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基因组生物学。2004; 5（9）：R66。
2004年8月12日在线发布。 数字对象标识：10.1186/gb-2004-5-9-r66
预防性维修识别码：PMC522873型
采购管理信息：15345050

乳腺癌细胞中雌激素受体α靶基因和反应元件的发现

林进友,通讯作者1 安德斯·斯特罗姆,2 Vinsensius Berlian织女星,1 说李刚,1 杨爱莉,1 简·S·汤姆森,2 万青禅,1 巴尔拉吉·多雷,1 Dhinoth K班加罗萨米,1 阿迪卡拉万·拉马萨米,1 莉莎·A·维加拉,1 隋盛堂,三 张爱伦（Allen Chong）,三 弗拉基米尔·巴基奇,三 兰斯·德·米勒,1 扬·奥克·古斯塔夫松,2,4和爱迪生·T·刘通讯作者1
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关联数据

补充材料

简短摘要

微阵列分析已确定89个雌激素靶基因。这个顺式-这些基因上游的调控元件在小鼠和人类中没有很好的保守性。

摘要

背景

雌激素及其受体在人类发育、生理和疾病中都很重要。在本研究中，我们利用全基因组分子和计算集成方法来表征激活的雌激素受体（ER）与候选靶基因调控元件之间的相互作用。

结果

在本研究调查的大约19000个基因中，我们在T-47D细胞中观察到137个ER调节基因，其中只有89个是直接靶基因。异质性的Meta分析在体外和体内数据集显示，T-47D和MCF-7细胞中的表达谱显著相似，并且与ER阳性和ER阴性肿瘤之间差异表达的基因重叠。计算分析显示，雌激素反应元件（ERE）在顺式-直接靶基因的调控区。染色质免疫沉淀证实，在我们排名最高的ER直接靶基因中计算预测的ERE中，配体依赖性ER结合，自然保护区1,绿色1和澳大利亚广播公司3.更广泛地检查顺式-转录起始位点两侧的调控区域在小鼠和人类的比较中显示，只有6%的预测ERE存在物种保护。

结论

只有一小部分核心人类基因在实验系统中得到验证，并且与乳腺肿瘤中的内质网状态密切相关，似乎足以在乳腺癌细胞中诱导内质网效应。那个顺式-这些核心ER靶基因的调控区保守性较差，表明转录控制元件的进化机制不同于编码区的进化机制。这些结果预测，雌激素信号的某些生物学效应在小鼠和人类之间的差异将比先前认为的更大。

背景

雌激素参与许多脊椎动物的发育和生理过程。人类和动物研究揭示了雌激素受体（ER）在男女性发育和行为、生殖功能、神经内分泌和心血管系统的调节以及骨代谢中的作用[1]. 乳腺肿瘤的分子特征和流行病学研究也表明雌激素和雌激素受体在乳腺癌的发生、发展和治疗中具有重要作用[2,三].

已知两种ER亚型，ERα和ERβ，可介导雌激素信号；它们作为配体依赖的转录因子发挥作用[4]. 在穿过细胞膜后，雌激素与受体结合，导致受体活化。ER与顺式-靶基因的调节元件直接与先前描述的保守雌激素反应元件（ERE；5'-GGTCANNNTGACC-3'，其中N是任何核苷酸）结合，或间接与AP-1和Sp1转录因子复合物及其各自的结合位点结合[5-9]. 辅激活物和辅阻遏物与雌激素受体形成复合物并参与调节雌激素反应[10]. 靶基因调控元件的ER和转录复合物的周期性周转也提供了一种额外的调控机制[11-13]. 共调节因子、相关转录因子复合物、受体亚型和剪接变异体的组织特异性分布是观察到雌激素多效性作用的潜在机制[14]. 在分子水平上，ER激活的结果似乎是靶基因转录活性和表达谱的改变。许多基因，包括三叶因子1/pS2、组织蛋白酶D、细胞周期蛋白D1、c-Myc和孕酮受体的基因，都受到ERα的正向调节[15-20]. 雌激素受体的转录抑制已有文献记载，但尚未得到很好的研究或理解。

已经进行了微阵列实验，特别是在乳腺癌细胞系中，以研究雌激素治疗后基因表达谱的改变[21-27]. 然而，利用这些反应基因的初始清单，包括跨细胞系反应的整体保存，许多关键问题仍有待解决，体内与乳腺肿瘤的相关性，以及顺式-调节元件定位、分子特征和ER与假定靶基因之间相互作用的确认。在本研究中，我们采用组合方法，通过使用高密度DNA微阵列来发现和表征ERα靶基因，以获得ERα阳性（EPα+)乳腺肿瘤细胞。这包括检查ER-介导和翻译依赖性调节的药物治疗，整合额外的在体外雌激素应答数据和人类乳腺肿瘤样本基因表达数据用于候选基因验证和相关鉴定体内靶点、计算结合位点建模和启动子分析以绘制推测的ER结合位点，染色质免疫沉淀（ChIP）以表征ER和候选靶基因调控元件之间的相互作用。在这里，我们展示了我们的发现，并讨论了它们为ER介导的转录调控网络的全基因组结构及其在细胞系、乳腺肿瘤和进化中的保护提供的见解。

结果

雌激素反应的全球基因表达谱

高密度DNA微阵列是一种强大的工具，可以同时确定数千个基因的转录谱，特别适合于转录因子功能的研究。先前确定MCF-7激素治疗后基因表达谱变化的努力[21-25,27]和ZR-75-1[26]呃+乳腺癌细胞株产生了许多新的雌激素反应基因，并证明了这种基因组技术在研究雌激素生物学中的实用性。然而，这些早期的研究只包括在有限的时间点进行抗雌激素和环己酰亚胺（CHX）治疗，或仅在少数假定应答基因的验证分析中进行。因此，为了更全面地绘制由ER调节的转录调控网络，并在额外的ER中生成数据+乳腺肿瘤细胞背景下的跨细胞系分析，我们治疗雌激素依赖性T-47D ER+含有17β-雌二醇（E2）和E2与纯抗雌激素ICI 182780（ICI）或蛋白合成抑制剂CHX联合的乳腺癌细胞系，并进行了高分辨率的时间进程基因表达分析（见图​图1a1a个治疗和时间点）使用斑点寡核苷酸（60-mers）微阵列，其中包含约19000个人类基因的探针。本研究中使用的E2（1 nM）和ICI（10 nM）浓度分别足以驱动和抑制激素反应性细胞增殖。T-47D细胞在核型异常和核受体共同调节因子表达水平上与之前使用的细胞株MCF-7和ZR-75-1不同，但具有在更生理水平上表达ER的优势[28,29]. 在激素治疗后的前8小时（0-8小时），每小时采集一次样本，在接下来的16小时（10-24小时），共采集16个时间点的样本（图​（图1a1a个).

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T-47D细胞雌激素反应时程分析的实验设计和微阵列数据选择。（a）在用二甲基亚砜（DMSO；载体对照）、17β-雌二醇（E2）和E2与ICI 182780（ICI）和环己酰亚胺（CHX）联合处理之前，使细胞缺乏血清和雌激素24小时。在指定的16个时间点采集样本。（b）确定直接ER目标的程序。雌激素反应基因的数据选择基于第页-价值截止点(第页≤0.052）和响应幅度（三个时间点在同一方向上至少变化1.2倍）。ICI敏感性和CHX不敏感性也通过统计方法测定，第页≤0.058和第页分别≥0.24。截止值由组织蛋白酶D和孕酮受体的表达谱决定，这两种受体均受ER调节。

通过使用双尾配对对E2处理的样本与模拟处理的对照组中的表达比率进行统计分析，确定雌激素应答基因t吨-使用测试第页-价值截止。此外，在三个或更多时间点内，基因在同一方向上的变化至少为1.2倍。我们选择数据选择标准的依据是观察到的已知激素应答和ER靶基因的表达水平和特征，如孕酮受体、组织蛋白酶D和锡酸钙2。E2反应性选择反应基因(第页<0.052）并过滤ICI灵敏度(第页<0.057）和CHX不敏感(第页>0.24）通过比较E2处理样品与E2+ICI和E2+CHX样品，分别分离出推测的ER下游靶点和直接靶点。图​图1b1亿总结了选择过程的统计信息。雌激素反应基因的表达谱通过艾森聚类图进行可视化，并通过层次聚类对基因进行排序[30].

雌激素反应基因（图​（图2a），2a个)，表达谱分为两组：激素治疗上调的基因（图​（图2a，2a个，红色）和那些被下调的（图​（图2a，2a个，绿色）。在应答基因中，58.5%（226/386）在雌激素治疗后上调。图​图2b2亿显示了由雌激素受体（ER）特异性调节的137个基因的表达谱（定义为对雌激素有反应并被ICI治疗阻断，图​图2b，2亿，右侧面板）。这些基因以与雌激素反应基因相似的方式聚集。一项值得注意的发现是，由E2反应和ICI敏感性决定的ER调节基因仅占所有雌激素反应基因的35.5%（137/386），这表明在介导激素暴露的转录反应中可能存在ER依赖性信号转导机制。有趣的是，ICI对E2-上调基因的影响似乎大于下调基因，因为这些上调基因占ICI敏感亚群的71.5%（98/137）。89个主要反应基因构成了推测的ER直接靶点，定义为对激素治疗有反应，对ICI敏感，但不受CHX治疗的影响（图​（图2c，2厘米，右侧面板）。从这些观察结果来看，参与乳腺癌细胞启动激素反应的直接靶基因数量可能仅占人类基因组中基因的0.47%（89/18912）。假定的ER靶基因列表如表所示​表1，1E2应答基因的完整列表见附加数据文件4。先前显示为ER靶基因的基因以粗体显示（见表​表1）。1). 我们注意到，我们列表中的5个直接靶基因与唯一其他已发表的微阵列研究中的结果相对应，该研究将抗雌激素和CHX治疗作为实验设计的一部分[26]. 这两个数据集之间的差异可能是由于细胞株、实验设计、阵列平台和用于选择靶基因的过滤参数的差异。例如，Soulez和Parker的研究[26]使用仅在两个时间点（6小时和24小时）测试的ZR-75-1细胞。此外，该研究中使用的Affymetrix HuGeneFL阵列包含5600个基因的探针，而我们的阵列上有近19000个基因，代表了具有已知局限性的早期阵列技术。同样，我们的直接靶基因列表中缺少已知的靶基因TFF1/pS2和细胞周期蛋白D1可能是由于T-47D细胞中转录辅因子和基因组异常的差异。c的缺失-MYC公司我们名单上的原癌基因可能是因为我们研究中使用的阵列中没有探针。

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雌激素反应基因的表达谱。（a）通过层次聚类和Eisen TreeView软件对386个E2反应基因进行可视化。列表示按时间顺序排列的时间点，每行表示特定基因的表达谱。按照惯例，上调用红色信号表示，下调用绿色信号表示。变化的幅度与信号的亮度成正比。每个面板代表列标题中所述的治疗条件。（b）ICI和（c）包括CHX处理，以分别鉴定137个ER调节基因和89个初级反应基因。

表1

推测ER靶基因列表

加入号码符号基因名称时间点数量*基因本体论
（a） 推测ER靶基因上调（89个中的59个）
AL049265号mRNA；cDNA DKFZp564F05314生物工艺未知[00000004]
NM_003246号泰铢1凝血酶敏感蛋白113细胞粘附[0007155]
NM_016339链接-GEFII连接鸟嘌呤核苷酸交换因子II13神经发生学[0007399]
U79299型OLFM1型Olfactomedin 113信号转导[0007165]
AK026062号DNAJC1公司DnaJ（Hsp40）同系物，C亚家族，成员112蛋白质折叠[0006457]
M62403型 IGFBP4型 †胰岛素样生长因子结合蛋白412信号转导[0007165]
NM_001089号澳大利亚广播公司3†ATP-装订盒，子家族A（ABC1），成员312ATP-装订盒（ABC）运输机[0004009]
NM_003714号STC2系统钙锡212细胞间信号[0007267]
AF075060型假想蛋白DKFZp761P042311生物工艺未知[00000004]
AF271070型SLC38A1型溶质载体系列38，成员111氨基酸转运[0006865]
AK024639公司假设蛋白FLJ2098611阳离子运输[0006812]
AL080199号mRNA；cDNA DKFZp434E08211生物工艺未知[00000004]
NM_014365号H（H）11蛋白激酶H1111转化监管，启动[0006446]
AF245389型 绿色1 †‡GREB1蛋白10高亲和力锌离子转运[0006830]
NM_002894号 RBBP8型 †视网膜母细胞瘤结合蛋白810DNA修复[0006281]
纳米_005067SIAH2号机组七个缺席同源物2(果蝇属)10泛素依赖性蛋白质降解[0006511]
U16752号机组 CXCL12系列 †趋化因子（C-X-C基序）配体12（基质细胞衍生因子1）10免疫应答[0006955]
AF086500型FZD8型卷发同源物8(果蝇属)9生物工艺未知[00000004]
AF176012型JDP1公司含J结构域的蛋白质19生理过程[0007582]
AF182416型NIF3L1NIF3 NGG1相互作用因子3样1（S.pombe）9DNA甲基化[0006306]
AK023772号假设蛋白质FLJ137109开发过程[0007275]
AK024361号假设蛋白质FLJ142999转录调控[0006355]
AK025812cDNA:FLJ22159 fis，克隆HRC00251，mRNA序列9生物工艺未知[00000004]
NM_001037号SCN1B型钠通道，电压门控，I型，β多肽9钠运输[0006814]
纳米_003287TPD52L1型肿瘤蛋白D52样19信号传感器[0004871]
NM_003646号DGKZ公司二酰甘油激酶，zeta 104 kDa9信号转导[0007165]
NM_014333号IGSF4型免疫球蛋白超家族，成员49毒力[0009406]
纳米_016300ARPP-21协议环腺苷酸调节的磷酸蛋白，21 kD9生物工艺未知[00000004]
AF200341型HPYR1型幽门螺杆菌响应18生物工艺未知[00000004]
AK023199号cDNA FLJ13137 fis，克隆NT2RP3003150，mRNA序列8生物工艺未知[00000004]
AK025571假设蛋白质FLJ219188RNA处理[0006396]
D00265号中国青年科学院细胞色素c，体细胞8电子输运[0006118]
纳米_000926 PGR公司 †孕酮受体8信号转导[0007165]
NM_001634号AMD1公司S-腺苷蛋氨酸脱羧酶18多胺生物合成[0006596]
NM_002184号IL6ST（IL6ST）‡白细胞介素6信号转导子（gp130，抑癌素M受体）8信号转导[0007165]
NM_003489 自然保护区1 †核受体相互作用蛋白18转录调控[00066355]
NM_004878号PTGES公司前列腺素E合成酶8前列腺素代谢[0006693]
NM_012111C14或3染色体14开放阅读框38蛋白质折叠[0006457]
NM_015878号OAZIN公司鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制剂8多胺生物合成[0006596]
AK023680PPP1R15B型蛋白磷酸酶1，调节（抑制剂）亚单位15B7生物工艺未知[00000004]
NM_001909号 CTSD公司 †组织蛋白酶D（溶酶体天冬氨酸蛋白酶）7蛋白质分解和肽解[0006508]
NM_003774号GALNT4公司UDP-N-乙酰-α-D-半乳糖胺：多肽N-乙酰半乳糖氨基转移酶47生物工艺未知[00000004]
NM_014810CAP350型中心体相关蛋白3507非选择性囊泡转运[0006899]
NM_016391热休克蛋白111假设蛋白HSPC1117主绞线伸长[0006272]
AK021773号cDNA FLJ11711 fis，克隆HEMBA1005152，mRNA序列6生物工艺未知[00000004]
AK025766公司BRI3BP公司BRI3结合蛋白6生物工艺未知[00000004]
L23401型人类重复区mRNA6生物工艺未知[00000004]
NM_000427号LOR公司洛里克林6细胞形状和细胞大小控制[0007148]
NM_001932号MPP3（MPP3）膜蛋白，棕榈酰化3（MAGUK p55亚家族成员3）6信号转导[0007165]
纳米_002227日本1号机组Janus激酶1（一种蛋白酪氨酸激酶）6蛋白质磷酸化【0006468】
NM_006392号NOL5A（无5A）核蛋白5A（56 kDa，含KKE/D重复序列）6转录[0006350]
NM_006796AFG3L2型AFG3 ATP酶家族基因3-样2（酵母）6生物工艺未知[00000004]
NM_013324CISH公司细胞因子诱导的含SH2蛋白6JAK-STAT级联[0007259]
NM_016233号PADI3型肽基精氨酸脱氨酶，III型6蛋白质修饰[0006464]
NM_020120号UGCGL1公司UDP-葡萄糖神经酰胺葡萄糖基转移酶样16蛋白质修饰[0006464]
AB037842号KIAA1421号机组‡KIAA1421蛋白5RNA依赖的DNA复制[0006278]
NM_001116号ADCY9公司腺苷酸环化酶95信号转导[0007165]
NM_014121PRO0233蛋白5双品牌断口修复[0006303]
NM_018053号假设蛋白质FLJ103075细胞死亡[0008219]
（b） 推测ER靶基因下调（89个中的30个）
NM_012342号 国家气象局 †推测跨膜蛋白13酪氨酸合成黑色素[0006583]
AF039944型国家发改委1N-myc下游调控基因111生物工艺未知[00000004]
AL049471号mRNA；cDNA DKFZp586N01211生物工艺未知[00000004]
AK024964号美国国家足球协会核因子I/A9DNA复制[0006260]
M16006型SERPINE1系列丝氨酸（或半胱氨酸）蛋白酶抑制剂，E族，成员19急性相反应[0006953]
NM_004438号EPHA4型EphA49信号转导[0007165]
纳米_006449CDC42EP3系统CDC42效应蛋白（Rho-GTPase结合）39信号转导[0007165]
AK026298号NMES1型正常食管粘膜特异性18生物工艺未知[00000004]
D16875号人HepG2 3'区cDNA，克隆hmd1f06，mRNA序列8生物工艺未知[00000004]
NM_002237号KCNG1型钾电压门控通道，G亚家族，成员18钾运输[0006813]
NM_003032号SIAT1公司唾液酰基转移酶1（β-半乳糖苷α-2,6-唾液酰基转移酶）8蛋白质修饰[0006464]
NM_006605RFPL2食指蛋白样28蛋白质结合[0005515]
AK025922号假设蛋白质FLJ222697开发过程[0007275]
NM_000504号F类10凝血因子X7蛋白质分解和肽解[0006508]
纳米_001139ALOX12B型花生四烯酸12-脂氧合酶，12R型7表皮分化[0008544]
NM_004354号CCNG2公司细胞周期蛋白G27细胞周期检查点[0000075]
NM_006137CD7（CD7）CD7抗原（p41）7体液防御机制[0006959]
NM_007273REA公司‡雌激素受体活性抑制剂7细胞增殖阴性对照[0008285]
NM_014583号LMCD1型LIM和富含半胱氨酸的结构域17转录因子[0003700]
NM_017572MKNK2型MAP激酶相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶27蛋白质磷酸化[0006468]
D49356号人类mRNA（S100C相关基因）6细胞周期[0007049]
NM_001878号CRABP2型细胞维甲酸结合蛋白26信号转导[0007165]
NM_004388号CTBS公司壳二糖酶，二-N-乙酰-6碳水化合物代谢[0005975]
NM_006622号SNK公司血清诱导激酶6蛋白质磷酸化[0006468]
AK022072号cDNA FLJ12010 fis，克隆HEMBB1001635，mRNA序列5生物工艺未知[00000004]
AL137529号假设蛋白质FLJ237515脂质代谢[0006629]
NM_000430号丝瓜1b1血小板活化因子乙酰水解酶，亚型Ib，α亚单位45 kDa5信号转导[0007165]
NM_013332号高强度气体2低氧诱导蛋白25生物工艺未知[00000004]
NM_014770CENTG1标准半人马座，伽马15细胞生长和/或维持[0008151]
NM_001719 骨形态发生蛋白7 †骨形态发生蛋白7（成骨蛋白1）4细胞生长和/或维持[0008151]

*在同一方向选择标准中满足1.2倍变化的时间点数量。†粗体的基因以前被证明是其他内质网的直接靶基因+乳腺肿瘤细胞系（ZR75-1和/或MCF-7）。‡单独的CHX治疗对这些基因具有激动作用；因此，E2对CHX的敏感性尚不清楚。

为了控制独立于E2的ICI和CHX的混杂直接效应，我们还仅用ICI处理细胞2、8、12或24小时，或仅用CHX处理细胞2或8小时。CHX治疗通过诱导CHX、E2或E2+CHX治疗后可检测到的E2样效应，部分掩盖了89个符合假定直接靶基因选择标准的基因中4个（4.5%）的反应（见附加数据文件5和6）。由于这个结果不排除这些基因作为直接靶点，我们将它们列入直接靶点列表，但在表中注意到了这一警告​表1。1在32个E2应答基因中，CHX单独处理与E2处理的效果相反（8.3%；32/386）。然而，在激素和药物同时存在（E2+CHX）的情况下，CHX不会拮抗这些基因的E2反应，因此不会影响假定直接靶点的选择。仅ICI处理就在九个（2.3%；9/386）E2应答基因中引发了意料之外的E2样反应（即E2、ICI或E2+ICI处理后的相同反应）。由于这9个基因不符合ICI拮抗的选择标准，因此推测的直接靶基因也没有受到影响。因此，ICI和CHX的独立效应并没有实质性改变我们分析中的最终基因列表或结论。

T-47D和MCF-7雌激素反应谱的比较

许多乳腺癌细胞系已用于在体外关于雌激素反应的研究，但大多数数据，包括已发表的微阵列研究的数据，都来自于使用MCF-7细胞的实验。因此，我们有兴趣比较我们研究中使用的MCF-7细胞和T-47D细胞对激素治疗反应的表达谱。为了进行分析，我们获得了一个公开的MCF-7激素和三苯氧胺反应数据集[31]来自斯坦福微阵列数据库[32].

使用构建166中的Unigene簇ID作为两个数据集之间的通用标识符，我们从137个T-47D ER调节基因中的104个中提取了表达数据（图​（图3a）3a年)也存在于MCF-7数据集中。对于MCF-7数据中具有多个条目的基因，选择具有最完整数据或与T-47D结果类似表达谱的条目进行分析。总的来说，MCF-7实验的结果对应于T-47D细胞中获得的响应基因的大多数（64%；66/103）表达谱，如激素治疗后MCF-7细胞中可用数据点的相同方向变化所定义（见图​图3a）。3a年). 使用MCF-7 E2反应和三苯氧胺治疗敏感性数据的严格选择标准（见材料和方法），我们在MCF-7和T-47D数据集中发现了24个可被定义为ER调节的基因。值得注意的是，这两项研究之间高度一致，24个基因中有23个（96%）的基因对雌激素的表达反应一致（图​（图3b）。3亿). 相反，尽管使用了相似的实验系统和相同的阵列平台，但来自无关干细胞研究的微阵列数据集几乎没有一致性[33]. 这项研究中确定的基因与Frasor及其同事报告的雌激素反应基因之间的许多重叠进一步证实了这些发现（数据未显示）[23]. 我们使用不同的实验设计和阵列平台观察到的两个ER研究之间的相似性表明，这两个ER+细胞系具有共同的雌激素反应途径。

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对T-47D和MCF-7乳腺癌细胞系雌激素反应基因表达谱的比较分析显示出类似的反应。（a）T47-D细胞中103个对E2敏感且对ICI治疗敏感的基因的表达数据显示，64%（66/103）的基因（以洋红突出显示）对E2的反应一致。（b）如果选择MCF-7数据作为E2反应和三苯氧胺（Tam）敏感基因（参见材料和方法），则两个数据集之间有24个基因重叠，E2和抗雌激素ICI或三苯氧乙烯的反应高度一致（洋红色），接近96%（23/24）。

乳腺肿瘤中ER调节基因的差异表达

我们希望解决的一个关键问题是在体外细胞系中的观察反映了生物学意义体内为了解决这个问题，我们探索了在我们的在体外分析和乳腺肿瘤样本中ER状态相关的表达谱。我们假设ER靶基因在乳腺肿瘤中的差异表达与ER状态相关。例如，在MCF-7细胞中，pS2/TFF1和细胞周期蛋白D1都被雌激素处理上调，在ER中以更高的水平表达+肿瘤[34,35].

许多乳腺癌微阵列研究表明，ER状态仍然是最重要的预后标志物和肿瘤分类器。六项乳腺癌微阵列研究的表达数据（L.D.M.、B.M.F.Mow、L.A.V.和E.T.L.，未发表的工作和[36-40])挖掘差异表达的基因(第页-值<0.01错误发现率，ER+与ER相比-)与ER状态相关的人类乳腺肿瘤样本。在T-47D研究中确定的137个ER调节基因（E2反应，ICI敏感）中，至少有一项乳腺癌研究中有44个基因存在差异表达（图​（图4）。4). 在3812个符合选择标准的ER状态相关基因中，44个ER调节基因仅占约1%（44/3811）(第页<0.01（在一项或多项研究中），表明雌激素反应途径仅代表乳腺肿瘤中ER状态相关转录组的一小部分。这与Meltzer及其同事之前的观察结果类似[22,39]. 然而，与我们研究中使用的微阵列中这些ER调节基因的频率相比，ER状态相关基因中的ER调节基因似乎显著丰富（1.15%，44/3811 vs 0.72%，137/18912，第页=0.006（通过X平方分析）。

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细胞系研究中确定的雌激素反应基因在ER中也有差异表达+乳腺肿瘤与ER的比较-肿瘤。在所调查的六项乳腺肿瘤研究（L.D.M.、B.M.F.Mow、L.A.V.和E.T.L.，未发表的工作和[36-40]）中，将雌激素应答基因表达谱与这些基因的复合表达率进行比较。差异表达基因定义如下第页ER之间<0.01+和ER-肿瘤样本。ER中反应类似的基因+肿瘤和在体外以下E2处理以洋红色突出显示。

为了比较反应基因和差异表达基因的表达谱，我们绘制了每个基因的平均相对表达率（ER+/急诊室-)乳腺癌研究的所有样本（图​（图4）。4). T-47D细胞中的雌激素反应基因与乳腺肿瘤中差异表达的基因之间存在惊人的一致性（70.5%；31/44）。例如，激素治疗上调了基因（图​（图4，4，左面板，红色）也在ER中过度表达+乳腺肿瘤（图​（图4，4，右侧面板，红色）。我们注意到雌激素治疗后出现相反反应的基因亚群（29.5%；13/44）在体外与肿瘤中ER状态相关表达相比。然而，这13个在细胞系和肿瘤数据之间不一致的基因在两个细胞系（T47-D和MCF-7）中是一致的。这表明一些下游通路的调控依赖于环境，这在原发性肿瘤和实验性细胞系之间可能是不同的。综上所述，我们注意到在体外经验证的雌激素反应基因在ER中也有差异表达+因此可能具有直接的生物学和临床意义。

ER结合位点的计算建模和预测

先前的研究已经确定DNA中的一致ERE和AP-1或Sp1-结合位点可能是的靶基序。这表明89个直接反应基因应在转录控制区内富集这些结合基序。为了进一步探索这一点，我们通过计算提取了候选基因转录起始位点（TSS，见材料和方法部分）侧翼（-3000至+500）的序列，该位点被定义为NCBI RefSeq数据库中参考转录物的最大5'核苷酸，并查询其潜在的ER-binding位点。之所以选择起始位点两侧序列的大小和位置，是因为大多数具有特征的ER-binding位点都已映射到已知靶基因中的这些区域[5].

对于结合位点预测，我们使用了前面描述的ERE模型[41]TRANSFAC数据库中的AP-1和Sp1结合位点位置权重矩阵[42]. 我们还将GATA1转录因子的结合位点作为阴性对照，因为它不参与ER结合。所有调查位点的模型灵敏度都设置在ERE模型的既定最佳设置下，即在检测模型的训练数据中的已知结合位点时灵敏度为83%。图​图55显示了ERE的性能（图​（图5a），5a级)，AP-1（图​（图5b），第5页)，Sp1（图​（图5c），5厘米)和GATA1（图​（图5d）5天)绑定站点模型。这个年-每个图的轴表示结合位点预测的相对频率，由具有预测结合位点的基因占查询基因总数的比例决定；这个x个-轴表示每个基因组中被调查的最重要基因的数量，按统计显著性排序（参见材料和方法）。由于短结合位点基序在人类基因组中普遍存在，我们询问与无反应基因相比，在3.5 kb的反应基因上游窗口中是否存在此类反应元件的富集。每个基序的丰富性由假定靶基因结合位点预测相对频率的差异表示（图​（图3，三，实线）和非应答基因（图​（图3，三，支离破碎的线条）。对于ERE预测，我们观察到10个最重要的初级反应基因中的推定位点比最无反应的对照组富集了三倍（图​（图3a），3a年)，25个和50个最显著的基因分别富集了两倍和大约70%。总的来说，ERE位点在推测的ER直接靶基因中的富集具有统计学意义(第页=0.0027）。目标基因中假定的Sp1位点的富集程度较低，但未达到统计显著性（10个最重要的目标基因富集12.5%；第页= 0.085). 这是预期的，因为Sp1位点在人类基因组中非常常见，并且在一般转录调控中具有额外功能。我们没有观察到AP-1位点的任何富集(第页=0.66）或阴性对照GATA1位点(第页= 0.51). 这些发现表明，ERE是在全基因组范围内调节ER靶基因特异性调节的主要反应元件。我们还推测，虽然已知Sp1和AP-1结合位点可促进某些靶基因中的内质网功能，但它们并不是一种常见的内质网膜靶基因顺式-人类基因组中的调节元件，至少不足以区分目标基因和非响应基因。

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ERE样序列富集在假定靶基因的扩展启动子区域。（a）使用先前发布的模型和优化的灵敏度设置进行ERE预测。根据统计显著性排序，对最重要的推测ER靶基因和非响应基因的扩展启动子区域（-3000到+500，两条链）进行预测模型测试。这个年-轴表示结合位点预测的相对频率，其由具有预测位点的基因的数量除以基因的总数来确定。查询的最重要基因的数量显示在x个-轴。推测靶基因中ERE预测的频率明显更高(第页=0.0027）。结合位点预测也使用描述（b）Sp1、，（c）AP-1和（d）已知Sp1和AP-1都参与调节某些靶基因的ER结合。GATA1位点被列为阴性对照。这些位点在假定的靶基因中没有显著富集（参见第页-图中的值）。

为了确定预测的ERE的保守性和潜在功能，我们还检测了89个假定的人类ER靶基因的小鼠直系同源基因5'上游区域中的相同3.5 kb窗口。从小鼠基因组数据库中提取了72对人-鼠同源基因对[43]以及为潜在ERE划定和分析的调节区域，如人类序列所述（见材料和方法）。然后，我们比较了这两种生物体的ERE预测，以了解以下特征：当两种生物体中预测出多个ERE时，核心ERE半位点（GGTCANNTGACC）在两个最相似的序列之间的保存，不包括侧翼嘌呤碱；保护预测ERE的5'和3'端两侧的20个碱基（总共40个碱基）；以及结合位点序列和TSS之间的距离。

我们的分析统计总结如图所示​图6a。第6页在鼠-人同源对中，81%（58/72）至少有一个ERE预测，22（31%；22/72）个基因对在两种生物体中都有ERE预测。然而，在人类直接靶基因中，29%（21/72）的小鼠同源基因上游没有ERE。相反，21%（15/72）患有ERE的小鼠基因在其人类直向同源物的上游没有ERE。在这两种生物体中具有ERE预测的22个基因对中（见图中的维恩图​图6b），6b条)，只有四个具有核心ERE序列的完美保守性（表​（表2）。2). 这四个完全保守的ERE对在其侧翼序列中也具有最高的保守性（平均同一性=74%），而在结合位点的相对位置上差异最小（平均差异Δd日=469个碱基）。事实上，如果预测的ERE为绿色1（人类，NM_014668号; 鼠标，NM_015764号)其相对位置相差1.7kb，被排除在分析之外。对于核心序列中有一个或多个碱基偏差的ERE鼠-人对，侧翼序列和预测ERE的相对位置几乎没有守恒性（见表​表2）。2). 这些发现表明，尽管ERE基序在进化过程中是保守的，但在靶基因的5'调控区发现的特定ERE很少保守。他们还表明，人类和啮齿类动物在内质网功能的分子机制和靶基因库方面存在潜在差异。有鉴于此，我们根据动物研究结果对人类ER功能的推断可能需要重新评估和额外验证。

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人类和小鼠直系亲属的比较。（a）来自人类和小鼠同源假定靶基因对中预测ERE的比较分析的统计数据。（b）维恩图显示，在提取用于分析的72对同源对中，只有22对在人类和小鼠序列中进行了ERE预测。

表2

22对人和小鼠同源基因对预测ERE的比较分析

基因符号人类鼠标%身份*相对位置*（Δd日)
参考序列ID预测的数量参考序列ID预测的数量核心ERE侧翼区域
ALOX12B型NM_001139号三纳米_00965941008740
自然保护区1NM_0034892NM_173440号41007270
绿色1NM_014668号2NM_015764号2100721,720
ACP33型NM_016630三NM_13858441006646
10层纳米_0005042NM_007972号690492,003
SERPINE1系列NM_000602号4NM_008871三902341
CTSD公司NM_001909号三NM_009983号190261,310
OAZIN公司NM_015878号1NM_018745号190192,264
PADI3型NM_016233号4NM_011060290214,153
未知NM_0177702NM_019423190283,828
JDP1公司NM_0218001NM_013888号190301,089
NIF3L1NM_0218241NM_022988号29028955
SCN1B型NM_001037号2NM_011322180362,716
STC2系统NM_003714号1NM_011491号280262,638
LOR公司NM_000427号2NM_008508270324,253
ADCY9公司NM_001116号4纳米_009624170283,042
AHCYL1型NM_006621号1NM_145542270322,190
CISH公司NM_0133241NM_009895号三70191,624
热休克蛋白111NM_0163911纳米178605170191,302
FLJ22269型NM_0322192NM_172883170473,391
DNAJC1公司NM_022365号1NM_007869160301,672
CDC42EP3系统NM_0064491NM_026514号15025451

*ERE的%同一性和相对位置是指两种生物之间具有最高保守性的预测对。

染色质免疫沉淀法验证直接内质网靶基因

基因组学和信息学方法使我们能够识别符合ER靶基因传统定义的基因（例如，对E2敏感、对ICI敏感和对CHX不敏感），在ER中是保守的+乳腺癌细胞系和肿瘤样本，并在启动子区域编码推测的ER结合位点。在这些分析之后，两个基因出现在直接靶基因列表的顶部。一个是核受体相互作用蛋白1（NRIP1），也称为受体相互作用蛋白质140（RIP140），最初被鉴定为ER-结合蛋白和受体活性的共同调节蛋白[44,45]. 随后发现它能结合和调节其他核受体的转录活性[46,47]. 先前在MCF-7和ZR75-1细胞中的微阵列实验表明自然保护区1雌激素治疗后转录水平升高，其在抗雌激素和CHX存在下的表达动力学与其他主要反应基因一致[23,24,26]. 在本研究中，我们还确定了自然保护区1作为一个被E2上调的ER靶基因，对ICI治疗敏感，对T-47D细胞中的CHX不敏感。此外，我们在TSS上游约700个碱基处检测到一个保守的完美ERE，这表明存在一个潜在的ER-结合位点，并由激活的受体直接调控。乳腺癌中雌激素调节的另一个直接靶基因1(绿色1)-在MCF-7细胞中雌激素反应基因的消减杂交筛选中鉴定。它没有已知的功能，似乎与序列数据库中的任何其他基因没有显著同源性[48]. 在TSS上游约1.6 kb处发现了完美的ERE格雷布1并且预测的ERE在小鼠中也很保守。考虑到这两者自然保护区1和绿色1我们比较了人类、黑猩猩、小鼠和大鼠基因组序列的5'上游区域，以了解预测的调控元件是否在其他鼠和灵长类物种中得到了保护。对于所有被调查的地区，我们发现核心ERE已经被完全保存（图​（图7a）。第7页). 此外，预测ERE两侧的序列也高度保守，表明这些区域具有功能性。

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ER以雌激素依赖的方式结合编码保守和非保守预测反应元件的启动子区域。（a）在上游发现ERE（带下划线）自然保护区1和绿色1编码区在人类、黑猩猩、小鼠和大鼠基因组中是保守的。（b）预测保守基因侧翼的PCR引物(自然保护区1和绿色1)和非服务(澳大利亚广播公司3和TFF1/pS2型)ERE设计用于检测ChIP分析后的ER结合。指出了引物和ERE相对于TSS的相对位置。（c）雌激素治疗增强了ER和预测ERE之间的相互作用。MCF-7细胞要么用载体二甲基亚砜（-E2，灰色条）模拟处理，要么用雌二醇（+E2，黑色条）处理，然后进行ChIP实验。黑色和灰色条表示抗ER ChIP实验中结合位点的富集程度高于抗GST ChIP实验。在激素处理的细胞中观察到所有ERE的富集，而模拟处理的细胞显示较少或很少富集。肌动蛋白外显子3控制区或任何输入对照（开条）均未富集。

为了确定预测ERE作为ER-结合位点的作用，我们使用抗ER抗体进行染色质免疫沉淀（ChIPs）。除了两个保守的ERE外，我们还包括来自TFF1/pS2（阳性对照）和ATP结合盒，亚家族A，成员3(澳大利亚广播公司3)，一个与其他ABC转运体相关的基因，被认为参与细胞脂质转运，是本研究和先前研究确定的推测ER直接靶基因[26]. 正向和反向引物（图​（图7b）7亿)ERE侧翼设计用于在实时PCR实验中特异检测和量化与ER共沉淀的基因组DNA片段。激素治疗后，与抗GST抗体对照或来自所有测试引物对的核裂解物的输入基因组DNA相比，我们没有观察到抗ER沉淀物中阴性对照肌动蛋白外显子3区的显著富集（图​（图7c）。第7页c). 相反，使用预测ERE两侧的引物对ChIP产物进行半定量PCR分析（参见材料和方法），结果显示，在没有雌激素和激素治疗后，ER与这些位点结合（参见图​图7c）。第7页c). 此外，雌激素治疗后，这种结合似乎增强了，这表明激活的受体在介导观察到的这些基因的转录调控中发挥了作用。保守ERE的功能自然保护区1和绿色1最近在一项关于人类和小鼠基因组中近一致ERE的研究中也有报道[49].

讨论

我们对E2应答基因进行了全基因组分析。通过使用基因组学、信息学和实验生物学的迭代验证策略，我们在我们的微阵列上表示的18912个基因中（0.5%），识别并表征了89个ER直接靶基因的核心集。这组来自T-47D细胞实验的直接靶基因在另一种细胞系MCF-7中表现出非常相似的行为，也与能够区分人类乳腺癌ER状态的基因重叠。总之，这些结果表明了ER转录控制的共同潜在机制，并定义了ER转录网络的特定遗传成分，这些成分在模型实验和临床条件中是一致的。

这些结果使我们有勇气破译ER转录控制的规则和信息框架。ICI药物的抗雌激素治疗和CHX细胞的预培养使我们能够确定可能是ER直接靶点的基因。我们提取了扩展的启动子区域（-3000 bp到+500 bp），并使用ERE、AP-1和Sp1结合位点模型确定了潜在的ER-结合位点[41,42]. 由于转录因子结合元件在基因组中频繁出现，因此仅在ER反应基因中发现ERE、AP-1或Sp1位点是极不可能的。相反，我们询问是否发现与雌激素受体相关的反应元件的概率显著高于雌激素受体无反应基因。我们的结果如图所示​图5，5，清楚地表明ERE富含推测的直接雌激素反应基因(第页=0.0027），但AP1、Sp1或GATA1（我们用作阴性对照反应元件）的结合位点不是。因此，ERE似乎是主要的ER转录控制元件。此外，尽管有明确的实验表明AP-1和Sp1位点具有介导内质网反应的能力[7-9,47,50-54]，我们的结果表明，在全基因组范围内，它们的使用并不是特定ER转录控制的常见机制。

之前的调查发现，一个功能性ERE嵌入Alu公司基因组中经常出现的重复序列[55]. 包含此内容Alu公司然而，在我们的分析中，ERE显著降低了在直接ER反应基因中发现的ERE的富集(第页= 0.06). 这表明，尽管这些ERE在实验上具有功能，但它们对特定的ER转录盒几乎没有影响，在系统中只起到“噪音”的作用。这已被几个国家的负面ChIP数据证实Alu公司-ERE站点（未显示数据）。这些观察结果突出了功能相关反应元件全基因组分析中潜在的混杂因素。

我们使用TSS周围的3.5 kb窗口搜索相关ERE，捕获了大多数已知ERE[5]并代表了对5个监管区域的自由调查。尽管如此，我们发现只有大约50%的靶基因在其启动子中编码ERE样序列（包括ERE半位点）。这一窗口之外的雌激素受体结合位点可能参与调节雌激素受体的具体活动。为了支持这一点，Bourdeu及其同事最近描述了一些人类基因5'区域DNA上游10kb（相对于TSS）和下游5kb内ERE的识别和验证[49]表明在我们研究的区域之外存在功能增强因子。此外，TSS或额外5’外显子的注释错误可能导致已知基因中TSS测定的错误率高达8%，预测基因中的错误率为80%（Y.J.Ruan、E.T.L.和C.L.Wei，未发表的工作）。未来的研究需要将这些信息纳入ERE分析。

鉴于此生物信息学ERE的鉴定并不能保证其在ER反应中的功能，我们选择了三个新的推测的直接ER靶基因，这些基因是根据我们严格的标准鉴定出来的，以供进一步验证。自然保护区1,绿色1、和澳大利亚广播公司3是否所有基因在至少两个细胞系中都有ER反应；它们在TSS周围有一个可识别的ERE，被ICI阻断而不被CHX抑制，它们的表达可以识别乳腺癌中的ER状态。通过使用ChIP，我们确认了雌激素刺激后，所有三种雌激素的雌激素受体直接靶向（图​（图7）。7). 因此，我们通过共识进行排名的过程（即通过满足的标准数量，根据成为ER直接目标的可能性进行排名）似乎是确定ER实际直接目标的合理方法。

这些靶基因表明ER在调节细胞内信号通路方面可能发挥潜在作用，这些信号通路可能对乳腺和肿瘤生物学过程产生影响。自然保护区1最初被鉴定为一种ER结合共调节蛋白，随后发现通过核受体结合基序LXXLL与其他核受体相互作用。Kerley和同事[56]表明了这一点NRIP1型转录物和蛋白质水平也被上调-反式视黄酸治疗，并建议自然保护区1可能促进核受体家族成员之间的相互交流。因此，上调自然保护区1被激活的ER不仅可以调节雌激素反应，还可以影响其他核受体的转录活性以及细胞对其相应配体的反应。那个自然保护区1ER中转录水平升高+与ER相比-乳腺肿瘤表明，其他核激素受体的下游功能可能受到ER转录级联元件的协调调节（见图​图44).

澳大利亚广播公司3编码ABC转运体的一个成员，利用ATP水解来驱动底物跨细胞膜的转运；虽然其底物未知，但ABCA3似乎与参与脂质转运的其他ABC转运体有关。ABCA3蛋白水平在肺组织中最高，ABCA3似乎定位于富含磷脂酰胆碱的肺泡上皮细胞的板层体[57]. 这些观察结果提供了ER激活与乳腺上皮细胞分化和转化过程中磷脂水平变化之间的潜在联系。绿色1然而，它是一个功能未知的基因，与任何其他已知基因无关。它在ER中过度表达+乳腺肿瘤及其进化保护表明该基因在ER信号传导和乳腺肿瘤生物学中起着重要作用。值得注意的是，本研究中确定的21%（19/89）的假定靶基因没有已知的生物功能（见表​表11).

评估中使用的一种策略顺式-基因组中的调控元件一直在绘制TSS上游非编码区的保守片段。使用上述三个基因(自然保护区1,澳大利亚广播公司3和绿色1)作为内质网监管的严格测试直接目标和经过充分研究的内质网直接目标，TFF1/pS2，我们评估了人类和小鼠同源物之间验证的上游ERE的进化保守性。有趣的是，我们发现高度保守的ERE（包括侧翼区域）仅适用于自然保护区1和绿色1.澳大利亚广播公司3和TFF1/pS2两者在人类基因中都有上游功能性ERE，但在小鼠同源基因中没有（图​（图7b7亿).

然后，我们将这一进化保守性搜索扩展到其余89个假定的人类内质网直接靶基因。令人惊讶的是，我们发现，在大多数小鼠-人类直向同源对中，ERE核心序列、侧翼区域和相对于TSS的位置并不保守：在检测的72个可测试的直向同源对中，只有4个（6%）显示出人类和小鼠基因之间的ERE序列守恒。鉴于84.7%的人口，这一点值得注意[58]编码区域内老鼠和人类序列之间的一致性。综上所述，我们的结果表明转录控制的进化通过顺式-调控机制必须具有不同的突变率或机制，并且可能经历了与编码序列不同的选择压力。此外，小鼠和人类雌激素反应基因在雌激素受体中的低保守性表明了两个后果：第一，诸如性别分化/乳腺发育等核心生理雌激素效应可能由一小部分高度保守和类似调节的雌激素受体反应基因介导；其次，小鼠和人类的下游雌激素效应可能存在显著差异。

我们通过显示MCF-7细胞中雌激素诱导的表达谱和这些基因在ER中的行为之间的显著相似性，提出了许多雌激素反应基因与乳腺肿瘤生物学的相关性+六种乳腺癌微阵列研究数据库中的肿瘤[36-40]. 不出所料，我们观察到，与定义雌激素受体的基因总数相比，直接雌激素反应基因的数量很少+其他人也注意到，乳腺肿瘤表明雌激素反应途径仅占受体阳性分子信号的一部分[22]. 然而，综上所述，ER似乎+原发性乳腺癌的状态可以通过激活ER的协同效应来解释。有趣的是，与肿瘤共识相比，这些差异表达的基因（约30%）在细胞系中的表达方向相反。我们推测，这可能是由于内质网辅因子的持续不同特征，或者是由于肿瘤相关基质细胞中与癌细胞相反的强烈表达特征。然而，那些在细胞系中对雌激素有反应并且在雌激素受体中差异表达的基因+肿瘤是进行进一步功能分析的最有希望的候选者。

总之，我们提出了一种综合策略，用于发现和表征ER靶基因、反应元件和ER激活下游的转录调控网络。通过这种方法，我们发现了一组通用的基因，这些基因描述了内质网最直接的影响，并在多个基因中起作用在体外和体内系统。经检查，这个核心直接靶基因列表并不能预测由ER控制的统一生物过程。相反，基因功能可以预测多效性细胞反应。通过进一步生物信息学通过对启动子区域的分析，我们观察到顺式-人类和小鼠间直接雌激素反应基因的调节区。这提出了一个有趣的可能性，即控制转录调控结构的进化过程将不同于影响基因功能域的进化过程。此外，我们预测小鼠的雌激素反应与人类的明显不同，但一小部分雌激素受体直接靶基因在其体内高度保守顺式-调控区域将成为进化上重要的核心内质网功能（如性别分化）的关键效应器。

结论

人类乳腺癌细胞中的雌激素反应似乎由一组相对较小的保守的ER调节核心基因介导。检查顺式-该核心组中假定靶基因的调控区域显示ERE序列基序丰富，但没有其他已知的ER-结合位点。在人类直接靶基因中预测的所有ERE中，只有少数（6%）在小鼠直系同源基因中保守，尽管保守和非保守预测的ERE在人类细胞系中都与ER结合。综上所述，这些发现表明了激素暴露对物种特异性机制和效应的潜在影响。

材料和方法

细胞培养、处理和RNA提取

T-47D和MCF-7细胞保存在37°C添加10%胎牛血清（FCS）（Hyclone）的DMEM/F12（1:1）培养基（Invitrogen）中，并用5%CO缓冲2对于雌激素治疗，用PBS清洗细胞，并在无酚DMEM/F12培养基中预先培养24小时，培养基中添加0.5%碳过滤FCS（Hyclone）。对于时间过程实验，用1 nM 17β-雌二醇（E2；Sigma-Aldrich）或1 nM E2+10 nM ICI 182，780（Tocris Cookson）处理T-47D细胞在指定的时间内。为了确定主要反应，在开始雌激素治疗之前，用5μg/ml环己酰亚胺（CHX；Sigma-Aldrich）处理细胞30分钟。在规定的时间和相同的浓度下，也使用ICI（2、8、12和24小时）和CHX（2和8小时）单独进行对照处理。为了提取RNA，用PBS洗涤细胞，在Trizol（Invitrogen）中裂解，并通过制造商规定的额外苯酚-氯仿提取步骤收获样品。

基因表达谱的微阵列分析

微阵列是通过在涂有聚-L-赖氨酸的载玻片上定位Sigma Genosys制造的Compugen 19K人类寡聚文库而产生的。每个样本总RNA和人类通用参考RNA（Stratagene）的25微克分别用Cy5-共轭dUTP和Cy3-共轭dUTP-（PerkinElmer）标记，并使用Patrick O.Brown实验室制定的协议与阵列杂交[59]. 使用GenePix4000B扫描仪和GenePix Pro软件（Axon Instruments）获取并处理阵列图像和数据。用两两法测定差异表达基因t吨-使用Eisen Cluster和TreeView程序对每个时间点的匹配处理样本和模拟处理控件进行测试，并在多个时间点进行折叠差截断[30]. 假定靶基因的基因本体来自Compugen的注释。

乳腺癌和细胞系微阵列数据的Meta分析

对包含已发表和未发表乳腺癌表达数据的数据库进行查询，以获取其表达谱区分ER的基因+和ER-肿瘤。通过计算每个基因的错误发现率，独立分析每个数据集的差异表达基因[60]并设置第页-值过滤器小于或等于0.01。然后将ER状态相关基因与在体外通过UniGene簇ID（构建166）的雌激素反应基因。使用每个具有统计学意义的研究的对数转换平均以平均值为中心的表达值进行可视化。原始在体外MCF-7雌激素反应数据[31]从斯坦福微阵列数据库下载[32]. 这些数据直接与T-47D结果进行比较，或根据以下选择标准选择用于ER调节：首先，在三个时间点中的两个时间点，在同一方向上至少有1.15倍的变化，并且在任何时间点都没有冲突（相反方向）的数据；第二，在两种治疗条件中的其中一种条件下，与三苯氧胺（Tam）联合治疗48小时后，变化方向相反，两种治疗中没有相互矛盾的数据。1.15倍的截止值不同于T-47D数据的1.2倍变化，用于捕获该数据集中已知的E2应答基因。

启动子序列提取与ER结合位点检测

LocusLink和RefSeq[61]美国国家生物技术信息中心（NCBI）的数据库用于识别人类和小鼠基因，并精确定位其在基因组中的位置。选择这些注释是因为它们的全面性、注释基因的数量以及它们与NCBI contig数据库当前状态的一致性。使用TSS（定义为参考转录物中最多的5'核苷酸）和转录物的3'末端作为参考点，我们提取起始位点上游3kb和下游500个碱基用于结合位点分析。NCBI人类基因组序列构建33和小鼠基因组序列构建30用于转录比对和基因组序列提取。由于某些参考序列5'端的信息不完整，在LocusLink和RefSeq中注释的TSS位置可能仅近似于真实起始点，但我们认为用于我们分析的相对较大（3.5 kb）区域允许TSS位置的波动。人类-小鼠同源基因测定基于小鼠基因组数据库中的注释[43]. 所用的四个结合位点位置权重矩阵（PWM）模型要么是在早期研究中推导出来的[41]或从TRANSFAC（6.0版）转录因子结合位点数据库下载[42]. 检测参数是根据Dragon ERE Finder的优化设置设置的[41]以83%的灵敏度检测训练数据，并对其他PWM进行相应设置，使其具有类似的灵敏度。通过蒙特卡罗模拟，在定义的基因集和随机生成的基因集的预测之间，确定假定目标基因和非响应基因之间结合位点富集的统计意义。进行了一组蒙特卡罗模拟，以评估一组雌激素直接靶基因和非响应基因之间假定ERE明显富集的重要性。在每次模拟中，我们随机生成两组基因（大小相当于直接靶基因和非响应基因），绘制相应的曲线，并计算两条曲线下面积的差异。模拟执行了100000000次，模拟中随机区域差异至少与观察到的区域差异一样大的时间分数报告为经验值第页-价值。分析中使用的最重要的直接靶基因排名最低第页-E2处理和对照样品、E2和E2+ICI样品以及E2和E2+CHX样品的分析值。无反应基因排名最高第页-来自相同分析的值。

染色质免疫沉淀分析

MCF7细胞被雌激素剥夺24小时，并在1%甲醛处理前用100 nM E2处理45分钟，以交联转录机制和染色质。使用ERα（HC-20）或GST抗体（Santa-Cruz Biotechnology）和蛋白A-sepharose珠（Zymed）隔夜进行免疫沉淀。清洗和提取方案根据之前描述的方法进行了修改[62]PCR反应在LightCycler（Roche Diagnostics）实时系统中进行。使用以下引物对沉淀DNA和对照输入DNA进行40个PCR周期：TFF1/pS2ERE：远期CCATGTGGCACGCTAGTC；背面为ACAACAGTGGCTCACGGGT。自然保护区1ERE：转发，TGCTCCTGGGTCCACGTCT；反转TCCCCTTCACCCACAACACACA。格雷布1ERE：正向AGCAGTGAAAAAAGTGGCAACTGGG；背面为CGACCCACAGAAAATGAAAAGGCAGACAACT。澳大利亚广播公司3ERE：转发，CACCTTCCATCTGTCCAAAG；背面为CAACCCTGGGTTGGGAAC。肌动蛋白外显子3控制：正向，AGACCTTCAACCCCACACCC；背面为GTCACGCACGGATTCCCGCT。在每次运行结束时，还通过熔化曲线分析来分析扩增产物的特异性。通过建立每个引物集的标准曲线，并使用与输入相似的基因组DNA作为模板，进行相对定量。通过比较抗ER和对照抗GST产物的相对数量来确定ER结合的富集。

其他数据文件

本文的在线版本提供了以下附加数据文件：时间进程微阵列研究的处理原始数据（附加数据文件1)和复制1（附加数据文件2)和复制2（附加数据文件三)在仅使用ICI和CHX治疗的对照微阵列研究中，文章中描述的所有387个雌激素反应基因的完整列表，以及构建166的UniGene簇号（附加数据文件4)，对照实验中确定的ICI和CHX应答基因的表达谱（附加数据文件5)和相应的图形图例（附加数据文件6).

补充材料

附加数据文件1：

时间进程微阵列研究的处理原始数据

附加数据文件2：

用单独的ICI和CHX处理复制对照微阵列研究的1

附加数据文件3：

仅用ICI和CHX治疗复制2个对照微阵列研究

附加数据文件4：

文章中描述的所有387个雌激素反应基因的完整列表，以及来自构建166的UniGene簇号

附加数据文件5：

对照实验中确定的ICI和CHX应答基因的表达谱

附加数据文件6：

对照实验中确定的ICI和CHX应答基因表达谱的对应图例

致谢

我们感谢Soek Ying Neo、Suk Woo Nam和Christopher Wong对微阵列技术的帮助，感谢Phillip Long、Joshy George和Radha Krishna Murthy Karuturi对数据分析的有益讨论。我们还感谢乔治·里德对手稿提出了深刻的评论。在新加坡基因组研究所进行的研究得到了新加坡科学、技术和研究局（A*STAR）生物医学研究理事会（BMRC）的资助。

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文章来自基因组生物学由以下人员提供BMC公司