三胸群（TrxG）蛋白MLL1的甲基转移酶活性以及在COMPASS（与SET1相关的复合物）中发现的KMT2（赖氨酸[K]甲基转移酶2）家族的其他成员催化组蛋白H3的Lys4（K4）ε-胺的位点特异性甲基化(希拉蒂法尔德2012). 虽然这些酶具有将组蛋白H3上相同残基甲基化的能力，但这些酶的催化活性与不同的生物过程有关。MLL1/MLL2二/三甲基化H3K4（H3K4me2/3）并调节霍克斯胚胎发育过程中的基因表达(Yu等人，1995年;Dou等人，2006年). MLL3/MLL4调节脂肪生成(Lee等人，2008年)并且主要在两个增强子处使H3K4单甲基化（H3K4me1）(Herz等人，2012年;Hu等人2013)和发起人(Cheng等人，2014年)区域，而SET1A/B是主要的H3K4三甲基转移酶(Wu等人，2008). 然而，尽管在催化活性和功能作用上存在差异，KMT2/COMPASS家族的酶必须组装成多亚单位复合物才能实现其生物功能。
我们对参与H3K4甲基化的蛋白质复合物的分子理解源于从酿酒酵母(Miller等人，2001年;Roguev等人，2001年;Krogan等人，2002年;Dehe等人，2006年). 这些研究表明，在COMPASS和哺乳动物COMPASS样复合物中发现的调节亚单位在稳定酶和刺激其甲基转移酶活性以及将蛋白复合物靶向特定基因组位点方面发挥着关键作用(2013年时装与皮炎). 虽然这些多亚单位蛋白复合物中的每一个都包含独特的亚单位，但KMT2家族的每个成员都与一组共同的四种进化上保守的调节蛋白相关联；即WDR5、RbBP5、Ash2L和DPY30（WRAD）(2013年时装与皮炎). 四亚基复合物直接结合KMT2酶的SET结构域，并作为一个重要的调节平台，刺激该家族中每个成员的酶活性(Dou等人，2006年;Steward等人，2006年;Patel等人，2009年;Avdic等人，2011年;Zhang等人，2012年).
为了理解WRAD复合物组装和MLL1甲基转移酶活性刺激的结构机制，一些研究已经剖析了每个WRAD亚基的结构和功能(2013年时装与皮炎). WDR5对综合体的结构完整性至关重要，它是连接KMT2系列每个成员的桥梁(Dharmarajan等人，2012年;Zhang等人，2012年)调节亚单位RbBP5、Ash2L和DPY-30(Odho等人，2010年;Avdic等人，2011年). 在RbBP5中，预测的非结构化区域与Ash2L和WDR5结合，对刺激MLL1甲基转移酶活性很重要(曹等人，2010;Avdic等人，2011年). 此外，图谱分析已确定RbBP5的这一区域与Ash2L的SPIa和ryanodine受体（SPRY）结构域结合(Chen等人，2012年); 然而，RbBP5与Ash2L相互作用的结构基础尚不清楚。
在这里，我们报道了与RbBP5复合的Ash2L SPRY结构域的晶体结构。我们表明，Ash2L–RbBP5结合特异性由Ash2L和RbBP五上的几个保守残基赋予。结构导向突变分析表明，这种结合界面的破坏会损害WRAD复合物的形成、MLL1甲基转移酶活性的刺激和红系细胞的终末分化。有趣的是，该结构揭示了RbBP5上的磷酸化开关刺激WRAD复合物的形成，并通过KMT2酶增加H3K4的甲基化。
结果和讨论
Ash2L与RbBP5配合物的晶体结构
在确定Ash2L SPRY结构域结合RbBP5的344–364残基后（补充图S1），我们试图获得Ash2L和RbBP5之间相互作用的结构见解，并解决Ash2L的晶体结构SPRYdel公司与RbBP5的344–357残基对应的肽形成复合物，分辨率为2.20Ω（补充表S1）。Ash2LSPRYdel公司域采用由两个反平行β片（称为a和B）组成的扭曲β三明治。A片由β2、β4、β5、β6、β7和β11组成，而B片由β1、β3、β8、β9、β10和β12组成。这两个薄片由几个不同长度的相互连接的环连接在一起，这些环延伸出β-三明治褶皱和Ash2LSPRYdel公司结构域以短α螺旋（α1）结束().
ASH2L SPRY域在RbBP5上绑定D/E框。(一个)Ash2L SPRY域（绿色）与RbBP5（黄色）复合体的卡通表示，以及Ash2L SPRY域与RbBP 5之间交互的缩放视图。Ash2L和RbBP5碳原子分别以浅绿色和黄色突出显示。关键氢键显示为红色虚线。为了清楚起见，只显示了交互的子集。(B类)静电势的等高线为−10 kbTe−1（红色）至+10 kbTe−1（蓝色）。（e） 电子电荷；（kb）玻尔兹曼常数；（T） 温度单位为开尔文。放大后的视图显示Ash2L带正电荷的裂缝(C类)稳定RbBP5进入Ash2L SPRY肽结合囊的相互作用示意图。黄色球体代表RbBP5残留物。与RbBP5形成氢键（填充盒）、疏水接触或范德瓦尔斯接触（空盒）的Ash2L残留物呈蓝色。氢键突出显示为橙色虚线。为了清楚起见，图中省略了一些交互作用。
模拟退火省略图显示RbBP5肽的清晰电子密度，包括残基345–354（补充图S2A）。RbBP5 E344侧链（单个字母表示RbBP五残基）和残基355–357未观察到电子密度，因此未在结构中建模。RbBP5肽采用椅状构象，位于由表a的β4–β5–β6–β7形成的浅表面上。肽的N端半部分（残基344–348）采用细长构象，并垂直向下突出至Ash2L SPRY结构域的基本表面(). 在肽的这一区域，RbBP5 E347侧链使范德瓦尔斯与Ash2L残基的主链接触，形成β1–β2环，而R348侧链暴露在溶剂中。与之形成鲜明对比的是，E349侧链绑定在由Tyr313和Arg367侧链形成的深口袋中(). E349的主链羰基与Ash2L Tyr313羟基形成氢键，而其羧酸基与Arg367的鸟嘌呤基团形成若干氢键。F352苯基侧链位于S形构象的凸起中，与Tyr313、Pro356和Tyr359侧链进行疏水接触。与E349类似，D353羧酸基团与Arg343鸟嘌呤基团形成两个氢键，表明Ash2LSPRY公司带正电荷的间隙对于结合RbBP5中主要由谷氨酸和天冬氨酸残基（后来被称为D/E盒）占据的区域很重要().
Ash2L/RbBP5相互作用的中断损害MLL1酶的刺激并延迟红细胞末端分化
在对Ash2L/RbBP5复合物进行结构分析后，我们首先寻求识别与RbBP5s结合的关键Ash2L残基。使用等温滴定量热法（ITC）(; 补充图S3A），我们发现Tyr313和Arg343两种残留物的替换衬在Ash2L的底部SPRY公司D/E结合囊，分别与RbBP5 E347和D353相互作用，丙氨酸严重损害RbBP5.结合。因此，与野生型Ash2L相比，使用相同突变体进行的酶分析导致MLL1甲基转移酶活性降低了大约五倍(; 补充图S3B）。突变Pro356和Arg367，残基与RbBP5 D/E盒的疏水突起和E349相互作用，导致结合分别减少6倍和13倍。因此，用Ash2L Pro356Ala和Arg367Ala突变体重组复合物未能像野生型Ash2L那样刺激MLL1甲基转移酶活性，这表明疏水残基内衬的带正电荷的Ash2L囊对WRAD组装和MLL1甲氧转移酶活性很重要().
Ash2L和RbBP5之间的相互作用对于红细胞的终末分化至关重要。(一个)如补充图S1C所示，使用ITC测定解离常数。(B类)甲基转移酶分析仅使用MLL1 3762–3969（−）或在存在野生型Ash2L（+）（WT）或指示突变体的情况下进行。(C类)Ash2L SPRY表面残基的突变可防止H3K4me3在β-珠蛋白LCR。如前所述，通过染色质免疫沉淀（ChIP）测量H3K4me3的富集(Sarvan等人，2011年)使用空载体（K/D）或对应于Ash2L野生型或Ash2L R343A、P356A、Y359V或R367A突变体的构造。这个插入图示了内源性Ash2L敲除的Western blot，以及在分化的MEL细胞中使用TFIIH p89作为负荷控制的shRNA-resistant Flag标记的Ash2L野生型或突变体进行拯救。(D类)Ash2L和RbBP5之间的相互作用对于β-珠蛋白基因表达。的转录β-主要珠蛋白基因(βmaj-globin)如前所述，使用定量RT-PCR评估与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的比较(Demers等人，2007年).
Ash2L对于维持高水平组蛋白H3K4三甲基化至关重要(Steward等人，2006年;Demers等人，2007年)小鼠红细胞白血病（MEL）细胞中Ash2L的敲除导致细胞超敏位点2（HS2）的H3K4me3标记降低β-珠蛋白基因座控制区（LCR）和伴随的基因丢失β-珠蛋白基因转录是红细胞末端分化的标志(Demers等人，2007年). 为了测试突变对Ash2L/RbBP5复合物形成的影响，我们在稳定表达针对Ash2L的多西环素（Dox）诱导的shRNA的MEL细胞中转染了与Ash2L野生型和形成RbBP5结合袋碱基的残基的单点突变体相对应的Flag标记的构建体(Demers等人，2007年). 用Dox处理细胞后，HS2位点H3K4me3减少了40%，相应的减少了50%β-珠蛋白基因表达(). 小发夹抗性标记-Ash2L转染MEL细胞重量恢复H3K4me3和转录β-珠蛋白基因到野生型水平。与我们的结合和甲基转移酶分析一致，Flag-Ash2LArg343ALa公司和标志-Ash2LPro356Ala公司突变体未能保持最大表达β-珠蛋白基因()拯救H3K4me3的损失。相关地，转染Flag-ASH2LTyr359Val公司，一种表现出类似Ash2L活性的突变体重量，恢复H3K4me3和β-珠蛋白与Ash2L相似的基因表达水平重量总之，我们的研究结果强烈表明，功能性Ash2L/RbBP5异二聚体对于维持MEL细胞的分化潜能至关重要。
S350上RbBP5的磷酸化增强WRAD组装
MLL1受到各种机制的严格调节，包括WRAD复合物的变构调节(Dou等人，2006年)组蛋白上其他翻译后修饰的沉积(Southall等人，2009年)和通过ATR磷酸化MLL1(Liu等人，2010年). 在RbBP5 D/E盒（补充图S4）中，在Ash2L SPRY凹面的中心发现了进化上保守的丝氨酸残基（S350）(). 有趣的是，三项独立研究表明RbBP5 S350在体内被磷酸化(Christensen等人，2010年;Phanstiel等人，2011年;Shiromizu等人2013). 为了确定RbBP5磷酸化对WRAD形成的影响，我们在HEK293细胞中与Flag标签融合的情况下，体外表达了与野生型RbBP4或RbBP5S350A突变相对应的结构。虽然我们在野生型Flag-RbBP5的免疫沉淀后观察到Ash2L的富集，但Flag-RbBP5 S350A与M2琼脂糖珠的孵育未能共同免疫沉淀Ash2L(). 我们的发现是S350与Ash2L没有显著的相互作用()它对丙氨酸的取代破坏了WRAD组装，这表明保持S350上的羟基对于Ash2L和RbBP5之间的高亲和力相互作用至关重要。接下来，我们使用ITC来确定S350磷酸化对RbBP5与Ash2L结合的影响，并发现磷酸化肽RbBP5344-357绑定到Ash2LSPRY公司亲和力高15倍()，有力地表明Ash2L SPRY结构域是一个新的磷酸化受体结构域。
RbBP5的磷酸化刺激WRAD复合物的形成。(一个)RbBP5 D/E盒在进化上是保守的。RbBP5 D/E盒的序列对齐智人（Hs），热带非洲爪蟾（X吨），达里奥·雷里奥（医生），黑腹果蝇（Dm），五倍子（Gg），卡罗琳按蚊（交流），袋獾（Sh），拟南芥（时间），葡萄裂殖酵母（Sp），以及酿酒酵母（Sc）。氨基酸保护率为100%、99%–75%和<75%的位置分别以黑色、蓝色和青色表示。(B类)将S350替换为丙氨酸可减少RbBP5和Ash2L之间的相互作用。用M2琼脂糖珠免疫沉淀RbBP5-野生型和S350A的体外表达标记结构。用所示抗体检测RbBP5和Ash2L。(C类)RbBP5 S350的缩放视图。残留物的颜色如(D类)磷酸化RbBP5以更高的亲和力结合Ash2L。RbBP5的代表性ITC实验磷与Ash2L结合。数据如补充图S1C所示。(E类)Ash2L与RbBP5配合物的晶体结构磷.磷酸化S350的缩放视图，其中RbBP5磷和Ash2L碳原子分别呈现为橙色和深黄色。氢键如所示.
了解Ash2L与RbBP5结合偏好的结构基础磷，我们解决了Ash2L/RbBP5的晶体结构磷复杂。Ash2L/RbBP5磷复合物与Ash2L/RbBP5对齐，均方根偏差为0.192？，表明RbBP4的结合磷与未修饰的配合物相比，不会诱导Ash2L SPRY结构域的大规模结构重组。然而，磷酸部分取代了Ash2L的Lys369侧链，以适应与磷酸基团的短水介导氢键()，证明Ash2L SPRY结构域读取RbBP5磷酸化形式的能力。
RbBP5磷酸化：一种控制WRAD组装的新型调节开关
先前的研究表明，Ash2L C4-Winged Helix（C4-WH）结构域对与DNA结合很重要(Chen等人，2011年;Sarvan等人，2011年)和泛素(Wu等人，2013年)其SDI基序对于结合DPY-30很重要(South等人，2010年;Chen等人，2012年)，我们的结果指向一个模型，其中Ash2L作为一个调节平台，能够整合一系列结合事件，最终导致KMT2甲基转移酶活性的精确调节。在此，我们报告Ash2L也识别RbBP5的磷酸化形式。结合和结构研究表明，Ash2L SPRY结构域结合RbBP5磷具有15倍的亲和力，磷酸部分诱导Ash2L内的局部结构重组，表明Ash2L SPRY结构域是一个新的磷酸结合结构域。然而，Ash2L对磷酸部分的识别不同于其他已知的磷受体。这对于14-3-3蛋白质来说尤其明显，它们在一个明确的基本囊中与磷酸部分进行多种静电相互作用(Rittinger等人，1999年). 一贯地，Muslin等人（1996年）表明14-3-3只能与Raf-1肽的Ser259磷酸化形式结合。我们的观察结果表明，Ash2L与S350的磷酸部分接触的次数相对较少，并与未修饰和磷酸化形式的RbBP5结合，这表明这种磷酸肽识别模式是一个调节WRAD复合物形成的变阻器，而不是一个分配给其他规范的开/关开关磷受体。
RbBP5磷酸化通过KMT2酶控制组蛋白H3K4甲基化
我们的研究表明，RbBP5磷酸化为Ash2L SPRY结构域的结合创造了更好的表位。然而，对结构的仔细检查表明，RbBP5磷酸盐部分并未完全埋入SPRY凹面内()这表明它可能在调节KMT2酶的甲基转移酶活性方面发挥直接作用。为了解决这个问题，我们用His-SUMO标记的MLL3与TALON珠和Ash2L/RbBP5或Ash2L/RbBP5结合进行了下拉实验磷几次洗涤后，用样品加载缓冲液洗脱TALON结合的蛋白质复合物，在SDS-PAGE上解析，并用考马斯染色。与最近的结合研究一致(曹等人，2010)，我们观察到Ash2L/RbBP5异二聚体与MLL3 SET结构域的结合。有趣的是，当Ash2L/RbBP5磷复合物与His-SUMO-MLL3孵育()，表明Ash2L/RbBP5磷二聚体是MLL3SET结构域结合的更好的相互作用平台。
RbBP5 S350磷酸化增加了MLL3的催化活性。(一个)与RbBP5配合物中Ash2L SPRY结构域的表面表征磷Ash2L表面以灰色突出显示，RbBP5的颜色如所示(B类)Ash2L/RbBP5或Ash2L/RbBP 5的下拉分析磷MLL3 SET域的复合物。结合蛋白用SDS-PAGE分离，考马斯染色检测。具有代表性的考马斯染色SDS-PAGE凝胶显示在左边，结合态Ash2L/RbBP5的量化平均值(一个)或Ash2L/RbBP5磷(B类)归一化为MLL3的复合体显示在正确的(n个=3个实验；P（P）< 0.05). (C类)甲基转移酶检测的数量越来越多（在顶部MLL3和Ash2L/RbBP5或Ash2L/RbBP 5的每个图形条（以微摩尔计）磷按照补充图S1B进行分析。(D类)使用与Ash2L/RbBP5孵育的MLL3进行的ESI-MS实验的代表性光谱(顶部)或Ash2L/RbBP5磷(底部)复合物。实验持续时间显示在顶部每个面板的。
根据这些观察结果，我们推测Ash2L/RbBP5磷可能调节KMT2酶的甲基转移酶活性。为了证实这一假设，用不同浓度的MLL3 SET结构域与化学计量量的Ash2L/RbBP5或Ash2L/RbBP5孵育进行酶测定磷。如所示与之前的研究一致(Zhang等人2012)两种复合物均在1μM时刺激MLL3甲基转移酶活性。然而，稀释复合物后，Ash2L/RbBP5未能刺激MLL3的活性，而Ash2L/RbBP5磷保留了MLL3的全部活性，证明RbBP5磷酸化可作为增加MLL3动力学的变阻器。
在确定了RbBP5磷酸化对MLL3动力学的影响后，我们试图确定在用RbBP5/RbBP5重组的Ash2L/RbBP5-异二聚体存在的情况下，MLL1和MLL3催化的K4甲基化程度磷我们进行了酶分析，并对小份反应进行了电喷雾电离质谱（ESI-MS）。与对照反应相比(; 补充图S5），在存在Ash2L/RbBP5异二聚体的情况下，测量MLL1和MLL3的质量从2346移动到2360，对应于单个甲基转移到K4的ε-胺。然而，与使用未经修饰的RbBP5进行的分析相比，当使用用RbBP4重组的Ash2L/RbBP5异源二聚体进行分析时，我们观察到H3K4me1急剧增加磷(). ESI-MS随后的甲基化反应的时间进程进一步表明MLL3/Ash2L/RbBP5磷与与未磷酸化的Ash2L/RbBP5异二聚体孵育的MLL3相比，组蛋白H3肽被强烈甲基化(). 有趣的是，我们还观察到MLL1和MLL3的H3K4me2可检测水平(; 补充图S4），表明Ash2L/RbBP5增强了MLL3催化活性，这是一种主要的组蛋白H3K4单甲基转移酶磷配合物进一步推动反应，观察H3K4me2。有趣的是，甲基转移酶分析使用较高浓度的MLL3（用Ash2L/RbBP5或Ash2L/RbBP重组）进行磷结果表明，这两种复合物均能有效地三甲基化H3K4，但未能显示MLL3/Ash2L/RbBP5增加组蛋白H3K5的二甲基化和三甲基化速率磷复合物（补充图S5）。总的来说，我们的观察强烈表明RbBP5磷酸化将WRAD复合物的组装与KMT2酶的变构调节耦合。
酶分析显示，MLL3单甲基化物H3K4在Ash2L/RbBP5存在下与未修饰的RbBP5.重建。这些观察结果与最近的研究一致，研究表明类COMPASS的MLL3/MLL4复合物主要是在增强子区域和特定启动子区域的单甲基化H3K4(Herz等人，2012年;Hu等人2013;Morgan and Shilatifard 2013年;Cheng等人，2014年). 有趣的是，在MLL3 SET结构域与用RbBP5重组的Ash2L/RbBP5complex孵育后磷，观察到对应于H3K4me1和H3K4me2的峰。此外，当使用更高浓度的MLL3络合物进行实验时，也观察到对应于H3K4me3的峰值。这些观察结果也与最近的研究一致，这些研究表明，NIH3T3-L1细胞中MLL3的缺失导致脂肪生成标记基因启动子区H3K4me3的显著缺失aP2型(Lee等人，2008年). 此外，B细胞特异性敲除PTIP，一种与MLL3/MLL4复合物相关的亚基(Cho等人，2007年;Issaeva等人，2007年)，导致LPS刺激后特定Igh开关区域H3K4me3丢失(Daniel等人，2010年). 这些看似相反的结果可能指向一个模型，在该模型中，RbBP5磷酸化可以作为增加MLL3动力学的开关，促进H3K4me1的形成，H3K4me1可能进一步甲基化，最终形成H3K4-me2/3。与KMT2酶家族成员之间的活性差异类似，我们的观察结果表明，WRAD复合体至少有两个群体存在于专门用于执行不同功能的细胞中。
