结果
鉴于Six2在小鼠肾单位祖细胞自我更新中的关键作用(Self等人，2006年)，我们之前对肾单位祖细胞中Six2定向调节电路的分析(Park等人，2012年)SIX2突变对人类肾脏异常的影响(韦伯等人，2008年)，我们检测了人类胎儿肾脏中SIX2的调节功能。Six2在小鼠肾单位祖细胞群体中从E10.5高度表达，并在祖细胞参与肾单位形成时下调(Oliver等人，1995年;Self等人，2006年;小林等，2008年;Mugford等人，2009年;Park等人，2012年) (A） ●●●●。人类肾脏发育始于5岁 输尿管芽侵犯数周后终止于36周左右 周。因此，16周的人类肾脏大约是肾发生活跃期的三分之一，类似于E15.5-E16.5小鼠肾脏，早期研究中Six2调节的发育阶段(Park等人，2012年;神田等人，2014年). 此外，肾脏似乎正在经历活跃的分支，直到至少20 妊娠周（L.L.O.和A.P.M.，未发表的观察结果）。
人类SIX2 ChIP-seq揭示了一个肾脏特异性调节网络。（A） 人类和小鼠胎儿肾脏的SIX2和细胞角蛋白（顶部）以及SIX2、JAG1和ECAD（底部）免疫染色。（B） 基因组观点MEOX1（墨西哥）和工作任务1显示SIX2峰值的基因座cons’，Phastcon脊椎动物保护得分。（C） SIX2峰值相对于TSS的分布*P（P）-值表示峰值下降50-500的重要性 来自TSS的任意方向的kb。（D） SIX2峰值的基因组注释。（E） 图案最丰富的网络标志（顶部）及其保护（底部）。（F） SIX2基序峰距离的分布。（G） SIX2峰值的功能注释。观察对象；预期为Exp。
与小鼠肾脏一样，人类SIX2在肾外皮质输尿管上皮尖端周围的浓缩间充质细胞内显示出核定位(A） ●●●●。CITED1，小鼠肾单位祖细胞标志物(Boyle等人，2007年;Park等人，2012年)，在这组细胞中与SIX2共定位(图S1A). 在所有肾单位祖细胞中都观察到SIX2和CITED1的重叠，但与只有SIX2延伸到肾发生早期阶段的小鼠不同，我们在可能是早期形成肾单位结构的输尿管分支尖端下方观察到了人类CITED1(Mugford等人，2009年;Park等人，2012年;图S1A). SIX2活性延伸至输尿管芽下方的新生肾单位前体。SIX2在分化结构中表达下调，在肾小泡中定位，这与小鼠SIX2表达相似(A、 底部面板）。因此，小鼠和人类Six2/Six2的总体分布非常相似，这与Six2强调人类肾单位祖细胞室一致。与小鼠肾脏不同，人类肾脏有一个潜在的小叶组织。叶尖进入并汇合的地方，SIX2+祖细胞生态位紧密相连，但似乎通过SIX2保持了其局部尖端生态位的完整性+与下方分支输尿管树尖端紧密相对的细胞(A、 缩放的插图）。
接下来，我们在小鼠和人类肾组织上进行了ChIP-seq，以比较Six2/SSIX2之间的调节模式，并确定常见和独特的转录靶点。从17个 周胎儿肾组织。QuEST ChIP-seq峰值调用者(Valouev等人，2008年)确定了54068和1916个峰值，两个SIX2数据集之间有1592个共享峰值的高度重叠(P（P）-值=10−43;图S1B). 不同的峰数是由于第二次复制中SIX2 ChIP富集水平较低(图S1C). 附近SIX2结合的检查MEOX1（墨西哥）和工作任务1强调了SIX2复制的类似绑定配置文件(B） ●●●●。小鼠胚胎肾脏内甲烷1局限于肾单位祖细胞(Mugford等人，2009年).重量1更广泛地表达，包括祖细胞(Mugford等人，2009年)对祖细胞的维护至关重要(Kreidberg等人，1993年). SIX2 ChIP-seq峰倾向于定位在与SIX2与保守顺调控元件结合的DNA保守区块内(B） ●●●●。在工作任务1千碱基（kb）5′和3′的内含子和100工作任务1转录单位，表明工作任务1是SIX2监管的主要目标(B、 底部面板）。考虑到在rep1结合区内比较富集度时，两个重复的读数相关性更强(R（右）2=0.46对0.19，图S1C)，表明SIX2-rep1是一个相当强大的数据集，我们将进一步的分析限制在SIX2-rep1上。
大约60%的SIX2峰值在50-500范围内映射 转录起始位点（TSS）的kb（47%随机预期，P（P）-值=10−129); 在5分钟内观察到极少数（<5%） 启动子的kb(C） ●●●●。此外，SIX2峰值主要出现在基因间（48%）和内含子（46%）区域，这是真正增强子的典型模式(D） ●●●●。我们在±100范围内进行了基序搜索 使用从头开始主题发现者MEME（Bailey等人，2009）。顶部的基序TCANGTTTCA与之前从FACS分类的肾单位祖细胞中验证的Six2结合基序紧密匹配(Park等人，2012年)映射到所有SIX2峰值的60%(E） ●●●●。预期SIX2与DNA直接相关的基序在峰中心富集(F） ●●●●。此外，计算平均保守性PhyloP得分(Siepel等人，2006年)SIX2峰内的跨基序碱基表明，高频基序也有较高的保守性(E） ●●●●。这些数据突出了可能介导DNA-蛋白质接触的核苷酸在保护中的功能重要性(库马尔，2009年).
为了进一步研究人类SIX2的生物学功能，我们进行了GREAT GO分析(McLean等人，2010年)在ChIP-seq峰值上。SIX2峰高度富集于与后肾肾脏特异性过程相关的近基因，如“肾单位形态发生”和“后肾发育”，并预测具有适当“后肾间质”和“泌尿生殖系统”基因表达特征的靶细胞类型(G） ●●●●。总之，对人类SIX2 ChIP-seq数据的分析揭示了人类肾单位祖细胞中一组稳健的SIX2结合增强子，支持SIX2对祖细胞生态位中肾单位祖程序的调节作用。
为了评估人类SIX2和小鼠SIX2之间潜在的功能相似性和差异，我们将人类ChIP-seq数据与E16.5小鼠全肾SIX2-ChIP-seq数据集进行了比较。小鼠数据恢复了与人类Six2 ChIP-seq数据相同的Six2结合基序。与人类SIX2相似，大部分（43%）小鼠SIX2峰包含在峰中心富集的SIX2基序(A、 B）。由于小鼠和人类数据集的强度大致相当，我们使用了更严格的峰值调用阈值来确定最强的峰值集：小鼠肾脏为12145个，人类肾脏为6276个。为了比较两个物种之间SIX2/SIX2的结合模式，我们使用UCSC基因组浏览器liftOver工具将小鼠峰坐标转换为人类对应物，从而“人性化”了小鼠SIX2峰(Rhead等人，2010年).
老鼠和人类SIX2有许多共同的目标，但SIX1系列代表一个独特的人类目标。（A） Six2/Six2峰最丰富基序的比较。（B） Six2基序峰距离的分布。（C） 人类SIX2结合位点和转化的小鼠SIX2结合位点之间的重叠，具有哺乳动物系统发育保护（左）和具有基序的峰值百分比（右）。（D） 人和小鼠SIX2靶基因的重叠。（E） （左）通过SIX2/SIX2调节得分绘制的人类/小鼠靶基因。（右）人类和小鼠所有保守基因的肾单位祖细胞特异性表达。标记被鉴定为具有种特异性表达的种特异性靶基因。
在9004个转换的小鼠Six2峰中，只有727个位点（～8%）与人类Six2峰重叠，间隙阈值为100 英国石油公司(C） ●●●●。峰值重叠程度较小不能归因于用于人和小鼠ChIP-seq比较的抗体的差异，因为这两种抗体在小鼠中产生相关的结合数据(图S2A). 肾脏靶基因和Six2基序的可复制峰丰富(图S2B、D)差异峰往往位于高活性代谢基因的TSS附近，没有肾脏特异性，也没有Six2基序的富集(图S2B、C、D). 小鼠和人类之间低结合位点重叠的发现与之前的报告一致，这些报告比较了物种之间同一细胞或组织中转录因子的结合(Odom等人，2007年;Kunarso等人，2010年;施密特等人，2010年). 例如，在小鼠和人类肝脏中，只有12-14%的CEBPa和HNF4a结合位点是保守的；这些差异被归因于序列变化导致的图案丢失(施密特等人，2010年). SIX2人类/小鼠共享位点显示SIX2基序的富集程度最高，为65%，而59%（人类特有）和21%（小鼠特有），恢复的结合基序的保守性最强(C） ●●●●。此外，共有峰更丰富了与肾功能相关的GO术语，如“泌尿生殖系统发育”和“后肾发育”。这些术语在独特的峰值集中不存在(表S2). 这些观察结果表明，与仅在一个物种中观察到的峰值相比，共享的鼠-人位点具有更强的功能作用。有趣的是，尽管小鼠和人类之间Six2结合位点的重叠相对较小，但两个物种之间共享了超过50%的假定Six2靶基因(D） ●●●●。这些结果支持这样的观点，即与单个增强子的保守结合相比，Six2结合在靶基因水平上更保守。因此，新的Six2位点可能是在相同的靶基因附近进化而来，从而促进了调控和物种多样性。
GO分析表明，小鼠和人类结合位点的重叠丰富了与肾功能相关的潜在靶基因(表S2). 这包括在小鼠肾脏发育中起整体作用并与人类肾脏异常相关的基因，例如索尔1,眼睛A1和SIX2系列(Abdelhak等人，1997年;Kohlhase等人，1998年;Xu等人，1999年;Nishinakamura等人，2001年;Self等人，2006年;韦伯等人，2008年). 我们之前的研究表明埃亚1是Six2的直接目标(Park等人，2012年)通过同样受人类SIX2保守和约束的增强子发挥作用（星号图S3). 此外，周围还有其他几个潜在增强子模块眼睛A1/埃亚1在这两个物种之间是保守的(图S3). 这些数据强调了在肾脏发育中具有重要作用的基因周围的顺调控模块的保护。
为了在小鼠和人类肾单位祖细胞中发现潜在的新Six2/Six2靶点，我们结合了靶点调节潜能和表达数据。调节潜力测量基于每个基因附近的峰值数量和峰值强度(Tang等人，2011年). 我们首先着手鉴定小鼠和人类肾单位祖细胞之间SIX2调节潜能存在显著差异的基因(E、 左侧面板，表S2和S3). 正如预期，SIX2系列是小鼠和人类自身调节的一个强有力的假定目标(Park等人，2012年;E、，表S2和S3). 令人惊讶的是，人类SIX2最受高度监管的目标之一是SIX1系列(E、，表S2和S3). 在鼠标中，Six1型表达式在之后不久丢失Six2型已打开(Xu等人，2003年)因此，这是一个不太可能的目标。与此一致，Six1型在小鼠中具有最低的可能调节潜能，正如其时间限制表达谱所预期的那样(Xu等人，2003年;E、，表S2和S3). 这些数据还表明Six2不可能直接抑制Six1型因此，SIX1系列通过对监管潜力的分析，显示为特定于人的目标。
为了进一步缩小通过调节潜能确定为物种特异性靶点的基因列表，我们检测了它们在人类和小鼠肾单位祖细胞中的表达，以确定也具有物种特异性表达的靶点。我们对FACS分离的ITGA8进行RNA-seq+来自17的单元格 周人胎儿肾皮质和E15.5 Cited1+肾单位祖细胞。ITGA8在肾单位祖细胞和诱导的肾脏结构中表达(Müller等人，1997年;图S4A). 我们利用人类胎儿肾脏的有限酶消化，从外皮质层分离细胞，以回收ITGA8+肾单位祖细胞，但不包括大多数分化结构(图S4A). 利用来自肾单位祖细胞的RNA-seq数据，我们比较了人类和小鼠之间的基因表达，并确定了在两个物种中富集超过5倍且也是物种特异性靶基因的基因(E、 右侧面板，突出显示基因）。SIX1系列在人类ITGA8中表达+祖细胞，但不是小鼠肾单位祖细胞，鉴定SIX1系列作为人类特有的靶点SIX1系列基因和活性SIX1系列表达式（右侧面板E；表S3).
我们检测了周围的表观染色质特征SIX1系列/Six1型和SIX2系列/Six2型两个物种的基因组区域，以确定可能导致物种差异的调节差异SIX1系列/Six1型表达式。17日执行ChIP-seq 以评估与活性基因和增强子（H3K27ac）以及转录沉默染色质（H3K27me3）相关的染色质标记。在人类胎儿肾脏中SIX2系列该基因座显示出与小鼠相似的特征：在保守元件处与SIX2结合，在基因体和SIX2连接区均以H3K27ac标记(B） ●●●●。同样，人类SIX1系列该位点在多个保守元件上与SIX2结合，并在整个基因体和SIX2连接区域显示出显著的H3K27ac(A） ●●●●。相比之下，老鼠Six1型该位点未通过Six2或H3K27ac富集显示出显著的结合，但以强烈的H3K26me3信号标记(A） 这与该区域的表观遗传沉默相一致。总之，这些发现表明一个转录活跃的人类SIX1系列陈述并建议SIX1系列表达可能通过SIX2介导的直接转录激活进行调控，至少部分调控。
SIX1系列在人肾单位祖细胞中是活跃的，并由SIX2调节，但在小鼠肾单位祖祖细胞中不是。（A）人类基因组观SIX1系列（顶部）和鼠标Six1型（底部）基因座和（B）人类SIX2系列（顶部）和鼠标Six2型（底部）基因座。Cons，Phastcon脊椎动物保护得分。星号表示用于转基因检测的样品。
先前的免疫检测研究报告SIX1定位于17-20的浓缩间质 周人胎肾(Li等人，2002年;Sehic等人，2012年). 然而，SIX1和SIX2在其DNA-结合和SIX结构域中高度保守(图S4C); 因此，SIX蛋白之间抗体交叉反应的可能性使这种解释模糊不清。为了确定SIX1在发育中的人类肾脏中的定位，我们使用了一种唯一识别SIX1的C末端特异性抗体(图S4B). 16岁 胎儿发育周后，在输尿管分支发生后建立的许多肾单位祖细胞龛中，肾单位祖细胞核SIX1很容易被识别11 几周前(A） ●●●●。此外，SIX1和SIX2蛋白在人类肾单位祖细胞中的分布高度相似(A） ●●●●。相比之下，小鼠Six1和Six2在E10.5处重叠于后肾间质，但在E11.5时，Six1不存在于肾单位祖细胞中(B） ●●●●。然而，Xu等人（2003）观察到Six1型E11.5至lacZ公司敲入等位基因。因为Six1型活性是间接测量的，这一发现可能反映了β-半乳糖苷酶活性在沉默后的持续性Six1型。
Six1在小鼠中的表达是短暂的，与Six2无关，而在人类肾单位祖细胞中持续存在。（A） 人胎肾（HFK）切片SIX1、SIX2和细胞角蛋白免疫染色（B）SIX1、SIX2和E10.5、E11.5和E12.5小鼠肾脏相邻切片细胞角蛋白的免疫染色。（C） E10.5的GFP、Six1和细胞角蛋白免疫染色Six2型普通教育证书/+和Six2型普通教育证书/普通教育证书肾脏。最右侧的图像显示缩放的2个视图。
因为Six1型和Six2型在E10.5后肾间质中瞬时共表达，我们询问Six1型此阶段的表达依赖于Six2。我们检测了Six1在Six2型普通教育证书/+和Six2型普通教育证书/普通教育证书携带GFP盒敲入产生的突变等位基因的小鼠肾脏Six2型轨迹(小林等，2008年). 杂合子和Six2型-零突变，我们观察到后肾间质中GFP和Six1的共标记，两种基因型之间的Six1染色水平相似(C） ●●●●。因此，Six1型活性不依赖于后肾anlagen中的Six2。此外，尽管所有GFP+细胞为SIX1+有更多的细胞表达Six1，但缺乏GFP信号。这表明Six1型激活先于Six2，且独立于Six2，符合以下要求Six1型E10.5肾脏和更严重的Six1型突变表型(Xu等人，2003年;Li等人，2003年;Self等人，2006年;Xu和Xu，2015年).
人类附近的SIX2结合区SIX1系列基因座可能是维持SIX1系列在人类胎儿肾脏中的表达。为了检测这些区域的调节活性，我们选择了两个最强的SIX2结合保守模块SIX1系列轨迹(A、 星号），并在G0小鼠转基因试验中测试每个基因的单个拷贝的增强子活性lacZ：：nGFP融合暗盒。最强的增强子（Enh1）位于基因间区～11.5 kb下游SIX1系列启动子，在脊椎动物中表现出高度保守性(A） ●●●●。第二强增强子（Enh2）位于～4 kb上游SIX1系列另一个高度保守的嵌段内的启动子(A） ●●●●。这两种增强子先前被证实是控制Six1型小鼠胚胎发育过程中的表达(Sato等人，2012年). 据报道，Enh1和Enh2在耳泡和颅神经节中均表现出活性Six1型表达式(Sato等人，2012年) (A） ●●●●。Enh1在发育中的肢芽的嗅板、眼睛和顶外胚层脊中表现出额外的活性。然而，只有Enh2在E10.5处表现出高度可重复的后肾间质特异性表达（Enh1为0/3，Enh2为6/9；A） ，类似于它们的鼠标等价物(Sato等人，2012年). 当在E15.5下分析Enh1时，1/17对转基因阳性肾对显示出肾单位祖细胞特异性表达模式，而3/17对显示出额外的独特β-gal+图案(B、 C类；图S5). 对于Enh2，1/5的转基因肾对显示出特异性定位于肾单位祖细胞的镶嵌表达(B、 C）。总之，只有Enh2在E10.5时在小鼠后肾间质中表现出强大的活性，而当小鼠在E15.5时，两种增强子均表现出零星的肾单位祖细胞活性Six1型处于非活动状态。总的来说，这些数据突出了早期激活的增强因子在活性肾发生之前被激活，而这些增强因子在晚期肾单位祖细胞中大多（但并不总是）被关闭（见讨论）。
人类转基因小鼠分析SIX1系列增强子显示出与小鼠相似的调节Six1型在发育中的小鼠肾脏中。（A） 二者的β-半乳糖苷酶（β-gal）活性SIX1系列E10.5处的增强器。数量lacZ公司+显示MM在E10.5表达的转基因。cg，颅神经节；ov，耳囊；嗅板；顶端外胚层嵴；MM，后肾间质；ND，肾管。（B） 二者的β-gal活性Six1型E15.5处的增强器。显示肾单位祖细胞表达的转基因数量。（C） B。肾切片Six2和细胞角蛋白染色。
为了直接阐明SIX1在人类胎儿肾脏中的功能作用，我们在16和17岁时进行了SIX1 ChIP-seq 周肾复制。这两个数据集显示出中度重叠，并且相互关联(图S6A、B). 为了消除潜在的假阳性SIX1峰，我们将重点放在1610个重叠位点上。从头开始模体恢复鉴定出一个与SIX2模体匹配的峰中心模体，与SIX1和SIX2的高度保守的DNA结合同源结构域以及之前来自C2C12成肌细胞的SIX1-ChIP数据一致(刘等，2012;A、 B类；图S4C和S6C). 1610个重叠的SIX1峰的六个基序恢复率为60%，与SIX2峰相似(A） 并且高于每个单独的SIX1-ChIP-seq复制（43%和38%，图S6A)支持共享SIX1峰值的特殊性，并表明每个数据集中最强的峰值位于重叠范围内。因此，SIX1和SIX2识别相同的DNA结合基序，因此，每个因子都可能以一组常见的增强子为靶点，并调节肾单位祖细胞池中的一组常见基因。
SIX1和SIX2具有共同的目标，并显示了汽车和交叉监管活动的证据。（A） SIX1和SIX2峰的最富集基序的比较。（B） SIX1基序峰值距离的分布。（C） SIX1和SIX2结合位点的重叠。（D） SIX1和SIX2靶基因的重叠。（E） 来自SIX2和SIX1 ChIP Seq数据集的原始信号的比较。每个点代表一个绑定峰值。（F） 共享SIX1/SIX2峰值的基因本体分析。观察对象；预期为Exp。（G） 人类基因组观SIX1系列（左）和SIX2系列（右）基因座。（H） 来自HEK293细胞的SIX2-3×FLAG共免疫沉淀的蛋白质印迹。（一） 人胎儿肾脏SIX1和SIX2共同免疫沉淀的Western blot。
与此预测一致，绝大多数SIX1峰（～81%）与SIX2峰相同，并且它们的结合强度显著相关(R（右）2=0.4;C、 E）。此外，几乎所有预测的SIX1靶基因（～90%）都与SIX2共享(D） ●●●●。与共享峰相比，仅SIX1峰的信号更低(图S6E)，表明它们代表SIX2信号低于检测阈值的峰值，而不是真正唯一的站点。SIX1/2蛋白序列的C末端区域是不同的，可能导致不同的蛋白质相互作用(图S4C)，这可能通过与不同的协同因素的交互作用影响SIX1和SIX2在其目标站点的招募水平。共享峰值上SIX1和SIX2信号之间相对较低的相关性（0.18）支持这一观点(图S6D). 共享峰和非重叠峰上的基序恢复在重叠和仅SIX2位点中都发现了WT1样基序和E-box基序(图S6F)表明WT1和bHLH因子是SIX1和SIX2的潜在结合伙伴。303个SIX1-unique位点产生了一个SIX基序，但没有WT1或E-box信号。Six1-only位点之间缺乏共因子基序很可能是因为这些峰的数量较少且富集程度较低(图S6E、F). SIX1和SIX2是否与独立目标站点的不同协同因素相互作用仍是一个悬而未决的问题。
对重叠的SIX1-SIX2峰的GREAT GO分析表明，与肾脏过程有关，如“后肾发育”和肾脏相关结构中靶点的表达，如“后肾间质”(F） ●●●●。预测的靶基因包括SIX1系列,SIX2系列,索尔1,工作任务1和OSR1号机组(表S4). 综上所述，这些数据表明，SIX1和SIX2识别出一组非常相似的增强子，用于通过与常见SIX型基序的相互作用介导的人类肾单位祖细胞中的相同靶点。重要的是，这些相互作用包括各自的共同监管输入以及彼此的增强器(G） ●●●●。
这些发现为两个因素同时参与一个共同的监管复合体提供了可能性。为了解决这个问题，我们对转染了标记蛋白的HEK293细胞进行了联合免疫沉淀。首先，作为阳性对照，我们确认SIX1和SIX2与EYA1的复合物(H、 数据未显示），与之前使用苍蝇和老鼠同源物的研究一致(Pignoni等人，1997年;Buller等人，2001年). 接下来，我们分析了SIX1和SIX2是否相互作用。然而，SIX1和SIX2在HEK293细胞中过度表达后，使用针对不同表位标签的特异性抗体共同免疫沉淀(H、 SIX1数据未显示），SIX1和SIX2在17 周人肾脏(一） ●●●●。结果表明：（1）用于免疫沉淀的抗体体内破坏异二聚体SIX1-SIX2复合物或（2）SIX1和SIX2形成独立的转录复合物体内能够与人类肾单位祖细胞中的相同调节元件结合，但在体外，SIX1和SIX2在异源细胞类型中高水平存在时可以形成复合物。为了区分这些可能性，我们使用来自体内研究。在HEK293细胞中，SIX2和SIX1共同免疫沉淀，表明SIX2特异性抗体不会破坏在体外生成的SIX1-SIX2复合体(H） 。综上所述，这些结果支持存在独立的SIX1和SIX2调节复合物体内，尽管我们不能排除对不稳定的SIX1-SIX2复合物起一些次要作用的可能性在体外过度表达条件。
讨论
人和鼠SIX2/SIX2功能的比较
在本研究中，我们检测了人和小鼠SIX2/SIX2表达和功能的保护。我们观察到SIX2在肾单位祖细胞中的定位在发育中的小鼠和人类胎儿肾脏中相似。大多数SIX2/SIX2转录靶点在两个物种之间共享，这表明尽管同源增强子的结合峰重叠相对较低，但SIX2/Si x2靶基因集是共同的。此外体内Six2/Six2结合的恢复基序在小鼠和人类祖细胞中是相同的，与保守的DNA结合域一致。鉴于它们的六/六结构域和C末端结构域也非常相似，通过这些区域介导的蛋白质相互作用也可能在两个物种之间保持不变。
最近的一项研究表明，小鼠和人类中转录因子结合的保守位点与多效性功能相关(Cheng等人，2014年). 这些增强子在多个组织中都很活跃，使它们受到强大的进化约束，从而在增强子模块中保留了基序。作者认为，保守的多效性增强子可能被同一家族中识别相同基序的转录因子结合(Cheng等人，2014年). 在我们的数据中，SIX2基序在人类和小鼠结合的共享位点中的保守性最高，增强子在靶基因周围保守性高，例如眼睛A1/埃亚1Eya1对包括肾脏、内耳、颅神经节和鳃弓衍生物在内的几种组织的正常发育是不可或缺的(Xu等人，1999年,2002;邹等人，2004). 我们很有兴趣确定我们的潜在增强子是否在这些额外组织中也有活性。Six1和Six2在许多相同的组织中表达，与多组织调节联系一致(Oliver等人，1995年;Sato等人，2012年).
鉴于SIX2的靶基因和功能似乎高度保守，我们确定SIX1系列作为SIX2在人类胎儿肾脏中的一个新的独特靶点。我们的分析揭示了通过调节潜能和表达分析预测的其他基因靶点，以显示祖细胞活性的物种特异性模式。除SIX1外，我们的数据确定了几个在人类肾脏ITGA8中高表达的其他基因+细胞与小鼠肾单位祖细胞的比较，在人类与小鼠中具有更高的调节潜能(表S3). 类似SIX1系列，这些基因代表了人类SIX2的独特调节靶点。这些基因的例子包括第62列和CDH7型这表明人和小鼠肾单位祖细胞之间在基质和细胞间粘附方面存在潜在差异。相反，Hs3st6型，一种硫酸肝素硫转移酶和Wt1靶点(Motamedi等人，2014年)，表示小鼠特异性Six2靶基因，在小鼠Cited1中表达更高+肾单位祖细胞（RPKM=35.640），但在ITGA8中低表达（RPKM=0.225）+人肾单位祖细胞富集人群。确认这些基因的物种特异性表达及其对小鼠和人类肾单位祖细胞功能的潜在差异影响将是未来研究的重点。
SIX1在小鼠和人类中的功能
Six1型是维持早期后肾间质所必需的(Xu等人，2003年;Li等人，2003年;Xu和Xu，2015年)，但当小鼠出现第一轮分支时，Six1已无法检测到。然而，SIX1的活性远远超出了最初一轮的分支，并与人类肾单位祖细胞中的SIX2重叠。这些发现提出了以下问题：（1）小鼠和人类在肾脏发育过程中如何差异性调节其六个基因，以及（2）不同调节程序的功能意义是什么？
显然，小鼠Six2和人类SIX1/2的共同调节主题是其自身调节活动。每个因子结合其自身基因的祖细胞特异增强子；此外，人类SIX1和SIX2相互调节SIX2系列和SIX1系列基因。然而，它们在早期指定的后肾anlagen中的初始激活可能依赖于其他因素。在鼠标中，我们的数据表明Six1型激活独立于Six2型还有那个Six1型作用于的上游Six2型，与之前的报告显示的一致Six1型正常情况下需要Six2型表达式(Xu等人，2003年;Li等人，2003年). 人类肾脏发育等效阶段的情况（4.5-5 周）目前未知().
Six1/2和Six1/2在发育中小鼠和人肾脏中的差异调节模型。在小鼠后肾间质（E10.5）中，Six1型该表达由因子“X”驱动，并被积极转录（Pol II）。然后Six1可以激活Six2型表达（1），随后Six2可以通过自动调节环驱动其自身的表达（2）。因为这两个位点都是活跃的，所以它们被标记为H3K27ac（ac）。然而，在成熟的肾单位祖细胞中，Six1型不再表达，并显示H3K27me3（me3）的组蛋白抑制特征。Six2无法访问Six1型并继续推动其自身表达。在人类后肾间质中（～5 妊娠周）SIX1系列和SIX2系列未知。在成熟的肾单位祖细胞中，与小鼠相比，SIX1系列是活跃的，表达是由SIX2及其自身驱动的。同样，SIX2系列表达式由SIX1及其本身驱动。SIX1和SIX2可能通过离散复合物调节表达。
人类转基因活性检测SIX1系列（本文）和鼠标Six1型(Sato等人，2012年)增强子模块表明，最初的激活机制可能通过一个共同的增强子进行调节，该模块和其他潜在模块促进人类SIX1的持续性SIX因子介导的肾单位祖细胞表达。在这种情况下，增强子在鼠标中沉默Six1型通过额外调节器的活动定位可能会阻止Six1和Six2的参与，导致早期下调Six1型在鼠标中。在人类肾脏中，这种增强子沉默活性是不存在的，并且两者都存在SIX1系列和SIX2系列肾单位祖细胞在数周的高活性肾发生过程中持续表达(). 或者，人类SIX1系列可能会利用不同的调节元素，这些元素没有与鼠标共享，并且被排除在Enh2之外SIX1系列初始激活触发点丢失后人类肾单位祖细胞的表达。
人类SIX1系列增强子在E10.5表现出最强健和一致的活性，Enh2在E10.5显示出后肾间质活性，重叠内源性Six1型表达式(Xu等人，2003年). 然而，到E15.5时，他们的报告者表达模式变得可变，活性很少。然而，超过50%的转基因小鼠表现出来自Six2型远端增强子(Park等人，2012年; L.L.O.和A.P.M.，未发表的数据），此时只有6-20%的人显示出来自人类增强子的活性。这表明人类增强子受到与小鼠Six1调控对应物相似的调控，但在某些转基因系中可能会逃避这种调控，因为转基因整合位点可能会影响表达结果。重要的是，由于SIX1/2结合基序在两种增强子中的小鼠和人类之间是保守的(A） ，小鼠的不同调节结果Six1型和人类SIX1系列似乎不是由于丢失了Six特定的结合元素。
在E16.5的小鼠肾单位祖细胞中Six1型该位点由H3K27me3标记，表明PRC2介导的转录沉默。这种沉默何时以及如何发生尚待确定。在鼠标中，Six2型祖细胞的表达一直延伸到肾发生期结束时肾单位祖细胞的耗竭(Hartman等人，2007年;Rumbale等人，2011年). 目前尚不清楚SIX1和SIX2在人类肾脏发生过程中的时间表达模式。据报道，SIX2在24岁时在人胎肾祖细胞中表达 发育周，但肾发生持续到36周 周(Murphy等人，2012年).
distinct的功能意义Six1/Six1老鼠和人之间的调节在这个时候是一个值得猜测的问题。显然，Six1和Six2是肾单位祖细胞的关键调节因子(Xu等人，2003年;Li等人，2003年;Self等人，2006年;Xu和Xu，2015年)Six2通过对抗祖细胞对肾发生的承诺来维持和扩大祖细胞(Self等人，2006年;小林等，2008年;Park等人，2012年). 一个有吸引力的模型提出了SIX1和SIX2在修改祖细胞程序以延长祖细胞扩展周期方面的双重作用。肾母细胞瘤细胞系中SIX2的过度表达增加了S期细胞的数量(Senanayakea等人，2013年)支持SIX蛋白水平升高促进细胞增殖和祖细胞扩增的观点。在ITGA8中，SIX2的表达水平高于SIX1+祖细胞富集人群（分别为157.12 RPKM和21.57 RPKM；表S3)提示SIX2仍然是肾单位祖细胞中的主要SIX因子。六个水平相对较小的变化可能会对祖先数量的平衡产生重大影响。此外，最近的证据表明，OSR1/OSR1在人类和小鼠中显示出与SIX1相当的表达水平（RPKMs分别为16.21和32.01；表S3)，与Six2协同作用，维持肾单位祖细胞(Xu等人，2014年). 还需要进行更多的实验研究，以探讨人类SIX1在扩大肾单位祖细胞中的意义。
Six2及其人类SIX对应物还结合增强子，该增强子激活编码促进祖细胞分化的关键信号的基因的表达，例如Fgf8型和重量4，表明六/六因子在控制祖细胞承诺中的作用(Park等人，2012年以及其中的数据）。最终，祖细胞活动的周期取决于祖细胞更新和承诺的平衡，改变这两个过程的动力学将影响肾单位祖细胞池的大小和肾发生的持续时间。人类肾单位祖细胞池寿命的延长可能是人类肾脏中形成的肾单位数量比小鼠肾脏多100倍的关键因素。进一步的机械洞察力可以从以下方面获得：Six1型/2以及肾发生期和肾单位计数更接近人类肾脏的实验哺乳动物模型中的调节活性。
细胞编程中的SIX1/2与威尔姆斯肿瘤
最近的报告表明，SIX1和SIX2都是将人类近端小管细胞重新编程为肾单位祖细胞所必需的(Hendry等人，2013年)，表明SIX1可能与SIX2具有额外的非重叠功能。另外，SIX蛋白的绝对水平可能很重要，而重编程和祖细胞维护需要高水平的SIX蛋白。SIX1/2突变最近与Wilms肿瘤相关(Wegert等人，2015年;Walz等人，2015年). 这些数据进一步证明，肿瘤的芽细胞成分反映了肾单位祖细胞生态位的特征。有趣的是，Wegert等人（2015）对有和无SIX1突变的肿瘤样本执行SIX1-ChIP-seq。从野生型肿瘤数据中恢复的基序GAAACCTGATCC与从SIX1/2基序中恢复的TGAAACCTGA紧密匹配。对肿瘤和发育程序进行比较分析，可能会确定调控网络和基因靶点，它们负责通过化疗使这些肿瘤细胞持续存在。
材料和方法
小鼠和人类肾脏样本
所有外科手术、小鼠处理和饲养均按照南加州大学动物护理和使用委员会（IACUC）发布的指南进行，并经IACUC委员会批准。使用的小鼠菌株如所述补充材料和方法.16-17岁之间未经鉴定的人类胎儿肾组织 在知情同意和选择性终止妊娠后，从Novogenix实验室获得妊娠周。发育年龄由超声波测定。
ChIP-seq公司
E16.5小鼠肾组织的ChIP-seq基本上按照所述进行(Park等人，2012年). 对于来自人类胎儿肾脏的ChIP-seq，对样品进行显微解剖以去除皮层，并孵育30 室温下交联缓冲液中的最小值(Park等人，2012年). 通过添加甘氨酸阻止交联。用含有蛋白酶抑制剂（PI）的PBS洗涤组织，匀浆、成丸，并在B Dounce匀浆器的帮助下在小鼠ChIP裂解缓冲液中裂解。使用鼠标ChIP协议处理该点的样品。使用下列抗体进行ChIP表S1使用ThruPLEX FD制备试剂盒（Rubicon Genomics）制备小鼠和人ChIP DNA的测序文库。在南加州大学表观基因组中心对Illumina HiSeq 2000的文库进行了测序。
荧光激活细胞分选（FACS）
E15.5来自Cited1-nuc-TagRFP-T的肾脏+如前所述，分离胚胎并进行FACS处理(Park等人，2012年). 隔离ITGA8+取人胎儿肾脏的细胞，取下外囊，用利伯拉（Roche）培养肾脏，去除外皮质细胞层。细胞悬液与抗ITGA8（R&D，AF4076）和适当的Alexa荧光标记二级抗体孵育。在BD FACSAria II流式细胞仪上进行分类。
增强子区的转基因分析
如前所述进行G0转基因分析(Park等人，2012年). 增强器结构和坐标的详细信息见补充材料和方法样品用X-gal染色，用尼康SMZ 1500荧光显微镜固定并拍照。对于切片，对染色肾脏进行冷冻切片和免疫染色，如下所述。
免疫荧光
16 一周后，将人胎儿肾脏整夜固定。小鼠全胚胎或泌尿生殖系统固定1 h.如前所述，对人或小鼠冰冻切片进行免疫染色(Mugford等人，2008年). 抗体和稀释液详见补充材料和方法蔡司Axio扫描系统拍摄了整个肾脏的图像。Z1滑动扫描仪。所有其他图像都是在尼康Eclipse 90i全荧光显微镜、蔡司LSM 780倒置共焦显微镜或徕卡TCS SP8共焦显微镜上采集的。使用SIX1特异性、SIX2特异性或SIX2交叉反应性抗体类似地固定和染色来自转染的载玻片。
免疫沉淀分析
用pTARGET-SIX2-3×FLAG-P2A-mCherry、pCIG-SIX1-Myc、pCIG-EYA1-Myc或适当的空白对照载体转染HEK293细胞。有关构建物生成和转染的详细信息，请参阅补充材料和方法使用活性Motif核复合物Co-IP试剂盒制备核裂解物。将提取物与与Dynabeads蛋白G结合的抗FLAG（F3165，SIGMA）抗体在4°C下孵育过夜（Life Technologies）。按照Co-IP试剂盒方案，在推荐的高严格条件下，将珠子清洗六次。样品在10%的SDS-PAGE凝胶上溶解，转移到硝化纤维素中，并使用抗FLAG或抗Myc抗体进行标准的western印迹。对于组织协同免疫沉淀，17 对周龄人胎肾进行显微解剖并制备核裂解物。使用蛋白A/G SpinTrap缓冲试剂盒（GE Healthcare）将正常兔IgG、SIX1（Cell Signaling）或SIX2（MyBioSource）抗体与吡米酸二甲酯交联为Dynabeads蛋白G。核提取物与抗体交联珠在4°C下孵育过夜。样品用TBS+0.1%Triton X-100洗涤五次，蛋白质用0.1 M甘氨酸-HCl，pH 2.9。样品按上述方法处理，以进行蛋白质印迹。使用针对SIX1（1:1000）和SIX2（1:100）的抗体进行检测。
