增强的实质小动脉张力和星形胶质细胞信号对自发性高血压大鼠神经血管偶联介导的实质小血管扩张的保护作用

脑片准备

戊巴比妥钠麻醉后，大脑被切除，冠状皮质切片（250至270 μm） 使用Leica VT 1200S振动器（Leica Microsystems，Wetzlar，德国）在含有（mmol/L）KCl 3、NaCl 120、MgCl的冷冻人工脑脊液（aCSF）中切割₂1、氯化钠_三26，NaH₂人事军官₄1.25，葡萄糖10，氯化钙₂2和L-抗坏血酸0.4，渗透压300至305 mOsm，与95%O平衡₂–5%一氧化碳₂（pH值7.4）。切片在平衡的室温aCSF中孵育直至需要。

音调的药理学诱导

定位PA后，记录基线直径约5分钟。然后用含有血栓素A的脑脊液灌注切片₂受体激动剂U46619（100至250 nmol/L）诱导音调，如前所述。^{5,14,15,16,17}然后我们评估了小动脉对10 毫摩尔/升钾⁺（5至10分钟暴露）。用于比较色调百分比和K⁺-SHR和WKY之间的诱导扩张(图1B和1C以及图3B和3C），对U46619（150 nmol/L）被排除在分析之外。

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图1

SHR实质小动脉（PA）对血栓素A的反应性增加₂激动剂，U46619。(A类)的示意图在体外脑切片制备中，使用U46619沐浴液诱导PA色调（右）和基线位置PA的代表性图像（左）。(B类)150引起的直径变化的代表性痕迹 WKY和SHR中的nmol/L U46619。(C类)总结数据显示150人的平均色调值百分比 WKY的nmol/L U46619(n个=14）和SHR(n个=21). 结果表示平均值±标准误差。^*对<0.05. 自发性高血压大鼠；WKY，Wistar京都鼠。

钙成像

在含氟-4 AM（10 μmol/L）和普鲁尼酸（2.5 μg/mL）1½至2小时，然后转移至室温aCSF，直到需要为止。PA可视化后，VSMC Ca²⁺测量了40到60分钟的活动 25分钟U46619（150 nmol/L）暴露。钙²⁺使用Andor Technology Revolution System进行成像（iXON相机连接到横河共焦扫描装置；Andor Technical，英国贝尔法斯特）。使用氪/氩激光（488）以每秒约2帧的速度采集荧光图像 nmol激励；>495 nmol排放）。血管平滑肌细胞Ca²⁺振荡频率（Hz）和振幅（分数荧光-如果/如果₀)在ROI内测量（8×8像素或2.64×2.64 μm） 使用Adrian D Bonev博士（佛蒙特大学）创建的自定义软件放置在活动电池上。这个如果/如果₀通过划分荧光强度计算(如果)通过基线荧光值(如果₀)从20张没有显示活动的图像中确定。钙²⁺使用0.20的阈值检测振荡峰值如果/如果₀对U46619无反应的切片，VSMC Ca增加²⁺被认为是不健康的，并被排除在分析之外。

小动脉插管

有关插管程序的详细信息，请参阅Kim和Filosa。¹⁸简而言之，套管（1.5 外径mm和1.17 mm内径；华纳仪器公司（美国康涅狄格州哈姆登）使用P-97微量移液器（美国加利福尼亚州诺瓦托市萨特仪器公司）制造，注入内部溶液，并安装在MP-225电动微操作器（萨特仪器）上。套管内溶液由KCl 3、NaCl 135、MgCl组成（单位：mmol/L）₂1，氯化钙₂2、葡萄糖10、HEPES 10和1%白蛋白，渗透压300-305 mOsm和pH值7.4。使用PHD 2000注射泵（美国马萨诸塞州霍利斯顿市哈佛仪器公司）控制流明。使用放置在套管前并连接至PS-200压力伺服控制器的压力传感器持续监测系统压力（Living Systems Instrumentation，St Albans，VT，USA）。如前所述计算动脉管腔压力¹⁸使用欧姆定律的推导（电阻=Δ压力/流量）。

一旦发现有明显开口的PA，将一个流出量最小的插管插入小动脉腔内。¹⁸流速（0.05至1.0 μL/min），并使小动脉平衡，直到达到稳定的肌张力（约30分钟）。剪切应力（SS）值如前所述计算¹⁸使用方程式吨=4ηQ/π第页^三在哪儿吨代表SS，η代表粘度，问表示流速，以及第页表示半径。然后在薄片上灌注10 毫摩尔/升K⁺或100 μ摩尔/升吨-ACPD持续5到10分钟。在的子集中吨-ACPD实验，用胶质毒素DL-2-氨基己二酸（DL-AAA；2 mmol/L）持续20至30分钟吨-ACPD暴露于灭活星形胶质细胞。^19,20尽管我们的DL-AAA治疗方案远低于剂量和孵育时间（>3 mmol/L和2小时），之前已证明可诱导神经元毒性，²⁰在我们的实验中，我们不能排除潜在的神经元毒性。然而，我们认为这些数据不会混淆研究结论，因为（1）DL-AAA用于吨-ACPD实验旨在测试高血压对星形胶质细胞和其他下游mGluR表达细胞的影响（见示意图补充图S1)（2）尽管神经元也表达mGluR，吨-ACPD被证明可以抑制神经元活动，^21,22因此，我们预计神经元毒性不会对吨-ACPD引起的扩张。

在实验方案的最后，用零钙灌注切片获得最大直径²⁺含有罂粟碱的aCSF（100 μ摩尔/升）。SS值>200的小动脉 达因/厘米²被排除在峰值色调比较的色调百分比和直径之外（图4）。使用最大扩张的小动脉计算流明直径（内径）、壁厚（外径-内径）/2和壁腔比（外径-内直径）/内径）。

电场刺激

在另一组插管实验中，如前所示，通过电场刺激（EFS）诱发神经元激活后测量血管反应。⁵将两根铂丝放置在大脑切片的两侧，施加200毫秒的100列脉冲 Hz，速率为0.2 Hz，振幅为3至4 V持续约30秒，这是一种引发可重复扩张的方案。为了便于在整个实验期间保持色调，浴液中添加了U46619（100 毫摩尔/升）。EFS诱发的血管反应也在使用20%氧气的脑脊液中得到证实₂.

视频显微镜和实质性动脉柄直径分析

为了进行成像，将切片转移到显微镜室，使用miniplus 3蠕动泵（Gilson，Middleton，WI，USA）持续灌注平衡的aCSF，并用尼龙网格固定。实验室温度保持在35±2 °C，使用连接到直流电源的单线溶液加热器（华纳仪器）（BK Precision，Yorba Linda，CA，USA）。使用iXON相机（Andor Technology）对皮层PA进行可视化，该相机连接至配备有×40或×60 Achroplan物镜（卡尔蔡司显微镜）的Axioskop 2FS显微镜（美国纽约州桑伍德市卡尔蔡斯显微镜）或配备有×60 NIR Apo物镜（尼康）的尼康Eclipse FN 1显微镜（日本东京尼康）。使用Andor IQ软件（Andor Technology）以每秒1-2帧的速度采集图像。使用Adrian D.Bonev博士（佛蒙特大学）创建的定制软件测量小动脉管腔直径。在浴缸应用U46619或PA插管之前，所有使用的PA的管腔直径<20 μm.鉴于PA对所有刺激均匀扩张，在PA中的一个点测量直径，在实验方案中，焦点保持最稳定。

将实质小动脉管腔直径转换为%直径进行分析。在插管实验中，直径表示为Ca为零时获得的最大直径变化的%²⁺含有罂粟碱的aCSF（100 μ摩尔/升）。然而，在用U46619诱导张力的实验中，尽管长时间（>30分钟）暴露于零钙环境中，小动脉并没有最大程度扩张²⁺aCSF含有罂粟碱，可能是由于血管内缺乏流动。因此，在这些实验中，直径表示为与U46619暴露前基线直径的变化%。%色调和%扩张计算如下：%色调=（%基线或最大直径−%稳态色调直径）/%基线或最大×100；%扩张=（%直径@峰值扩张−%直径@稳态音调）/%直径@稳定音调×100。

基线实质性小动脉血管平滑肌细胞Ca²⁺自发性高血压大鼠的振荡频率增加

测试U46619诱导的SHR患者PA张力增强是否与VSMC Ca增加相关²⁺，PA VSMC钙²⁺针对U46619（150 毫摩尔/升）。图2A显示了加载Ca的PA VSMC的典型共焦图像²⁺指示染料Fluo-4 AM和VSMC Ca的相应微量²⁺活动。实质小动脉VSMC Ca²⁺SHR的振荡频率明显较高(n个=23）与WKY相比(n个=28）在基线（U46619暴露前）和U46619暴露开始时（0分钟；0.17±0.02 赫兹与0.10±0.02 赫兹，对=0.04和0.17±0.02 赫兹与0.11±0.02 赫兹；对分别=0.04；图2B). 与PA收缩一致，U46619诱导VSMC Ca显著增加²⁺两个WKY的振荡频率(对<0.001，5至25分钟）和SHR(对<0.05，10至15分钟；图2B). 实质小动脉VSMC Ca²⁺WKY和SHR在任何时间点的振荡幅度没有差异，U46619也没有增加(对=0.15和对=0.35;图2C). 这些数据表明基线VSMC Ca增加²⁺SHR中的振荡频率可能是导致这些动物PA音调增加的一个因素。

增强的音调调节增强的K⁺-自发性高血压大鼠诱导的实质性小动脉扩张

在NVC介导的血管舒张过程中，细胞外K增加⁺(<20 mmol/L）激活VSMC内向整流钾（K_红外)从而引发VSMC超极化。¹因此，我们接下来测量了PA对所施加浴10的响应 毫摩尔/升K⁺用U46619（150）感应音调后 nmol/L，见描述用于激活神经血管单元不同成分的实验范式的模型，补充图S1).图3A显示了细胞外钾的典型痕迹⁺-诱发PA扩张。虽然两组之间的峰值扩张时间没有差异（5.21±1.09分钟（WKY；n个=14）与3.90±0.48分钟（SHR；n个=21);对=0.23），SHR的PA对K的扩张明显更大⁺比WKY（24.44±4.36%对12.61±2.18%对=0.04;图3B).

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图3

音调增加可调节增强的K⁺-SHR引起的实质小动脉（PA）扩张。(A类)10条代表性痕迹 毫摩尔/升钾⁺-预限150的WKY和SHR PA的诱发性舒张 nmol/L U46619。(B类)显示平均值10的汇总数据 毫摩尔/升K⁺-WKY中的诱导扩张(n个=14）和SHR(n个=21）适用于所有PA（10至70%色调）和具有类似色调的PA（20至40%色调；WKYn个=8，SHRn个=7). (C类)色调百分比和K百分比之间的相关性⁺WKY中的诱导扩张(n个=30）和SHR(n个=29）在U46619剂量范围（100至250）的小动脉预狭窄后 毫摩尔/升）。结果表示平均值±标准误差。^*对<0.05. SHR，自发性高血压大鼠；WKY，Wistar京都鼠。

我们的研究小组先前证明了细胞外钾的含量与细胞外钾含量呈正相关⁺-诱发性扩张和扩张前PA声调水平¹⁴-声调较高的PA对血管扩张刺激的反应更大。考虑到SHR PA对U46619的反应更加收缩，增强的K⁺-SHR引起的扩张可能是因为音调增强。因此，K⁺-WKY中诱导的扩张相似(n个=8）和SHR(n个=7）（12.80±3.11%对17.45±4.52%对=0.40;图3B)当在具有相似百分比音调（20-40%）的PA之间比较应答时。此外，我们测量了K⁺-分级剂量U46619（100至250 毫摩尔/升）；两个WKY(n个=30;R（右）²=0.34,对=0.001）和SHR(n个=29;R（右）²=0.47,对<0.0001）表明色调与K呈正相关⁺-诱导性扩张(图3C). 此外，各组之间线性回归线的斜率没有差异（0.54±0.14 vs.0.99±0.20；对=0.07）证明K⁺-在WKY和SHR中，当小动脉具有可比较的张力水平时，诱导的扩张相似。总之，这些数据表明，介导K的机制⁺-SHR患者诱发的PA扩张并没有受到损害，而是由于高音调而增强。

自发性高血压大鼠实质小动脉柄肌原性张力增加

为了在更接近正常生理学的条件下测量血管反应性，我们接下来使用了一种改进的在体外灌注和加压PA的脑片制备，我们小组在最近的一份出版物中对这种方法进行了描述和验证。¹⁸ 图4A显示了插管设置的典型示意图。内脏血流和压力使肌原性张力得以发展，从而为解决高血压对PA生物力学的影响提供了一个更具生理学背景。当以0.2至0.3的速率灌注空心微动脉时 μL/min，来自SHR的PA(n个=13）的色调明显高于WKY(n个=17，26.25±2.945对16.93±2.48%对=0.02;图4B). 根据较高的PA音调，SHR与WKY的管腔直径显著降低（13.84±0.43 μm与15.60±0.64 μ米；对=0.04;图4C). 尽管血管阻力的增加与SHR与WKY相比PA管腔压和SS的增加有关（16.00±4.38 毫米 汞，n个=8对7.91±1.64 毫米 汞，n个=10; 和114.0±12.02 达因/厘米²,n个=13对87.72±8.86 达因/厘米²,n个分别=17），这些值没有达到统计显著性(对两者均为0.08）。肌源性张力增加加上U46619诱导的血管收缩增强表明SHR中PA反应性增加。

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图4

SHR患者实质小动脉（PA）肌源性张力增加。(A类)插管设置示意图（左）和插管PA的代表性图像（右）。(B类)显示管腔压力/流量（0.2至0.3）引起的平均色调百分比的汇总数据 μL/min）（WKY）(n个=17）和SHR(n个=13). (C类)显示腔内压力/流量（0.2至0.3）引起的峰值音平均直径的汇总数据 μL/min）（WKY）(n个=17）和SHR(n个=13). 结果表示平均值±标准误差。^*对<0.05. SHR，自发性高血压大鼠；WKY，Wistar京都鼠。

自发性高血压大鼠实质动脉显示血管重塑

为了将所观察到的PA功能改变（即肌原性张力增强）与PA结构改变联系起来，我们还测量了最大扩张的空心PA的壁腔比、管腔直径和壁厚。SHR患者的壁腔比明显较高(n个=39）比WKY(n个=47，0.29±0.01对0.25±0.01；对=0.02;补充图S2A). 尽管SHR的管腔直径相似(n个=39）和WKY(n个=47, 17.71±0.51 μm对18.25±0.48 μ米；对=0.44;补充图S2B)SHR的壁厚显著高于WKY（2.49±0.08 μ米对2.20±0.08 μ米；对=0.01;补充图S2C). 鉴于PA由单个VSMC层组成，这些数据表明PA VSMC肥大导致SHR PA的壁腔比增加。

K（K）⁺-Wistar Kyoto大鼠和自发性高血压大鼠诱发的间充质动脉扩张相似

鉴于张力扩张相关性在确定WKY和SHR中PA对血管扩张刺激的反应程度方面的重要性，为了确定这种相关性是否在具有肌源性张力的PA中持续存在，我们接下来测量了细胞外K⁺-空心小动脉的诱导性扩张(补充图S1).图5A显示了K的代表性痕迹⁺-诱导扩张。与U46619实验一致，色调-K⁺-WKY的诱导扩张相关性相似(n个=23；R（右）²=0.76,对<0.0001）和SHR(n个=17;R（右）²=0.67,对<0.0001），因为线性回归线的斜率在两组之间没有差异（1.30±0.16对1.41±0.26；对=0.71;图5B). 为了支持线性回归数据，平均K⁺-WKY和SHR对所有PA的诱导舒张作用无差异（24.72±4.372%对19.70±4.88%对=0.45;图5C). 此外，达到峰值K的时间⁺-诱导扩张在各组之间没有差异（4.06±0.36分钟（WKY）和4.38±0.42分钟（SHR）；对=0.57). 这些数据表明K⁺-13至16周龄SHR诱导的PA扩张未受损。

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图5

K（K）⁺-WKY和SHR诱发的实质小动脉（PA）扩张相似。(A类)10条代表性痕迹 毫摩尔/升K⁺-WKY和SHR PA的肌原性张力诱发扩张。(B类)色调百分比和K百分比之间的相关性⁺WKY中的诱导扩张(n个=23）和SHR(n个=17）使用管腔压力/流量形成肌源性张力后。(C类)显示平均K的汇总数据⁺-WKY中的诱导扩张(n个=23）和SHR(n个=17). 结果代表自发性高血压大鼠的平均值±s.e.m.SHR；WKY，Wistar京都鼠。

自发性高血压大鼠代谢性谷氨酸受体诱导的实质性小动脉柄扩张增强

因为血管对细胞外钾直接刺激的反应⁺我们接下来在NVC信号通路中向上游移动并刺激mGluR通路(补充图S1). 作为对突触释放的谷氨酸的反应，mGluR激活，可能是在星形胶质细胞中，通过释放血管扩张化合物介导NVC。^1,4因此，作为星形细胞对NVC贡献的间接测量，^14,15我们测量了用激动剂激活mGluR后PA管腔直径的变化吨-ACPD（100 μ摩尔/升）。图6A显示代表性痕迹吨-ACPD引起的扩张。两个WKY(n个=15）和SHR(n个=12）在音调和吨-ACPD引起的扩张(R（右）²=0.51,对=0.003和R（右）²=0.76,对分别=0.0002；图6B). 令我们惊讶的是，吨-与WKY相比，ACPD诱导的SHR舒张功能增强，线性回归线斜率更大（1.76±0.31对0.46±0.12；对=0.0004）。在协议中，平均值吨-与WKY相比，ACPD诱导的SHR患者所有PA的扩张明显更高（28.19±5.75 vs.13.45±2.99；对=0.02;图6C). 达到峰值的时间吨-ACPD诱导的扩张在各组之间没有差异（9.79±1.77分钟（WKY）和11.13±1.64分钟（SHR）；对=0.59). 增强的音调-吨-ACPD诱导的SHR舒张相关性表明，谷氨酸介导的血管舒张NVC信号通路可能在SHR中增强。

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图6

星形胶质细胞诱导的实质小动脉（PA）扩张在SHR中增强。(A类)mGluR激动剂引起的典型扩张痕迹，吨-ACPD（100 μmol/L）。(B类)色调百分比和百分比之间的相关性吨-ACPD诱导的WKY扩张(n个=15）和SHR(n个=12）肌原性张力发展后。(C类)显示平均值的汇总数据吨-ACPD诱导的WKY扩张(n个=15）和SHR(n个=12). (D类)总结数据显示与胶质毒素DL-AAA（2 mmol/L）（单位：WKY）(n个=10). (E类)总结数据显示与DL-AAA孵育引起的肌原性张力百分比平均降低（2 mmol/L），以SHR计(n个=5）。(如果)总结数据显示DL-AAA诱导的WKY肌原性张力百分比平均降低(n个=10）和SHR(n个=5). (G公司)显示平均值的汇总数据吨-WKY中DL-AAA存在时ACPD诱导的扩张(n个=10）和SHR(n个=5). 结果表示平均值±标准误差。^*对<0.05,^***对<0.001,^****对<0.0001. DL-AAA、DL-2-氨基己二酸；自发性高血压大鼠；WKY，Wistar京都鼠。

星形胶质细胞活化参与两种主要的NVC机制：K⁺释放和花生四烯酸代谢。⁴为了描述星形胶质细胞K是否增加⁺释放，通过激活端脚BK通道，²³增强星形胶质细胞诱导的SHR扩张，我们测量了由吨-ACPD（100 μ摩尔/升）。+80时 毫伏，吨-ACPD诱导的外向电流在WKY中显著增加(对=0.0006,n个=8）和SHR(对=0.02,n个=8); 然而，减去的电流在各组之间没有差异（273.8±63.94 pA/pF与780.0±324.9 pA/pF；对=0.15;补充图S3B). 与K一致⁺通道打开时，该电流的反向电势为−85.01±4 WKY中的mV和−89.30±2.8 SHR中的mV。这些数据表明K⁺星形细胞末梢的流出并不是增强的原因吨-ACPD诱导的SHR扩张。

鉴于之前的研究表明，mGluR1和mGluR5（吨-ACPD）在成年小鼠中不表达，²⁴我们确定成年WKY和SHR患者是否存在这种情况。补充图S4和S5显示mGluR1和mGluR5表达的代表性免疫荧光图像，以及它们与三种星形胶质细胞标记物的对应共定位：AQP4（末端）、s100β（胞体）和GFAP（初级过程）。虽然主要在mGluR1/5、GFAP和AQP4中观察到显著的共定位，但在s100β中观察到很少（如果有的话）共定位。此外，我们没有观察到mGluR1/5与内皮标记物RECA-1共定位(补充图S4和S5). 这些数据表明，与在小鼠中观察到的情况相反，²⁴在WKY和SHR中，mGluR1/5的表达没有发育调节。

因为神经血管单元的其他组成部分，包括微血管，²⁵也表达mGluRs，我们重复吨-胶质毒素DL-氨基己二酸（DL-AAA；2）存在下的ACPD实验 毫摩尔/升）^19,20阐明星形胶质细胞对mGluR介导的血管舒张的作用。PA插管后，将DL-AAA浸泡20至30分钟，然后将切片暴露于吨-在DL-AAA的持续存在下，ACPD。DL-AAA治疗显著降低了两个WKY患者的语调（24.75±2.79%对35.09±2.08%对<0.0001,n个=10）和SHR（31.28±2.42%对49.28±0.89%对=0.0004,n个=5;图6D和6E); SHR患者的音调降低明显大于WKY患者（35.35±2.62%对15.90±2.23%对=0.0001;图6F). 在DL-AAA在场的情况下，吨-与WKY相比，ACPD诱导的SHR扩张不再增强（分别为14.51±5.89%和16.98±2.05；对=0.63;图6G); 然而，扩张并没有完全废除。总之，这些数据支持星形胶质细胞激活增强作为PA音调增加和吨-在SHR中观察到ACPD诱导的扩张。