片段释放到胞浆中以及随后在细胞死亡后释放到外周血中提供了证据。

在单独的窗口中打开

图3

APAP过量患者血浆中的核DNA片段。

用酶联免疫吸附法（ELISA）检测APAP过量患者血浆中的核DNA片段，作为线粒体损伤的间接标志。(A类–C类)来自3名代表性患者的时间进程数据显示了DNA片段（以健康志愿者血浆OD/min平均变化的百分比表示）和ALT(D类)健康志愿者的平均DNA片段，表示为OD/min平均变化与健康志愿者血浆的百分比(n个=6），对于正常LT组(n个=20）和异常LT组(n个= 20). 数据表示为平均值±SEM*P（P）与健康志愿者相比，<0.05。

APAP过量患者缺乏半胱氨酸天冬氨酸酶激活。

一般认为，啮齿动物APAP肝毒性的主要细胞死亡模式是胀亡(41). 为了确定细胞凋亡是否参与人类的病理生理学，测定了血浆中caspase-3活性和caspase-3蛋白水平。在正常LT组中，未检测到caspase-3活性或caspase-2蛋白（图​（图4，4、A和B）。在APAP诱导的肝损伤患者中，血浆中明显存在前胱天蛋白酶-3（图​（图4A），4A） ，但既没有检测到活性的低分子量片段，也没有检测到酶活性的增加（图​（图4，4、A和B）。与患者的这些发现类似，在对照小鼠的血浆中未观察到caspase-3蛋白。APAP诱导的肝损伤导致血浆中选择性出现前酶（图​（图4A），4A） ，但也没有发现低分子量形式。相反，用半乳糖胺和内毒素（G/E）作为凋亡阳性对照治疗的小鼠，不仅在血浆中检测到caspase-3前体，而且还有一个活性片段（图​（图4A）。4A） ●●●●。与该观察结果一致，存在大量caspase-3酶活性（图​（图4B）。4B） ●●●●。因此，如果肝脏中存在相关的凋亡细胞死亡，如G/E治疗后(42)在血浆中发现了胱天蛋白酶-3酶活性和活性胱天蛋白酶-3片段。APAP过量后，人和小鼠血浆中没有这些参数，这表明凋亡不是细胞死亡的相关机制。

在单独的窗口中打开

图4

在APAP过量患者的血浆中未检测到Caspase-3激活。

(A类)通过免疫印迹法评估患者、经APAP或G/E治疗的小鼠或对照小鼠血浆中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3处理。人类和小鼠样品在不同的凝胶上进行，但用相同的抗体进行检测。全长（32 kDa）pro–caspase-3在异常LT患者组以及APAP或G/E治疗小鼠的样品中可检测到。仅在阳性对照G/E处理小鼠的血浆中可检测出裂解的活性caspase-2片段（17 kDa。(B类)G/E处理小鼠血浆中caspase-3的平均活性(n个=3），健康志愿者(n个=6），正常LT组(n个=20）和LT异常组(n个=20）基于caspase-3底物Ac-DEVD-AMC的裂解。表示为平均值±SEM*P（P）与健康志愿者相比，<0.05。

线粒体标记物的释放不是细胞坏死的次要影响。

线粒体和线粒体内容物可能会释放到血液中，并在血浆中因肿胀坏死而被检测到。为了验证血浆中高水平的GDH和mtDNA反映了APAP肝毒性的机制，而不仅仅是胀亡细胞的副作用，这些参数是在一个不被认为涉及线粒体的肝坏死模型中测量的。速尿是一种用于高血压和充血性心力衰竭患者的循环利尿剂。在高剂量下，速尿可导致肝损伤，而不会影响线粒体功能(43). 用这种药物治疗的小鼠在24小时时血清中的ALT活性显著增加（图​（图5A），5A） ，小叶中心坏死类似于APAP诱导的损伤（图​（图6）。6). 尽管此时GDH活性比对照组略有增加，但差异在统计学上并不显著（图​（图5A）。5A） ●●●●。同样，与经APAP治疗的小鼠的广泛增加相比，血清mtDNA浓度仅略有升高（图​（图5B）。5B） ●●●●。这些数据表明，高水平的血浆GDH和mtDNA表明APAP毒性的机制，而不仅仅是组织坏死的结果。

在单独的窗口中打开

图5

GDH和mtDNA释放到血液中并不是坏死的次要影响。

用APAP或速尿（FS）治疗小鼠以引起肝坏死，并在每种模型（FS为24小时，APAP为12小时）损伤高峰附近从这些动物的血浆中测量线粒体标记物。(A类)平均GDH和ALT活性。(B类)平均mtDNA浓度（Cyt c ox）。数据表示为平均值±SEMn个= 3–6. *P（P）与对照组相比<0.05。

在单独的窗口中打开

图6

APAP和速尿均可引起小叶中心坏死。

用APAP或速尿治疗小鼠以引起肝坏死，并在每个模型的损伤峰值附近用H&E染色肝脏切片（FS为24小时，APAP为12小时）。(A类和B类)未经治疗的对照小鼠或(C类和D类)300 mg/kg APAP后12小时或(E类和F类)400 mg/kg FS后24小时。原始放大倍数，×50(A类,C类、和E类); ×100 (B类,D类、和F类).

线粒体功能障碍与APAP肝毒性。

自20世纪80年代首次描述线粒体呼吸抑制和ATP耗竭以来，啮齿类动物就认识到中毒剂量的APAP导致的线粒体功能障碍(15,16,44). 最近的研究表明，APAP治疗后线粒体内氧化和亚硝化应激的发展以及线粒体MPT的发生(18–21). 使用高表达CYP（HepaRG）的人类细胞系，在培养的人类肝细胞中也发现线粒体功能障碍(25). 我们推断，如果患者的线粒体膜完整性受损，线粒体内容物泄漏到胞质溶胶中，那么当肝细胞坏死时，这些线粒体成分必须释放到循环中。我们的数据显示，ALT水平高的患者血浆中存在特定的线粒体成分GDH和mtDNA，这为人类APAP过量后发生线粒体功能障碍提供了证据。这些患者血浆中GDH的高活性与肝脏3区GDH的较高表达相一致(34)其中APAP引起的组织损伤最大。

这些机械结论背后的假设是，GDH和mtDNA的释放仅在涉及线粒体损伤时发生，而不仅仅是细胞损伤。通过证明速尿引起的肝细胞损伤证实了这一假设，速尿是一种不被认为影响线粒体的肝毒物(43)导致ALT释放，但小鼠血浆中mtDNA或GDH均无统计学意义的增加。相反，APAP过量会触发小鼠血浆中ALT和大量GDH及mtDNA的释放。因此，有理由得出结论，APAP诱导的人类肝损伤涉及线粒体损伤。GDH和mtDNA释放的时间进程与所有患者血浆中ALT的出现密切相关，提示线粒体损伤可能与细胞坏死密切相关。在实验动物中，恢复线粒体中ROS和过氧亚硝酸盐清除能力的干预措施(30,45–47)或阻止MPT(19–21)防止APAP诱导的肝损伤。此外，线粒体抗氧化防御的选择性损伤（部分MnSOD缺乏）加重了APAP的肝毒性(48). 此外，在小鼠肝细胞和人类HepaRG细胞中，线粒体功能障碍和氧化应激先于细胞坏死数小时(25,49). 因此，线粒体损伤是APAP诱导小鼠模型和人类肝细胞系细胞死亡的核心(19,21,25,49,50). 基于线粒体损伤生物标志物的释放与细胞坏死之间的密切关系，线粒体功能障碍可能是APAP过量患者肝细胞损伤的主要决定因素。然而，尽管这些密切相关，我们的数据并没有证明线粒体损伤是人类细胞死亡的原因。

核DNA损伤与APAP肝毒性。

除了线粒体损伤的生物标志物外，在APAP诱导的严重肝损伤患者的血浆中也检测到核DNA片段。DNA片段的检测基于核组蛋白的检测，而核组蛋白不存在于线粒体DNA中(39). 因此，抗组蛋白ELISA专门测量核DNA片段。在健康志愿者或无严重肝损伤的患者中未检测到血浆DNA片段。相反，肝损伤患者血浆DNA片段水平的时间进程与ALT释放密切相关，即细胞坏死。APAP过量后小鼠肝脏血浆DNA片段和核DNA损伤的比较显示，这两个参数均与ALT释放相关，表明核DNA损伤与细胞死亡同时发生。

先前对啮齿动物的研究表明，APAP后的DNA片段与凋亡的DNA片段无法区分(40,51). 此外，在细胞核中未检测到硝基酪氨酸残基(51). 这表明DNA损伤不是由氧化应激或过氧亚硝酸盐形成引起的，而是与核酸内切酶有关。由于APAP肝毒性期间缺乏相关的半胱氨酸蛋白酶激活(23,52)，可以排除传统的胱天蛋白酶激活的DNase。相反，在APAP诱导的细胞死亡过程中，EndoG和AIF从线粒体膜间隙释放并转移到细胞核(22). 防止线粒体氧化应激或防止MPT消除核DNA断裂(21,49,51). 在随后的一项研究中，发现Bcl-2家族成员Bax在APAP暴露后早期在线粒体外膜上形成孔，促进线粒体和核移位释放EndoG和AIF，从而触发最初的DNA损伤(53). 部分AIF缺乏降低线粒体氧化应激、AIF核移位和DNA断裂(54). 也有证据表明，一种通用的核酸内切酶抑制剂可以减弱APAP诱导的细胞死亡(55). 总之，这些发现表明，核DNA损伤依赖于线粒体功能障碍和膜间隙内切酶的释放。因此，在小鼠模型中，细胞核DNA损伤与肝细胞死亡密切相关，甚至有助于肝细胞死亡。鉴于核DNA在APAP诱导的肝损伤患者中的外观相似，很可能相同的DNA损伤机制也适用于人类肝脏。

DNA作为DAMP。

我们的数据表明，APAP过量后，核DNA片段和线粒体DNA释放到患者和小鼠的血浆中。这些分子可以通过激活TLR，特别是TLR9作为DAMP，诱导APAP后细胞因子的形成(56). 在小鼠模型中，由于APAP过量，促炎介质广泛形成，中性粒细胞募集到肝脏(57). 然而，绝大多数实验证据都反对中性粒细胞对损伤过程的相关贡献(58). 与这些发现一致，在小鼠APAP肝毒性的主要损伤阶段，从受损肝脏或血液中分离的中性粒细胞没有被激活(59). APAP过量患者中性粒细胞活化的初步数据似乎证实了损伤阶段中性粒细胞缺乏活化，但在以后的时间点显示出逐渐活化（C.D.Williams和H.Jaeschke，未发表的观察结果）。因此，在患者中，DAMP的释放，如损伤阶段的核DNA片段和mtDNA，可能有助于激活固有免疫细胞，后者参与清除坏死细胞碎片，从而有助于小鼠的恢复(58).

动物研究。

雄性C57BL/6小鼠从Jackson实验室购买，并被安置在一个环境控制的房间里，该房间有12小时的光照/12小时的黑暗周期，可以随意获得食物和水。对于APAP治疗，在将300 mg/kg APAP注入0.9%温盐水中之前，小鼠禁食一晚。其他随意喂食的动物腹腔注射400 mg/kg速尿，速尿溶解在pH 7.5–8.0的温磷酸盐缓冲盐水中，不禁食。作为caspase-3激活的阳性对照，一些喂食小鼠接受700 mg/kg半乳糖胺和100μg/kg内毒素诱导肝细胞凋亡。所有化学品均购自Sigma-Aldrich。在指定时间，动物因颈椎脱位而死亡。采集血液后，通过在14000–20000下离心获得血清克持续15-20分钟。切除肝脏，将小切片固定在10%的磷酸盐缓冲福尔马林中进行组织学分析。

临床化验。

在医院测量了血清中的ALT水平，随后在我们的实验室使用ALT试剂盒（Pointe Scientific）进行了确认。AST、凝血参数和胆红素也使用标准方案进行现场测量。

GDH活动。

GDH活性是使用帕索诺和劳里改良方法测定的(66). 简单地说，将10–100μl血浆的等分试样与25 mM醋酸铵、200μM NADH、100μM ADP和0.05%牛血清白蛋白（pH 8.0）混合在700μl 200 mM咪唑缓冲液中。在340 nm处监测NADH的消失以获得基线读数，然后添加50μl 2 mMα-酮戊二酸溶液以开始GDH反应。然后从GDH活性中减去基线活性。

DNA片段化。

根据制造商的说明书（罗氏公司），使用抗组胺ELISA和抗DNA二级抗体测量DNA片段。此外，用H&E对肝脏切片进行染色以评估坏死，用TUNEL原位细胞死亡分析（Roche）对DNA链断裂进行可视化，如前所述(23).

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活。

用一种与人和小鼠caspase-3（细胞信号传导）交叉反应的单抗，通过Western blotting评估Pro-caspase-3的加工。Caspase活性测量为Z-VAD-FMK–Caspase-3底物Ac-DEVD-AMC的可抑制裂解，如所述(42).

线粒体DNA。

如前所述，mtDNA通过绝对定量实时PCR测定(36). 使用QIAamp血液和迷你试剂盒（QIAAGEN）从血浆样本中分离出总DNA，该试剂盒可去除可能干扰PCR分析的血浆成分。然后对样品进行稀释，并将相同数量的总DNA添加到每个板上的每个反应中。用2对人引物测定线粒体DNA，1对人NADH脱氢酶引物（正向5′-ATACCATGGCAACCTCT-3′和反向5′-GGGCCTTTGCGTAGTTGTAT-3′）和1对人细胞色素引物c（c）氧化酶亚基III（正向5′-ATGACCCACATCACATCACATGC-3′和反向5′-ATCACATGGCTAGCCGGAG-3′）。为小鼠设计了另外2对引物：小鼠NADH脱氢酶亚基6（正向5′-CACAAAACATAACCACTTAAC-3′和反向5′-GTAGGTCAATGAATGAGTT-3′）和小鼠细胞色素c（c）氧化酶亚基III（5′-ACCAAGGCACACACACTCCT-3′和5′ACGCTCAGAACATCCTGCAAAGAA-3′）。为了构建标准曲线，通过差速离心从人类肝癌细胞（HepaRG）或小鼠肝脏中分离出线粒体颗粒。线粒体基因和核编码β-肌动蛋白的引物通过实时PCR验证线粒体DNA标准的纯度。制备这些纯化mtDNA样品的稀释液，并在每个PCR板上为每个测试基因添加标准。测定的检测限小于0.05 ng/ml。

统计。

Shapiro-Wilk检验用于评估正常情况。为了检验统计显著性，对非正态分布的患者数据使用Kruskal-Wallis非参数方差分析，然后进行Dunn多重比较，以检验组间的显著性。未配对双尾学生t吨试验用于评估治疗组中对照动物和实验动物的数值之间的显著性。为了检验患者血浆中两个参数之间的相关性，计算了皮尔逊相关系数。对于所有测试，P（P）<0.05被认为是显著的。

这项研究得到了美国国立卫生研究院R01 DK070195和R01 AA12916拨款的部分支持，这是堪萨斯大学医学中心肝脏中心的一项试点拨款，以及美国国立卫生研究院国家研究资源中心和国家普通医学科学研究所的P20 RR016475和P20 RR021940拨款（8 P20 GM103549-07）。M.R.McGill和C.D.Williams得到了国家环境健康科学研究所环境毒理学培训计划（T32 ES007079-26A2）的支持。此外，S.C.Curry和H.Jaeschke还得到了麦克尼尔消费者健康基金的资助。