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。2005年9月；25(18):7966-75.
doi:10.1128/MCB.25.18.7966-7975.2005。

NF-kappaB RelA磷酸化调节RelA乙酰化

陈林峰 1, 塞缪尔·威廉姆斯, 穆亚军, 中野博彦, 詹姆斯·杜尔, 伦纳德·巴克宾德, 华纳C格林
附属机构

NF-kappaB RelA磷酸化调节RelA乙酰化

陈林峰等。 分子细胞生物学。 2005年9月。

摘要

NF-kappaB p50/RelA异二聚体的核功能部分通过其RelA亚基的翻译后修饰来调节，包括磷酸化和乙酰化。赖氨酸218、221和310处的乙酰化可差异调节RelA的DNA结合活性、与IkappaBalpha的组装以及转录活性。然而，乙酰化是受调控的，还是仅仅由于NF-kappaB的刺激偶联核转位所致，目前尚不清楚。使用抗乙酰化赖氨酸310 RelA抗体，我们在体外和体内用肿瘤坏死因子α（TNF-α）刺激细胞后检测到p300介导的RelA乙酰化。蛋白激酶A/丝裂原催化亚基和应激活化激酶1或IKK1/IKK2的催化非活性突变体的共表达，分别磷酸化丝氨酸276或丝氨酸536上的RelA，显著抑制赖氨酸310上的Rel A乙酰化。此外，丝氨酸276或丝氨酸536上的RelA磷酸化增加了磷酸化-RelA与p300的组装，从而增强了赖氨酸310上的乙酰化。用RelA S276A或RelA S536A重组缺乏RelA的小鼠胚胎成纤维细胞可降低TNF-α诱导的赖氨酸310乙酰化和内源性NF-κB反应性E-选择素基因的表达。这些发现表明，赖氨酸310处RelA的乙酰化受到丝氨酸276和536先前磷酸化的重要调控。这种磷酸化和乙酰化形式的RelA显示出增强的转录活性。

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数字

图1。
图1。
RelA在体外通过p300在赖氨酸310上乙酰化。（A） 体外从293T细胞乙酰化RelA中获得p300免疫沉淀。用HA-p300表达载体DNA共转染293T细胞。p300从细胞中免疫沉淀，并在体外乙酰化试验中与1μg重组RelA（第2道）或GST-p53（第3道）孵育。显示RelA和p53乙酰化以及p300乙酰化的自动放射自显影图如顶部面板所示。考马斯蓝染色检测到的p300、RelA和GST-p53水平如底部面板所示。（B） 抗乙酰化赖氨酸310 RelA抗体特异性识别乙酰化赖氨酸310。在体外乙酰化试验中，用免疫沉淀HA-p300培养野生型RelA、K310R或RelA-KR的重组蛋白（1μg）。反应产物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，乙酰化（Ac）通过抗乙酰化赖氨酸310抗体免疫印迹检测（顶部）。RelA、RelA-K310和RelA-KR的级别显示在底部面板中。（C） ●●●●。体内p300乙酰化赖氨酸310的RelA。用编码野生型RelA、K310R或RelA-KR（0.5μg）和p300（2μg）的表达载体DNA共同转染293T细胞。通过用抗乙酰化赖氨酸310抗体免疫印迹抗T7免疫沉淀物来检测乙酰化（顶部）。底部面板显示了T7-RelA水平和各种RelA突变体。免疫印迹法；IP，免疫沉淀。
图2。
图2。
体内内源性RelA对赖氨酸310的刺激偶联乙酰化。（A） TNF-α在体内诱导RelA的赖氨酸310乙酰化。在指定的时间段内用TNF-α（20 ng/ml）刺激293T细胞。制备全细胞提取物，并通过抗乙酰化赖氨酸-31抗体的免疫印迹（IB）检测内源性RelA的乙酰化（Ac）（顶部）。RelA和IκBα的水平分别显示在中间和底部面板中。（B） TNF-α诱导赖氨酸310-乙酰化RelA结合，磷酸化-276 RelA与IL-8基因的κB增强子结合。HeLa细胞用TNF-α处理指定时间。使用抗RelA（α-RelA）、抗乙酰化赖氨酸310（α-Ac-310）或抗磷酸化丝氨酸276抗体或在无抗体（No Ab）的情况下进行ChIP分析，并探测跨越κB结合位点的IL-8启动子序列（左面板）或非特异性控制β-肌动蛋白DNA（右面板）。（C） 使用RT-PCR和赛博绿定量ChIP结合。如上所述（B）提供的样品按照材料和方法进行分析。数据表示两个独立实验的平均值。（D） 在用RelA-K310R突变体重建的RelA-缺陷MEF中，TNF-α诱导的内源性NF-κB靶基因E-selectin表达受损。用TNF-α刺激用野生型（WT）RelA或RelA-K310R重建的RelA-缺陷MEF 0或6 h。分离细胞总RNA，并用实时定量PCR测定E-选择素mRNA的表达水平。结果表示两个独立实验的平均值。
图3。
图3。
丝氨酸276的磷酸化对RelA的乙酰化至关重要。（A） PKA的酶不活性形式c（c）和MSK-1抑制赖氨酸310处RelA的乙酰化（Ac）。293T细胞与编码T7-RelA、p300和分级剂量PKA的表达质粒DNA共转染c（c）（K47M）或MSK-1（D656A），如图所示。通过抗T7（α-T7）免疫沉淀物（IP）与抗乙酰化赖氨酸310抗体的免疫印迹（IB）检测RelA的乙酰化（顶部）。每个裂解物中的T7-RelA水平显示在底部面板中。（B） 丝氨酸276处的丙氨酸或谷氨酸取代阻断赖氨酸310处RelA的乙酰化。用野生型（WT）RelA、S276A或S276E表达载体（0.5μg）和p300（2μg）转染293T细胞。通过用抗乙酰化赖氨酸310抗体对抗T7免疫沉淀物进行免疫标记来检测每个蛋白质的乙酰化水平。RelA、S276A和S276E的等级如底部面板所示。（C） PKA对RelA丝氨酸276的磷酸化作用c（c）增强RelA的体外乙酰化。用重组PKA磷酸化野生型或S276A RelA的重组蛋白（1μg）c（c）（0.5μl）（Promega）。然后在体外乙酰化试验中用p300免疫沉淀物培养反应。用抗乙酰化赖氨酸310抗体免疫印迹法检测RelA的乙酰化水平。每个反应中的RelA水平显示在底部面板中。（D） TNF-α未能诱导MSK-1/MSK-2缺陷MEF中赖氨酸310上RelA的乙酰化。在指定的时间段内，用TNF-α刺激MSK-1/MSK-2缺陷小鼠的MEF。用抗乙酰化赖氨酸310抗体（顶部）或抗磷酸化丝氨酸276抗体（α-P-276）（中部）免疫印迹法分析RelA的乙酰化和磷酸化水平。每个细胞提取物中的RelA水平也显示在底部面板中。
图4。
图4。
RelA在丝氨酸536上的磷酸化促进了RelA在赖氨酸310上的乙酰化。（A） 激酶缺陷型IKK1和IKK2突变体抑制赖氨酸310处RelA的乙酰化（Ac）。293T细胞与编码T7-RelA（0.5μg）、p300（2μg），IKK1（K47M）（0.5μm）和IKK2（K47A）（0.5微克）的表达质粒DNA共转染。用抗乙酰化赖氨酸310（α-Ac-K310）抗体对抗T7（α-T7）免疫沉淀物（IP）进行免疫印迹（IB）检测RelA的乙酰化。每个裂解物中的T7-RelA水平显示在底部面板中。（B） 丝氨酸536处的丙氨酸或谷氨酸取代分别削弱或增强赖氨酸310处RelA的乙酰化。用野生型（WT）RelA、S536A或S536E表达载体（0.5μg）和p300（2μg）转染293T细胞。通过用抗乙酰化赖氨酸310抗体对抗T7免疫沉淀物进行免疫印迹来检测每种蛋白质上的乙酰化水平。RelA、S536A和S536E的级别显示在底部面板中。（C） IKK2在丝氨酸536处使RelA磷酸化，增强了RelA在体外的乙酰化作用。在体外激酶测定中，用重组IKK2（0.5μl）（P-RelA）磷酸化重组RelA（1μg）。然后在体外乙酰化试验中用p300免疫沉淀物培养反应，如图1A图例所示。用抗乙酰化赖氨酸310抗体免疫印迹法检测RelA的乙酰化水平。每个反应中的RelA水平显示在底部面板中。（D） 用E-选择素荧光素酶报告质粒DNA（0.5μg）和RelA的各种S276A、S276E、S536A和S536E突变体（0.1μg）转染RelA缺陷的MEF。36 h后，用或不用TNF-α（20 ng/ml）处理细胞6 h。如前所述测量荧光素酶活性（4）。底部面板显示了每次转染中RelA和各种RelA突变体的表达水平。结果表示三个独立实验的平均值±标准偏差。
图5。
图5。
丝氨酸276和536处的RelA磷酸化增强了RelA与p300的关联。（A） 在哺乳动物单杂交试验中，丝氨酸276和536的丙氨酸替代损害了RelA与p300的相互作用。用编码RelA、S276A或S536A和GAL4-p300N（50ng）的表达质粒（1ng）以及GAL4增强子萤光素酶报告子（0.1μg）（pFR-luc）转染RelA缺陷型MEFs。24小时后，用TNF-α刺激细胞5小时。如前所述测量荧光素酶活性（4）。结果表示三个独立实验的平均值±标准偏差。（B） TNF-α刺激野生型RelA与p300的相互作用，但不刺激S276A和S536A突变体。用TNF-α刺激稳定表达野生型或S276A或S536A突变体的MEF 60分钟。然后用抗RelA（α-RelA）抗体（目录号F-6；Santa Cruz Biotechnology）免疫沉淀（IP）整个细胞裂解物，然后用抗p300（α-p300）免疫印迹（IB）（目录号SC-584；Santa Cruz Bietchnologies）底部两个面板显示了裂解物和免疫沉淀RelA中p300的水平。（C） TNF-α在含有野生型RelA的重组细胞中诱导赖氨酸310乙酰化。用TNF-α（20 ng/ml）刺激由野生型、S276A和S536A RelA重组的MEF达指定时间，制备全细胞提取物，并用抗乙酰化赖氨酸310（α-Ac-K310）抗体免疫印迹检测RelA（Ac-RelA）的乙酰化（顶部）。RelA的级别显示在底部面板中。（D） 在用RelA S276A或S536A突变体重建的RelA缺陷MEF中，TNF-α诱导的内源性E-选择素基因激活受到损害。用TNF-α刺激由野生型RelA、RelA S276A或RelA S536A重建的RelA缺陷MEF 0或6 h。分离细胞总RNA，并用定量实时PCR测定E-选择素mRNA的表达水平。结果表示两个独立实验的平均值。
图6。
图6。
丝氨酸276和536磷酸化在调节RelA乙酰化中作用的示意图模型。PKA公司c（c）-或MSK-1介导的丝氨酸276磷酸化或IKK介导的丝氨酸536磷酸化（A）导致更有效的p300（B）募集，这反过来又介导赖氨酸310（C）的乙酰化（Ac）。磷酸化和乙酰化形式的RelA随后表现出NF-κB依赖性基因的潜在转录（D）。
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