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.2004年11月；24(21):9630-45.
doi:10.1128/MCB.24.21.9630-9645.2004。

人SWI/SNF-相关PRMT5甲基化组蛋白H3精氨酸8并负调控ST7和NM23抑癌基因的表达

莎米莎·帕尔 1, Sheethal N Vishwanath公司, Hediye Erdjument-Bromage公司, 保罗·坦普斯特, 萨伊德·西夫
附属公司

人SWI/SNF-相关PRMT5甲基化组蛋白H3精氨酸8并负调控ST7和NM23抑癌基因的表达

莎米莎·帕尔等。 分子细胞生物学. 2004年11月.

摘要

蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT）与转录激活和抑制有关，但它们在控制细胞生长和增殖中的作用仍不清楚。我们最近已经表明，PRMT5可以与基于标志标记的BRG1和hBRM的hSWI/SNF染色质重塑物相互作用，并且这两种复合物都可以特异性地使组蛋白H3和H4甲基化。在此，我们报告了PRMT5与内源性hSWI/SNF复合物相关，该复合物可甲基化H3和H4 N末端尾部，并表明H3精氨酸8和H4精氨酸3是重组和hSWI/SNF相关PRMT5的首选甲基化位点。为了阐明PRMT5在基因调控中的作用，我们建立了一个PRMT5反义细胞系，并通过微阵列分析确定，当PRMT5水平降低时，更多的基因被释放。在受影响的基因中，我们发现抑癌基因7（ST7）和非转移基因23（NM23）是含有BRG1和hBRM复合物的PRMT5的直接靶点。此外，我们证明，在过度表达PRMT5的细胞系中，ST7和NM23的表达减少，并且这种表达减少与H3R8甲基化、H3K9脱乙酰化和NIH 3T3细胞转化增加相关。这些发现表明，BRG1-和hBRM-相关的PRMT5通过控制参与肿瘤抑制的基因表达来调节细胞生长和增殖。

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数字

图1。
图1。
PRMT5与内源性BRG1和hBRM复合物共存。HeLa核提取物（300 mg）装载在25 ml BioRex 70柱上。收集过流（FT）后，如图所示，用增加的盐浓度清洗柱。收集组分并用抗PRMT5、抗BRG1或抗hBRM抗体进行Western blotting分析。将BioRex 70色谱柱的峰馏分（0.5 M KCl洗脱的馏分4至28，0.8 M KCl洗脱的馏分4至12）合并，并用BC100缓冲液进行透析。将透析蛋白加载到两个DE 52柱上，并按照BioRex 70柱所述进行洗脱。使用免疫前（PI）或免疫（I）抗PRMT5抗体合并峰值分数（0.3 M KCl）并进行免疫沉淀。经过大量洗涤后，用所示抗体进行蛋白质印迹分析。
图2。
图2。
带有标记INI1复合物的PRMT5辅酶。将HeLa S3或Fl-INI1核提取物（180 mg）与抗标记M2亲和凝胶孵育，用20倍摩尔过量的标记肽洗脱hSWI/SNF复合物。用银染法（A）或免疫印迹法（B）和特异性抗体分析洗脱的复合物。使用20μg Fl-INI1核提取物（输入，通道1）、15μl HeLa核提取物洗脱组分（Ctrl，通道2）和15μl洗脱标记的hSWI/SNF（Fl-hSWI/SNF）复合物（通道3）进行蛋白质印迹分析。（C） PRMT5不会与抗标记抗体发生交叉反应。在体外翻译和35S标记的PRMT5与琼脂糖珠或与琼脂酶珠交联的抗标记M2抗体孵育。作为对照，还包括免疫前（PI）和免疫（I）抗PRMT5抗体。按照A组所述清洗免疫沉淀复合物，并通过放射自显影术进行可视化。（D） 重组和hSWI/SNF-相关的PRMT5可使组蛋白H3和H4甲基化。将H1缺失的HeLa核心组蛋白与Fl-hSWI/SNF复合物、亲和纯化的野生型（WT）Fl-PRMT5或突变体（Mut）Fl-PRMT5/G367A-R368A在存在[三H] 考马斯兰染色显示SAM组蛋白，放射自显影检测甲基化产物。（E） 通过Western blot分析，随着免疫纯化的Fl-hSWI/SNF组分（100、200和400 ng）或Sf9表达和亲和纯化的Fl-PRMT5（6.25、12.5和25 ng）数量的增加，对Fl-hSWI/SNF复合物中PRMT5的水平进行定量。星号表示长时间接触抗PRMT5蛋白印迹。（F） 组蛋白H3和H4 N末端尾部的甲基化如面板D所述。反应混合物被发现在Whatman P-81滤纸上，甲基化肽被液体闪烁计数定量，如材料和方法所述。作为对照，显示BSA和H3肽（aa 60至84）的甲基化。
图3。
图3。
重组和hSWI/SNF-相关的PRMT5可以特异性地甲基化H3R8和H4R3。在单一位置（2、8或17）或所有三个位置都含有精氨酸到丙氨酸突变的野生型和突变型H3肽与Fl-hSWI/SNF复合物（a）或标记野生型PRMT5（B）在含有[三H] SAM。类似地，用Fl-hSWI/SNF复合物（C）或Fl-PRMT5（D）培养具有单点突变（R3A、R17A或R19A）或三点突变（R 3A/R17A/R19A。（E） 如上所述，在K9或K14乙酰化的H3肽与Fl-hSWI/SNF孵育。作为对照，显示BSA和野生型H3肽。
图4。
图4。
正反义（AS）PRMT5细胞系的特性。（A） 在NIH 3T3和AS-PRMT5细胞系中评估内源性PRMT5的表达。使用20μg来自NIH 3T3细胞（1至3道）或AS-PRMT5细胞（4至6道）的总RNA进行RT-PCR，并使用针对任一种细胞的特异引物PRMT5项目或GAPDH公司使用2μl（1、3、4和6道）或0.2μl（2和5道）各自的20μl RT反应混合物进行PCR。Control（Ctrl）表示PCR缺少5′底漆（通道1和4）。用于确定PRMT5转录水平的引物位于敲除PRMT5（+39至+1165）序列的下游（+1093至+1306）。（B） 用抗PRMT5和抗MAD抗体进行Western blotting分析NIH 3T3和AS-PRMT5细胞全细胞提取物的增加量（10、20和40μg）。为了定量目的，在同一个印迹上分析Sf9表达和亲和纯化的Fl-PRMT5的增加量（6.25、12.5和25 ng）。星号表示长时间接触抗PRMT5和抗MAD蛋白印迹。（C和D）RT-PCR按照面板A的描述进行，使用针对所示上调基因（C）和下调基因（D）的特异性引物。作为控制，GAPDH公司还对水平进行了分析。
图5：。
图5：。
PRMT5诱导细胞生长和增殖。（A） 用2×105材料和方法中所述的单元格。实验重复了三次，数据点代表六块平板的平均计数。包括标准偏差，但误差条太小，无法显示在图表上。（B） 用免疫印迹法分析从所示细胞系中提取的约40μg全细胞提取物和抗标记抗体，以检测标记的PRMT5细胞系中Fl-PRMT5的表达。用抗PRMT5或抗MAD抗体剥离并探测相同的印迹。（C） 如材料和方法中所述，在与BrdU孵育4.5或9小时后，测定NIH 3T3、AS-PRMT5和Fl-PRMT5细胞中BrdU的掺入。通过FACS分析确定BrdU阳性细胞的百分比。（D） NIH 3T3、AS-PRMT5和Fl-PRMT5细胞生长4天，用碘化丙啶染色，用FACS分析每个细胞系的DNA含量。显示了细胞周期每个阶段的细胞百分比，包括发生凋亡的细胞（A）。
图6。
图6。
PRMT5的过度表达刺激锚定依赖性和非依赖性生长。（A） 约4×10三在含有10%胎牛血清的培养基中培养耐嘌呤霉素NIH 3T3、AS-PRMT5、Fl-PRMT5或耐潮霉素MYC/RAS转化细胞系的细胞，7天后用结晶紫染色菌落。（B） 等号（2×102)在软琼脂中培养10天。以大约35倍的放大倍数显示转化细胞的形态和大小的代表性图片。菌落形成试验一式三份，重复三次。下图所示的数字代表九个平板的平均菌落数。
图7。
图7。
BRG1和hBRM-相关的PRMT5直接参与ST7标准和NM23型（A）用特异性引物对来自Fl-PRMT5、NIH 3T3或AS-PRMT4细胞系的10μg总RNA进行RT-PCRT1l令吉，NM23型，ST7标准、和GAPDH公司使用RT反应混合物的2μl（1、3、4、6、7和9道）或0.2μl（2、5和8道）对每个基因进行PCR。Ctrl表示不带5′底漆的PCR（通道1、4和7）。使用来自Fl-PRMT5、NIH 3T3或AS-PRMT5细胞的交联染色质进行（B、C和E）ChIP分析，如材料和方法中所述，使用免疫前（PI）或免疫（I）抗PRMT5或抗标记抗体（B）、抗H3（Me）2)R8抗体（C）或抗H3AcK9抗体（E）。作为对照，显示模拟（无染色质反应混合物）和无抗体（Ab）（有染色质但无抗体的反应混合物）反应。对于模拟反应、no-Ab反应、PI反应和I反应，扩增10μl洗脱DNA，并分析15μl每种PCR混合物。对于输入通道，PCR扩增0.6μl洗脱DNA，并在凝胶上加载10μl。使用特定引物对扩增T1l令吉（−258至+214），NM23型（−211至+254），以及ST7标准（−228至+209）序列。（D） 抗H3（Me）的特异性2)用1μg和2μg对称甲基化的H3R8肽、非甲基化的N末端和内部H3肽或BSA通过Western blot分析测定R8。
图8。
图8。
BRG1和hBRM被差异地募集到甲基化ST7标准和NM23型发起人。从异步Fl-PRMT5、NIH 3T3和AS-PRMT5细胞系制备交叉链接染色质，并按照图7所述使用免疫前（PI）或免疫（I）抗BRG1（A）和抗hBRM（B）抗体进行ChIP分析。作为对照，显示模拟和非抗体（Ab）反应。（C） 用30μg突变（Mut）BRG1或hBRM细胞系的核提取物通过Western blotting测定催化活性BRG1和hBRM的水平。使用HeLa S3核提取物作为对照，并使用指示的抗体检测蛋白质。（D）T1l令吉，NM23型，ST7标准、和GAPDH公司如图7A所示，使用来自HeLa细胞或表达突变BRG1或hBRM的HeLa电池的RNA，通过RT-PCR分析转录水平。使用RT反应混合物的2μl（通道1、3、5和7）或0.2μl（路径2、4和6）进行PCR。Ctrl表示不带5′底漆的PCR（车道1）。
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