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.2002年12月2日；21(23):6539-48.
doi:10.1093/emboj/cdf660。

RelA在离散位点的乙酰化调节NF-kappaB的不同核功能

陈林凤 1, 穆亚军, 华纳C格林
附属公司

RelA在离散位点的乙酰化调节NF-kappaB的不同核功能

陈林凤等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

异二聚体NF-kappaB转录因子的核功能部分通过其RelA亚基的可逆乙酰化进行调节。我们现在证明p300和CBP乙酰转移酶在RelA的体内乙酰化中起着重要作用，主要针对赖氨酸218、221和310进行修饰。对这些位点含有赖氨酸-精氨酸取代的低乙酰化RelA突变体的功能特性以及在p300显性干扰突变体存在下共同表达的野生型RelA的功能特性分析表明，RelA中赖氨酸221处的乙酰化增强了DNA结合并损害了与IkappaBalpha的组装。相反，在不影响DNA结合和IkappaBalpha组装的情况下，赖氨酸310的乙酰化是RelA完全转录活性所必需的。总之，这些发现突出了RelA的位点特异性乙酰化如何不同地调节NF-κB转录因子复合物的不同生物活性。

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数字

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图1。p300乙酰酯RelA体内. (A类)p300的HAT活性是RelA乙酰化所必需的。293T细胞与指定数量的T7-RelA和野生型p300或p300（HAT-）突变表达载体DNA共同转染。通过用抗乙酰化赖氨酸抗体（细胞信号传递）免疫印迹抗T7免疫沉淀物来检测乙酰化（中间面板）。上下面板分别显示了p300、p300（HAT-）和T7-RelA的水平。(B类)p300（HAT-）抑制RelA的乙酰化。用编码T7-RelA的表达质粒DNA单独（5µg）或与p300（HAT-）（10µg，或腺病毒E1A（10μg）联合转染COS-7细胞。RelA（上面板）的乙酰化水平通过以下方法进行评估[三H] 如前所述的醋酸钠标签（Chen，L.等人，2001年）。每个样本中的T7-RelA表达水平显示在下部面板中。
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图2。RelA中的赖氨酸218、221和310对应于p300介导的乙酰化的主要位点。(A类)左图：所测试的RelA的各种C末端缺失突变体的示意图，以及形成潜在乙酰化位点的18种赖氨酸中每一种的位置。星号表示赖氨酸218、221和310的相对位置。右：p300介导的RelA缺失突变体的乙酰化。293T细胞与表达载体DNA（0.5µg）共转染，表达载体DNA编码全长RelA或带有p300表达质粒DNA的指示缺失突变体（2μg）。如图1A所示，检测每个RelA缺失突变体（上面板）的乙酰化水平。每个RelA缺失突变体的表达水平如下图所示。所有这些缺失突变体都能在可比水平上与p300结合（参见补充图1）。(B类)RelA的结构域和RelA（氨基酸198-320）、c-Rel、RelB、p50/p105和p52/p100的蛋白质序列比对的示意图。请注意，赖氨酸218和221高度保守，而赖氨酸310在RelA中唯一存在。(C类)体内全长RelA背景下K-to-R替代突变的乙酰化分析。将对应于K218/221R、K310R和RelA-K218/221/310R（命名为RelA-K R）的突变体转染到COS-7细胞中。通过以下方法评估野生型RelA和各种替代突变体的乙酰化水平[三H] 醋酸钠标签如图1B所示（上面板）。野生型RelA和各种替代突变体的表达水平如下图所示。(D类)将RelA的各种赖氨酸-精氨酸替代突变体（0.5μg）与编码p300（2μg）的表达载体一起转染293T细胞。野生型RelA和各种突变体的乙酰化水平通过使用抗乙酰化赖氨酸抗体（细胞信号传递）进行免疫沉淀，然后使用抗T7抗体进行免疫印迹来测试（野生型Rel A和每个突变体的表达水平如下图所示）。
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图3。RelA K221R、K310R和RelA-KR显示受损的转录激活特性。(A类)用E-selectin–luciferase报告质粒DNA（0.1µg）和RelA的各种赖氨酸-精氨酸替代突变体（1 ng）转染293T细胞。如前所述测量荧光素酶活性（Chen，L。等2001年）。结果表示三个独立实验的平均值±SD(B类)p300的HAT缺陷突变体抑制RelA介导的RelA反式激活。将E-selectin–luciferase报告质粒DNA（0.1µg）和编码RelA的表达质粒DNA（5 ng）单独或分级数量的p300（HAT-）表达质粒DNA转染293T细胞（100 ng、200 ng和400 ng）。荧光素酶活性如（A）所示。(C类)RelA-KR和p300/CBP缺乏合作交易。293T细胞联合转染E-选择素-荧光素酶报告质粒DNA（0.1µg）和野生型RelA或RelA-KR表达质粒DNA（1 ng），单独转染或与增加数量的p300表达载体DNA（100 ng和200 ng）联合转染。荧光素酶活性如（A）所示。
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图4。低乙酰化RelA-KR突变体对κB增强子DNA的结合亲和力较低。(A类)野生型RelA的κB增强子结合活性和RelA赖氨酸-精氨酸突变体的分析。用编码p300和野生型RelA的表达载体或指示的RelA替代突变体转染293T细胞，制备全细胞提取物。按照材料和方法进行EMSA（上面板）。下面板显示了RelA和每个RelA突变的表达水平(B类)由p50和野生型RelA或RelA-KR突变体组成的NF-κB异二聚体对EMSA中未标记的κB增强子竞争表现出不同的敏感性。将293T细胞的全细胞提取物与编码野生型RelA或RelA-KR突变体的表达载体以及p50和p300表达质粒共同转染，分离并在EMSA中测试其与32P-放射性标记的κB增强子探针，存在越来越多的未标记κB增强子寡核苷酸（冷探针）。(C类)RelA与κB增强子结合的脱落率分析。如材料和方法中所述，通过EMSA测试野生型RelA和RelA-KR与κB增强子结合的失配率。显示了野生型RelA（左面板）和RelA-KR突变体（右面板）的结果。(D类)在p300（HAT-）突变体和野生型RelA存在的情况下测量野生型Rel A的结合失配率，并在p300和p50存在的情况下收集赖氨酸-精氨酸替代突变体。绑定到32如（B）所示，测量P放射性标记的κB增强子，然后通过放射密度测定法评估EMSA结果。给出的结果是两个独立实验的平均值。
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图5。赖氨酸221在RelA中的乙酰化在调节IκBα的组装中起着关键作用。(A类)在哺乳动物单杂交试验中，p300抑制RelA与IκBα的相互作用。在p300或p300（HAT-）增加的情况下，将编码野生型RelA（0.1µg）的表达质粒与融合到IκBα（pFA-IκB a）（1 ng）的GAL4 DNA结合域编码质粒与GAL4增强子荧光素酶报告子（0.1μg）（pFR-luc）（Stratagene）共同转染到293T细胞中突变表达质粒（分别为100ng和200ng）。如图3A所示测量荧光素酶活性。(B类)p300可阻止IκBα共同表达诱导的野生型RelA而非RelA-KR的细胞质隔离。HeLa细胞与编码GFP–RelA（0.2µg）或GFP–RelA-KR和IκBα（50 ng）的表达载体以及野生型p300表达载体（1µg。请注意，在p300存在的情况下，大多数GFP–RelA定位于细胞核，而GFP–LelA-KR主要定位于细胞质。每个面板的右下角显示了显示所示表型的细胞百分比，这些细胞来自于对两个独立实验中多个领域中至少500个细胞的检查。(C类)RelA-KR突变体与IκBα的相互作用更强体内在哺乳动物单杂交分析系统中测试IκBα与野生型RelA或赖氨酸-精氨酸替代突变体的相互作用，如（A）所示。(D类)制备用编码野生型RelA的表达载体或如所述的各种RelA取代突变体与编码p50和p300的表达载体共转染的293T细胞的全细胞提取物，并在EMSA中测试。显示了在添加GST–IκBα重组体（50 ng）的情况下（下部面板）或不存在（上部面板），核复合物与DNA的结合。
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图6。GFP–RelA-KR和K221R突变体主要位于表达细胞的细胞质中。(A类)HeLa细胞被转染GFP–RelA（2µg）（面板g、h和i）、GFP–RelA-KR（2μg）（板d、e和f）或GFP–RleA-K221R（面板g和i）表达质粒DNA。这些细胞的选定培养物用TSA处理（400 nM，5 h）（小组b、e和h）或用钩端霉素b处理（20 nM，2 h）（组c、f和i）。(B类)GFP–RelA-KR主要表达于IκBα的细胞核–/–MEF公司。来自IκBα的MEF–/–用GFP–RelA KR（1µg）（图a）表达载体DNA转染小鼠。IκBα–/–MEF也用编码野生型IκBα（面板B）或IκBαNES缺陷突变体（面板c）的表达载体重建。(C类)一个模型总结了不同赖氨酸残基的乙酰化如何调节RelA的不同功能。赖氨酸221的乙酰化增加了κB增强子的DNA结合亲和力，并阻止了RelA与IκBα的结合；赖氨酸310的乙酰化很可能控制RelA完全反式激活所需的未知因子的关联。
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