蛋白精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）抑制通过视网膜母细胞瘤抑癌途径的激活和多梳抑制复合物2（PRC2）沉默诱导淋巴瘤细胞死亡^*

细胞培养、B细胞分离和FACS分析

NHL细胞系和小鼠原代Eμ-BRD2淋巴瘤细胞在添加10%FBS和1 m米丙酮酸钠。根据机构审查委员会批准的健康保险便携性和责任法案合规性方案收集正常人B细胞，并如前所述从扁桃体组织中分离(17). 按照制造商的规定，使用CD19 MicroBeads（Miltenyi Biotec）从FVB小鼠的脾脏中分离出小鼠正常B细胞，而小鼠原代Eμ-BRD2淋巴瘤细胞则是从FVB-雌性小鼠（Taconic Farms，Germantown，NY）的脾脏纯化出来的如前所述，使用RS-2000辐射器用4个灰烬进行亚致死性照射，并保持在含有磺胺甲恶唑（0.8 mg/ml）和甲氧苄啶（0.16 mg/ml）的水中(26). 为了评估淋巴瘤细胞的增殖，需要使用相等数量（8×10⁵)将感染表达控制GFP shRNA（sh-GFP）或sh-PRMT5-1慢病毒的亲代细胞接种在6孔板中，每2天用台盼蓝染色法计数活细胞数，共6天。为了评估PRMT5抑制对细胞死亡的影响，8×10⁵对照sh-GFP或试验sh-PRMT5-1细胞接种到6孔板中，72小时后收获，并按照制造商的规定用抗annexin V抗体和碘化丙啶（BD Biosciences）染色，然后在Beckman-Coulter FC500流式细胞仪上进行分析。监测Eμ-BRD2淋巴瘤细胞的生长体内，以等量（5×10）静脉注射亚致死剂量照射的8-9周龄FVB雌性小鼠⁴)用表达GFP以及对照sh-GFP或sh-PRMT5-1的慢病毒颗粒感染的GFP细胞分选的原发性淋巴瘤细胞。然后每天监测小鼠的淋巴瘤发展，并在首次出现临床症状时将其杀死。所有小鼠实验均按照联邦和机构动物护理和使用委员会的规定进行。

实时RT-PCR、ChIP、Western Blot和免疫荧光分析

使用TRIzol试剂分离总RNA，基本上如前所述进行逆转录(19，24). 为了测量目标基因的mRNA水平，如前所述，使用TaqMan系统在10μl反应中进行实时PCR(17). 实时PCR分析中使用了以下引物集和探针：PRMT5项目（正向，5′-TATGTGGTACGCTCACA-3′；反向，5′-TGGCTGAAGGTAAACAGG-3′；探针31），RBL2型（正向，5′-TTGTGGGTCTTTTTATATGC-3′；反向，5′-TTTCCATAAACTAAAGTCCAAAGCA-3′；探针62），EZH2型（正向，5′-GAAACTTGTGAACGCCTAA-3′；反向，5′-CAACAAAACTGTCCTCT-3′；探针35），SUZ12型（正向，5′-GGGAGACTATTCTTGATGAGAG-3′；反向，5′-ACTGCAACGTAGGTCCTGA-3′；探针16），EED公司（正向，5′-ATCAATACTTTGGTTTATTCATTC-3′；反向，5′-ATTGAACTGCAACTTAAT-3′；探针21），β-肌动蛋白（正向，5'-GGTAGACGCGACTGTTG-3′；逆向，5′-GGCATGATCAACCTCAAC-3′；探针2），胱天蛋白酶10（正向，5′-GGGAAAAAGGCAGATAAGCA-3′；反向，5′-TCAGGACTGGGTAGCCTGAT-3′；探针18），DAP1（DAP1）（正向，5′-ACAGCAGAGACAGAGAGAGAATGG-3′；反向，5′-TGACCACGAGAGAACACA-3′；探针45），HOXA5型（正向，5′-CGTCCACGCACTCTCTC-3′；反向，5′-CTGGAGTGCTAGGGAGTT-3′；探针83），人力资源部（正向，5′-CCTGGAGCGATCGTAGAAAAC-3′；反向，5′-TGTTTTCTGCAGCTGTATTTC-3′；探针60），CCND1号机组（正向，5′-GAAGATCGTCGCCACCTG-3′；反向，5′-GACCTCCTCCTCGCACTTCT-3′；探针67），BCL3级（正向，5′-ACTGCCTTTGTACCCACTC-3′；反向，5′-GGTATAGGGTAGGCAGGT-3′；探针6），TP53型（正向，5′-TCACCATTCTTTGCCCCACT-3′；反向，5′-AAAGACCCAAACCAAAATG-3′；探针75），小鼠项目5（正向，5′-GCTGTCACCTGAGTGTCTGG-3′；反向，5′-GATGCTCACGCCATCT-3′；探针99），小鼠鄂尔多斯2（正向，5′-GTGGAGATTATTTCTCTCAGGA-3′；反向，5′-ACGAATTTGCCCTTTC-3′；探针35），小鼠苏西12（正向，5′-AAGTTCAAACAGCAGTTG-3′；反向，5′-GCTGCATGGAAGGCAGCAGTC-3′；探针16），小鼠伊德（正向，5′-CGATGGTTAGGCGATTGAT-3′；反向，5′-TCGCCAAGAGAGTCATTA-3′；探针88），小鼠2卢比（正向，5′-TGCTGTGTGCTTTTATATATATGC-3′；反向，5′-GAATGACGATCATCGCTAA-3′；探针60），小鼠Dap1型（正向，5′-TCAGCCTCATGGGACTAC-3′；反向，5′-AAAAATTTGAGGAGCCCATCC-3′；探针64），小鼠Hrk（小时）（正向，5′-ATGTCTCTTGCTCACTGAGAACT-3′；反向，5′-GTGTAGCGCCAGGAC-3′；探针16），小鼠霍克萨5（正向，5′-ACGGCCTACTCGCTACCT-3′；反向，5′-GTACGGTGAAGTGGAATTCTT-3′；探针32），小鼠1卢比（正向，5′-GCGCAACTAGCTAGAG-3′；反向，5′-TGCGCAAGCAACATAAA-3′；探针3），小鼠抄送1（正向，5′-CTCTCTCGCACTTCTGCT-3′；反向，5′-GGATTGCCATCCATGC-3′；探针67），小鼠Tp53型（正向，5′-GCGCGCGACAAATCCTC-3′；反向，5′-GCGCGCCCTAGCTACAAGGT-3′；探针74）和小鼠Bcl3公司（正向，5′-CTCCAGATGCTCCACAGTCC-3′；反向，5′-AAGCCAGAGCATCTTTCG-3′；探针94）。为了使mRNA水平正常化，使用1×预混合18S引物/探针集（Applied Biosystems）在对照和测试细胞系中测量18S rRNA水平。如前所述，为了监测靶基因的招募，使用来自正常或转化B细胞的交联染色质进行ChIP分析(19，24). ChIP分析中使用了以下引物集和探针：RBL2型（正向，5′-ATTTTTGGCCCCCTTGAA-3′；反向，5′-GCACCCGTAGTCTTGAGCAC-3′；探针3），EZH2型（正向，5′-GGACGAGACAGACAGAT-3′；反向，5′-CCGTCTTTGTCTGAGTGC-3′；探针28），SUZ12型（正向，5′-GCAGGTTGTAGGGAGACGAA-3′；反向，5′-CGGTGTTGCGAGTCTTG-3′；探针19），EED公司（正向，5′-GGTACTTTCCATTCGCCAGA-3′；反向，5′-TCCTTGAGAAAAATGCAAAAC-3′；探针38），CCND1号机组（正向，5′-CGGGCTTTGATCTTTGCTTA-3′；反向，5′-TCTGCTGCTCTGCTACT-3′；探针1），以及BCL3级（正向，5′-CTGCATCCAGGATTCCAGTT-3′；反向，5′-GAGTGGCAGCTATGGTGA-3′；探头4）。

为了检测PRMT5及其下游靶基因的表达，如前所述，制备放射免疫沉淀分析（RIPA）提取物并通过Western blot分析进行分析(19，27). 当测量磷酸-RB1水平时，在存在以下抑制剂的情况下制备RIPA提取物：10 m米β-甘油磷酸，1米米纳_三VO（旁白）₄和50米米氟化钠。针对PRMT5及其表观遗传标记以及SUZ12的抗体已在前面描述过(17，19，28). 抗RB1、RBL1、RBL2、EZH2、EED、E2F1–4、E2F6、HDAC1、HDAC2、cyclin D1、CDK4、CDK6、CDKN2A/p16、CDKN1A/p21、HOXA5、HRK、BCL3、p300和NF-κB p52的多克隆抗体购自圣克鲁斯生物技术公司。抗-EZH2、抗caspase-10、抗DAP1、抗caspase-3和抗磷酸化RB1（Ser-780、Ser-795和Ser-807/Ser-811）抗体购自Cell Signaling Technology，而抗H3（Me_三)K27、抗TP53和抗甲基-TP53抗体购自Abcam。抗H3K9ac和抗H3K14ac抗体均购自EMD Millipore，抗β-肌动蛋白抗体购自Sigma-Aldrich。如前所述进行免疫荧光实验(17).

免疫组织化学

为了评估PRMT5在NHL患者样本中的表达，我们使用了从53例MCL患者（34例常见、14例囊胚和5例多形性组织学亚型）和62例DLBCL患者（29例GCB和33例ABC组织学亚类）采集的福尔马林固定原发肿瘤样本。在第二个组织芯片（TMA）上进行研究，该芯片由福尔马林固定的石蜡包埋组织样品生成，对应于16例MCL和18例DLBCL病例，检测PRMT5、EZH2及其相关表观遗传标记的表达以及RB1、磷酸化RB1（Ser-795）和RBL2水平，包含在原始TMA中，用于研究PRMT5表达。这些实验中使用的第二个TMA是按照之前的报告构建的(29). 所有病例均取自博洛尼亚大学实验、诊断和专业医学系血液病理科的档案。根据世界卫生组织分类，MCL病例分为三种形态变体(4)：9个常见变异体，4个囊胚变异体和3个多形变异体。根据Hans算法，DLBCL样本分为GCB类和ABC类(31)：10个GCB-DLBCL和8个ABC-DLBCL。从TMA块上切下石蜡包埋切片（4-μm厚），脱蜡，然后在Dako-PT-Link（PT100/PT101，DakoCytomation，Glostrup，Denmark）加热，进行抗原提取。将载玻片置于92°C的EnVision FLEX高pH目标回收溶液（K8004，DakoCytomation）中5分钟，然后在室温下与以下抗体孵育：抗PRMT5（1:120稀释）、抗H3（Me₂)R8（1:180），抗H4（Me₂)R3（1:960）、抗EZH2（1:120）、抗H3（Me_三)K27（1:40）、抗RB1（1:120）、抗磷酸化RB1（Ser-795；1:30）和抗RBL2（1:120。用Dako REAL抗体稀释剂稀释所有抗体（S2022，Dako Cytomation）。使用碱性REAL碱性磷酸酶/RED兔/小鼠检测系统（K5005，DakoCytomation）进行免疫染色。最后，用苏木精对切片进行复染。对于阴性对照，省略了主要抗体。根据先前定义的标准，染色截止值大于30%的受检细胞被指定为阳性得分(29). 还记录了弱、中等或强染色强度。使用配备Olympus UPlanFI 40×/0.75数字孔径物镜的Olympas BX41显微镜对免疫组织化学制剂进行可视化，并使用Olympus CAMEDIA C-3040 Zoom数码相机拍摄图像。

PRMT5敲除导致RBL2去抑郁和PRC2沉默

为了确定PRMT5是否会影响RBL2和PRC2的表达，JeKo、Pfeiffer和SUDHL-2细胞被表达对照sh-GFP或两种慢病毒感染PRMT5项目-分析了特异性shRNA（sh-PRMT5-1和sh-PRMT5-2）、总RNA和RIPA提取物(图2). RNA和Western blot分析均表明，PRMT5敲除触发了RBL2型减压和PRC2消声(图2，A类和B类). 因为两者都是PRMT5项目-特定的shRNAs给出了类似的结果，我们仅使用sh-PRMT5-1进行了进一步的实验。为了进一步证实我们的Western blot结果，我们用免疫荧光法测量了PRMT5、RBL2和PRC2的全球水平(图2C类). 我们的研究结果表明，尽管PRMT5、PRC2及其诱导的表观遗传学标记升高，但在对照未感染和sh-GFP感染的Pfeiffer细胞中，RBL2的表达受到抑制。当PRMT5被敲除时，RBL2表达恢复，PRC2水平降低。通过免疫荧光在JeKo和SUDHL-2细胞中观察到类似结果（数据未显示）。此外，当我们测量对照组sh-GFP-和sh-PRMT5-1感染的NHL细胞的增殖时，PRMT5被敲除的细胞的生长受到明显抑制(图3A类)annexin V染色增强后，细胞死亡增强(图3B类)和caspase-3激活(图3C类). 根据这些结果，我们测试了PRMT5敲除是否会影响调节细胞死亡的PRC2下游靶基因的表达。根据之前发布的ChIP-Seq数据(35，36)，我们选择了四个PRC2促凋亡靶基因，包括CASP10公司，激活CASP3和CASP7的启动子半胱天冬酶(37);DAP1（DAP1）作为细胞凋亡的积极介质(38);HOXA5型，一种转录因子在60%以上的乳腺癌中沉默，其再表达可诱导细胞凋亡(39); 和人力资源部通过抑制Bcl-2和Bcl-x激活细胞死亡_L（左）(40). 实时RT-PCR分析表明，尽管PRC2前凋亡靶基因的再激活动力学在NHL细胞系内部和之间存在差异，但所有四个靶基因的失活率均为1.5-4倍(第页< 10⁻³)在PRMT5敲除细胞中(图3D类). 在JeKo和SUDHL-2细胞中观察到类似结果（数据未显示）。重要的是，转录去表达与CASP10、DAP1、HOXA5和HRK蛋白表达增加相关(图3E类). 总之，这些结果表明，PRMT5通过间接抑制细胞死亡诱导基因的表达来促进NHL细胞的生长和存活。

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图2。

PRMT5敲低导致RBL2重新激活和PRC2抑制。 A类，从感染对照sh-GFP、sh-PRMT5-1或sh-PRMT5-2慢病毒的JeKo、Pfeiffer和SUDHL-2细胞中分离的总RNA在感染后72小时通过实时RT-PCR进行分析，如图例所述图1B类数据表示为平均值±S.D。B类，RIPA提取物（20μg）是从未感染的对照组制备的(Ctrl键)感染（sh-GFP、sh-PRMT5-1或sh-PRMT 5-2）NHL细胞系，并使用所示抗体进行免疫印迹分析。加入抗β-肌动蛋白抗体以显示等负荷。C类对照组未感染、sh-GFP感染和sh-PRMT5-1感染的Pfeiffer细胞的免疫荧光检测如图例所述图1D类除TRITC标记的山羊抗兔抗体用作二级抗体外(抗体).

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图3。

PRMT5表达减少抑制NHL细胞生长并诱导细胞死亡。 A类通过接种8×10，检测sh-GFP-和sh-PRMT5-1感染NHL细胞的增殖⁵每2天计数一次活细胞数，连续6天。这个实验进行了两次，一式三份。B类使用碘化丙啶进行FACS分析，评估未感染和感染JeKo、Pfeiffer和SUDHL-2细胞的凋亡(圆周率)/膜联蛋白V染色。C类用对照sh-GFP或sh-PRMT5-1慢病毒感染JeKo、Pfeiffer和SUDHL-2细胞，并用Western blotting分析caspase-3的活化。未感染细胞作为对照(Ctrl键).D类，在指定时间从对照sh-GFP或sh-PRMT5-1感染的Pfeiffer细胞中制备总RNA，并表达CASP10公司，DAP1（DAP1），HOXA5型、和人力资源部通过实时RT-PCR进行分析，如图例所述图1B.工程使用RIPA提取物（20μg）通过Western blotting评估感染sh-GFP或sh-PRMT5-1的JeKo、Pfeiffer和SUDHL-2细胞中PRC2前凋亡靶点的表达，如图例所述图2B类感染后72小时采集用于分析CASP10、HOXA5和HRK表达的样本，而感染后48小时分析DAP1表达。每个图表中的数据表示为平均值±S.D。

PRMT5表达减少使RB1/RBL2-HDAC2抑制复合物恢复向EZH2、SUZ12和EED启动子的募集

发现RBL2去表达与PRC2沉默相关，并且知道EZH2和EED的表达受E2F在人成纤维细胞中的控制(23)，我们试图评估RB-E2F在NHL细胞PRC2调节中的作用。首先，我们检测了EZH2型，SUZ12型、和EED公司使用TESS软件检测E2F-结合位点（-1到+0.5千碱基对）(41). 我们的分析表明，在大肠杆菌中有15和17个E2F结合位点EZH2型和SUZ12型启动子，而EED公司启动子区仅包含一个E2F结合位点。使用识别个别E2F转录因子的抗体，我们使用来自正常和转化B细胞的交联染色质进行了ChIP分析(图4A类). E2F1–4的结合增加了2–9倍(第页< 10⁻³)正常B细胞PRC2组分启动子区；然而，与免疫前对照组相比，只有E2F1、E2F3和E2F4在NHL细胞中的结合增强。我们还检测了口袋蛋白的募集，发现RB1和RBL2的结合增强了2.5–6倍(第页< 10⁻⁴)在正常B细胞中，但在NHL细胞中没有。因为已知口袋蛋白通过与组蛋白脱乙酰酶的直接相互作用和募集来抑制E2F驱动的基因(22)，我们还评估了PRC2亚单位启动子区H3K9和H3K14的HDAC2招募和乙酰化。与RB1和RBL2结合一致，HDAC2的招募增加了2.5–5.5倍(第页< 10⁻³)在正常B细胞中，但在NHL细胞中没有，这表明RB1/RBL2-HDAC2阻遏物复合物招募不足导致NHL细胞PRC2上调。

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图4。

PRMT5抑制恢复RB1/RBL2-HDAC2阻遏物复合物的募集EZH2型，SUZ12型、和EED公司发起人。 A类，使用所示抗体免疫沉淀来自正常B细胞或Pfeiffer细胞的交联染色质，并检测PRC2亚单位的启动子序列，如图例所述图1C.B公司使用来自sh-GFP-或sh-PRMT5-1感染的Pfeiffer细胞的交联染色质进行实时ChIP分析-计算每个抗体相对于免疫前体的富集倍数(圆周率)样品。每个图表中的数据点显示两个独立实验的平均值，一式三份，并绘制为平均值±S.D。

为了评估PRMT5在PRC2调节中的作用，我们在对照sh-GFP和PRMT5敲除的Pfeiffer细胞中敲除了其表达，并监测了相关E2F和RB蛋白在PRC2组分启动子区域的募集(图4B类). 我们的结果表明，虽然E2F的结合没有变化，但有2-4倍(第页< 10⁻³)与对照细胞相比，PRMT5敲除细胞中RB1和RBL2募集增强。HDAC2的募集也增加，并伴随着PRMT5击倒细胞中PRC2组分启动子区域的H3K9/H3K14去乙酰化，突显了RB1/RBL2-HDAC2阻遏物复合物在PRC2调节中的重要作用。在JeKo和SUDHL-2细胞中观察到类似结果（数据未显示）。这些结果表明，PRMT5抑制激活RB1/RBL2并抑制PRC2表达。

PRMT5上调NHL细胞周期蛋白D1-CDK4/6增殖信号

细胞周期蛋白D1-CDK4/6-RB通路是各种癌细胞中改变的一个主要生长调节网络，它控制E2F驱动的转录组(42，43). 我们通过ChIP分析发现，在PRMT5敲除细胞中，RB1募集增强到PRC2组分的启动子区域(图4)这表明RB1已恢复其转录抑制活性，这可能仅在RB1发生低磷酸化时发生。为了验证这个假设，我们检测了NHL细胞中PRMT5和磷酸化RB1之间的关系(图5A类). 我们发现，与正常B细胞相比，NHL细胞中多个位点（Ser-780、Ser-795和Ser-807/Ser-811）的RB1磷酸化更为丰富。我们还分析了细胞周期蛋白D1、CDK4、CDK6及其抑制剂的表达，发现尽管CDKN2A/p16和/或CDKN3/p21的表达增加，但RB1仍然过磷酸化，表明细胞周期蛋白D2-CDK4/6复合物在NHL细胞中具有功能。

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图5。

抑制PRMT5可拮抗细胞周期蛋白D1-CDK4/6信号传导。 A类用所示抗体通过免疫印迹法检测正常和转化B细胞的RIPA提取物（20μg）。对RB1，磷酸化-RB1。B类用对照sh-GFP或sh-PRMT5-1慢病毒感染JeKo、Pfeiffer和SUDHL-2细胞，并用Western blotting分析RIPA提取物（20μg）。未感染细胞作为对照(Ctrl键).C类，Pfeiffer细胞感染sh-PRMT5-1病毒PRMT5项目，细胞周期蛋白D1，BCL3级、和TP53型在不同时间点通过实时RT-PCR进行测量。为了进行比较，检测的目标基因的稳态水平是在感染前确定的，并显示在0小时的时间点。D类，RIPA提取物（20μg）使用所示抗体通过蛋白质印迹分析进行分析，但抗-TP53蛋白质印迹除外，其中分析了100μg的RIPA。在指定的时间点，使用指定的抗体对用对照sh-GFP或sh-PRMT5-1感染的Pfeiffer细胞的交联染色质进行ChIP实验。E类和F类，实时RT-PCR和ChIP分析均进行了两次，一式三次，每个图中的数据点表示为平均值±S.D。圆周率，免疫前。

为了确定PRMT5是否参与促进细胞周期蛋白D1-CDK4/6信号传导，我们通过shRNA-介导的敲除抑制其在JeKo、Pfeiffer和SUDHL-2细胞中的表达，并监测细胞周期蛋白D 1-CDK4/6的表达以及RB1的磷酸化(图5B类). 在所有三种NHL细胞类型中，PRMT5抑制导致细胞周期蛋白D1表达降低。此外，我们注意到CDK6水平略有下降，而CDK4未受影响。为了测量细胞周期蛋白D1-CDK4/6复合物的活性，我们使用三种不同的抗体监测磷酸化RB1的水平。与细胞周期蛋白D1蛋白水平下降一致，PRMT5敲除NHL细胞系中RB1磷酸化被抑制。这些结果表明，细胞周期蛋白D1-CDK4/6介导的RB1磷酸化依赖于PRMT5的存在。

为了进一步阐明PRMT5抑制触发细胞周期蛋白D1下调的机制，我们测量了PRMT5敲除后不同时间点细胞周期蛋白DmRNA和蛋白的表达(图5，C类和D类). 细胞周期蛋白D1 mRNA水平早在36小时就开始下降，而在感染后48小时，敲除Pfeiffer细胞中的细胞周期蛋白D_1蛋白表达下降。在JeKo和SUDHL-2细胞中观察到类似的结果（数据未显示）。先前的研究表明，NF-κB p52-BCL3复合物驱动H1299和U2OS细胞中cyclin D1的表达，TP53介导的抑制BCL3级导致细胞周期蛋白D1转录抑制(44). 然而，TP53抑制的机制BCL3级仍然未知。同一份报告还显示，BCL3表达缺失促进NF-κB p52-HDAC1复合物的形成，该复合物积极抑制细胞周期蛋白D1的转录。

为了研究非霍奇金淋巴瘤细胞中cyclin D1的表达是否通过类似的机制进行调节，我们测量了TP53型和BCL3级PRMT5基因敲除前后的mRNA和蛋白表达。我们发现了BCL3级感染后36小时转录被抑制，这与击倒Pfeiffer细胞中BCL3蛋白表达降低有关(图5，C类和D类). 敲低SUDHL-2细胞中也观察到BCL3表达降低（数据未显示）。然而，由于JeKo细胞尽管可以检测到TP53缺陷TP53型mRNA水平（参考。45数据未显示），我们分析了细胞周期蛋白D1，TP53型、和BCL3级感染表达sh-GFP或sh-PRMT5-1慢病毒的Mino细胞中的mRNA和蛋白表达以及RB1磷酸化（数据未显示）。与我们在Pfeiffer和SUDHL-2细胞中的发现一致，在PRMT5敲除的Mino细胞中，细胞周期蛋白D1的表达受到抑制，RB1的磷酸化也受到抑制（数据未显示）。此外，BCL3级mRNA和蛋白表达在感染后48h下降（数据未显示）。值得注意的是，TP53型在Pfeiffer和SUDHL-2细胞中，PRMT5敲除后36–48小时，mRNA和蛋白质表达增加，但在Mino细胞中没有增加（数据未显示），已知Mino细胞表达高水平的TP53(45)表明TP53参与BCL3级NHL细胞中的转录抑制。

验证TP53是否直接参与BCL3级转录抑制，我们监测其招募到BCL3级Pfeiffer细胞中的启动子(图5E类)以及Mino和SUDHL-2细胞（数据未显示）。TP53结合增强了2-4倍(第页< 10⁻³)在对照组sh-GFP和PRMT5击倒NHL细胞中，表明BCL3级转录抑制不依赖于TP53蛋白的诱导。因为TP53在Lys-372被KMT7（SET7/9）甲基化，并且已知这种修饰增强了TP53的转录活性(46)，我们测量了它的水平以及在BCL3级PRMT5基因敲除前后的启动子。在所有三个NHL细胞系中，TP53K372甲基化在感染后48–72小时降低(图5D类)，Lys-372-甲基化TP53与BCL3级启动子在感染后60-72小时出现最大下降(图5E类)表明TP53K372甲基化缺失与降低BCL3级启动子活性。我们还监测了p300和HDAC2的募集，发现它们的结合与TP53介导的BCL3级转录激活和抑制。

鉴于BCL3下调与细胞周期蛋白D1抑制同时发生，我们检测了NF-κB p52、BCL3和HDAC1在所有三种NHL细胞类型中向细胞周期蛋白D1启动子的募集(图5F类和数据未显示）。我们的研究结果表明，尽管NF-κB p52结合没有随时间而改变，但在PRMT5敲除的NHL细胞中，BCL3的募集在36小时开始出现稳定的减少，并在感染后72小时达到最大值。同时，在感染后36到72小时，HDAC1向细胞周期蛋白D1启动子的募集逐渐增加。总之，这些结果表明PRMT5通过调节TP53/NF-κB p52/BCL3途径促进细胞周期蛋白D1-CDK4/6的增殖信号传导。

PRMT5过度表达与非霍奇金淋巴瘤患者样本中RB1/RBL2失活和PRC2表达增强相关

确定PRMT5在NHL细胞系中过度表达，并通过RB1和RBL2的失活上调PRC2的表达，我们想验证我们在NHL患者样本中的发现。首先，我们评估了从MCL患者采集的原发性淋巴瘤样本中PRMT5的表达(n个=53），GCB-DLBCL(n个=29）和ABC-DLBCL(n个= 33) (表1). PRMT5在大多数MCL中大量表达，组织学亚型显示在普通MCL中阳性率为85%，在囊胚样变瘤中阳性率93%，在多形性变瘤中为100%。当我们检测DLBCL样本时，97%的GCB-DLBCL和100%的ABC-DLBCL显示PRMT5过度表达。

接下来，我们研究了从MCL、GCB-DLBCL和ABC-DLBCL患者采集的原发肿瘤样本中PRMT5、EZH2及其相关标记、RB1和RBL2的表达谱。然而，由于大多数TMA的组织可用性有限，这些研究是在如前所述的新构建的TMA上进行的(29). PRMT5及其诱导的H3（Me₂)R8和H4（Me₂)所有MCL、GCB-DLBCL和ABC-DLBCL患者均出现R3标记(图6和表2). EZH2和H3（Me_三)K27在100%的MCL和ABC-DLBCL标本中呈强阳性。所有GCB-DLBCL样本均显示EZH2表达，80%的临床样本显示H3（Me）的全局染色_三)K27.有趣的是，所有淋巴瘤组织学亚型均显示RB1和磷酸化RB1（Ser-795）的弥漫性强核染色，这在88%的MCL样本和100%的GCB-DLBCL和ABC-DLBCL样本中检测到。与我们在患者来源的NHL细胞系中的发现一致，RBL2在所有原发性肿瘤标本中要么沉默，要么弱表达。这些结果支持了我们的细胞系数据，并进一步证明了PRMT5、磷酸化-RB1和PRC2之间的正相关性以及PRMT5和RBL2之间的反相关性。

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图6。

PRMT5的过度表达与PRC2和磷酸化RB1水平的增强以及RBL2型NHL临床样本中的抑制。MCL中PRMT5的过度表达(n个=16），GCB-DLBCL(n个=10）和ABC-DLBCL(n个=8）原发性肿瘤与H3（Me）相关₂)R8和H4（Me₂)R3超甲基化、RB1组成性磷酸化（Ser-795）、RBL2沉默、PRC2表达增加以及相关的H3（Me_三)K27标记。每个抗体显示三种肿瘤细胞类型的代表性面板。根据“实验程序”所述，对由可评估病例构建的TMA进行免疫组织化学染色