缺氧微环境提升卵巢癌细胞的干样特性

缺氧细胞培养

Xvivo密闭孵化系统（Xvivo系统300 C、 本研究使用美国Biospherix公司）获得不同培养箱中的准确氧气张力。24天后 在常规细胞培养中培养小时（使细胞附着在烧瓶上），将细胞转移到具有不同氧气控制的不同腔室中进行可变培养期，然后采集细胞进行附加检查，包括MTT、球体和集落形成分析、细胞周期分析、，流式细胞术分析、Western blotting、SP和FACS。

MTT分析

为了评估缺氧对细胞增殖的影响，在180中每孔2000个细胞 μl完整的RPMI-1640培养基在常氧（20%O）条件下接种到96孔微孔板中₂)或缺氧（1%O₂)MTT分析前可变培养时间段的条件。此外，为了研究缺氧预处理对细胞增殖的影响是否不同，首先在常压（20%O₂)或缺氧（1%O₂)48的条件 然后在MTT测定之前在常压下培养一段时间。培养细胞达到其时间表后，5 添加mg/ml 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；USA），并在37℃孵育 4°C 将150μL二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich）添加到每个孔中并彻底混合。然后摇晃盘子15次 min，使用分光光度计在490波长下测定吸光度 nm（μQuant；Bio-Tek Instruments，Winooski，VT，USA）。

细胞周期分析

细胞在缺氧或常压下培养48 小时，然后收获成15个 ml无菌分生孢子管，离心并用冰冷的PBS洗涤。细胞计数后，1 × 10⁶细胞在70%乙醇中固定24小时 −20小时 °C，用冷PBS清洗并重新悬浮在含有50的PBS缓冲液中 μg/ml PI和100单位/ml A型核糖核酸酶。然后在黑暗中培养细胞30 室温下的最小值。使用70 优化了门控后的μm尼龙膜，并使用LSRII流式细胞仪（Becton Dickinson，San Jose，CA，USA）进行分析。使用FlowJo软件（7.6版）分析数据。

侵入试验

如前所述，使用24个transwell腔室（Costar，Bodenheim，Germany）进行侵入试验[30]。简单地说，1x10⁴细胞于200年采集并重新悬浮 μl RPMI-1640培养基，不含血清，然后在顶室中电镀。变速箱的下室装满了500个 添加10%胎牛血清的μl RPMI-1640培养基。将细胞悬液涂在基质凝胶膜上，并在37℃下培养 °C持续24小时 细胞通过基质凝胶迁移，用70%甲醇固定过滤器，用0.2%结晶紫染色，用ddH洗涤₂O并在显微镜下计数。

球体形成分析

根据上述方法进行球体形成分析[31]。将ES-2和OVCAR-3细胞在不同的氧张力下放置48小时 小时，然后从细胞培养瓶中取出并收获。单细胞（每孔1000个细胞）在常压下在超低附着六孔板（超低簇板，生命科学）上重新镀膜和培养。这些细胞培养了14个 在正常氧条件下的天，然后在反向混合下评估球体并计数（球体内超过30个细胞被认为是完整的球体）。此外，单个CD44的球体形成分析^明亮的和CD44^昏暗的细胞（每孔800个细胞）也按照上述方法进行。所有实验都重复了三次。

集落形成分析

将80%融合液中的细胞在不同氧气条件下培养48小时 小时，然后用PBS洗涤并从细胞培养瓶中取出，收获并用伯爵夫人细胞计数器（Invitrogen）计数。500个细胞/孔被镀在6孔板中，并在20%的氧气张力下放置14 天，用4%的福尔马林缓冲液固定菌落15天 min，然后用1%结晶紫染色30 min。在显微镜下进行菌落评估之前，用PBS轻轻清洗平板并干燥。此外，CD44^明亮的和CD44^昏暗的细胞（500个细胞/孔）也采用上述方法进行集落形成试验。对含有30个以上细胞的菌落进行计数。菌落形成效率计算如下：菌落数/种子细胞数 × 100%. 数据是三个独立实验的代表。

流式细胞术和流式细胞仪

48岁之后 缺氧培养小时（1%O₂)或常氧（20%O₂)用冷FACS缓冲液（PBS）对细胞进行胰蛋白酶化、计数和洗涤 + BSA 0.02%），最终浓度为1 × 10⁶细胞/试管。用0.5%BSA预封闭细胞30 在冰上孵育30分钟 在黑暗中，在冰上用与别藻蓝蛋白（APC）直接偶联的CD44单克隆抗体和直接与异硫氰酸荧光素（FITC）偶联的CD133单克隆抗体，均来自BD Pharmingen公司。在用冰镇PBS洗涤两次后，细胞悬浮液在800 μl FACS缓冲液通过70 mm尼龙网。样本在LSRII流式细胞仪上进行分析（Becton Dickinson，San Jose，CA，USA）。对采集的每个样本进行活细胞和单个细胞门控，并使用APC小鼠IgG2b和FITC小鼠IgG2b（均来自美国BD Pharmingen）作为阴性对照。实验分三次独立进行。使用FlowJo软件（7.6版）分析数据。

对于FACS，将细胞分离到可存活的单细胞悬浮液中，并用如上所述直接与APC结合的CD44单克隆抗体进行染色。相应的非免疫同型作为阴性对照。前10%CD44⁺用FACS分离并测定为CD44^明亮的细胞和底部10%的CD44^-用FACS分离细胞并测定为CD44^昏暗的细胞。FACS采用流式细胞仪（Becton Dickinson）进行。

SP分析

对于SP分析，1 × 10⁶细胞悬浮在含有2%胎牛血清和2 mM HEPES缓冲液。将Hoechst 33342染料（Sigma-Aldrich）添加到最终浓度为5 1μg/ml的储备溶液 存在或不存在维拉帕米时的mg/ml（50 微米；Sigma）并在37 90°C min，间歇摇晃。培养结束时，用含2%FBS的冰镇HBSS清洗细胞，在4 °C，并在含有2%FBS的冰镇HBSS中重新悬浮。最终浓度为2 向细胞中添加μg/ml，以筛选活细胞。在使用LSRII流式细胞仪（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA）进行分析之前，通过70μm细胞过滤器过滤细胞以获得单细胞悬浮液。通过双重判别法从分析中丢弃细胞聚集体。通过使用红色（蓝色，402-446）对SP细胞进行可视化或分类 纳米）与蓝色（红色，650–670）紫外线通道均为线性模式。

蛋白质印迹分析

收集培养细胞并用200 μl全细胞蛋白RIPA缓冲液（25 mM Tris HCl pH值7.6，100 mM NaCl，1%NP40，1%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠，德国波恩热科学皮尔斯），添加新制备的蛋白酶抑制剂（0.1 μM抑肽酶，1.0 mM PMSF，1个 μM亮肽，1 μM Pepstatin），然后将样品冷冻在−70 30°C min.样品在15000下离心 每分钟转数用于15 4时最小值 °C，将上清液转移到新试管中。根据制造商的说明，使用Bio-Rad蛋白质分析法（美国加利福尼亚州Hercules）测量蛋白质浓度。用台式加热器（111002型，Boekel Scientific，Feasterville，PA，USA）加热至100 5°C SDS加载缓冲液中的最小值（500 mM Tris HCl pH 6.8；10%甘油，2%十二烷基硫酸钠，0.6 M DTT，0.05%溴酚蓝），50 每个样品的μg蛋白质经过10%SDS-PAGE并转移到聚偏二氟乙烯转移膜（Bio-Rad）。在0.05%的TBS-Tween中用5%的非脂肪干乳封闭膜90 室温下培养min，4℃培养过夜 °C，具有针对GAPDH的初级抗体（0.2 μg/ml），10月3/4日（1 μg/ml），Sox2（1 μg/ml），HIF-1α（1 μg/ml）和HIF-2α（1 μg/ml）均来自美国明尼阿波利斯R&D Systems公司。然后，将膜与相应的二级HRP结合抗体孵育，包括抗山羊IgG-HRP抗体（1:2000）或抗小鼠IgG-HRP抗体（1:1000），均来自美国明尼阿波利斯R&D System公司。免疫复合物通过增强化学发光进行可视化（GE Healthcare、Bucks和UK）。western印迹实验至少重复了三次。

低氧预处理促进细胞增殖和侵袭

为了探讨低氧预处理对细胞生物学行为的影响，进行了增殖和侵袭试验。如图所示 2年所有低氧预处理细胞的生长速度均高于常氧培养的对照细胞。当细胞在缺氧条件下预处理48小时时 两种细胞系的MTT值均显著高于常氧培养的细胞(P（P） < 0.05). 此外，我们的侵袭性检测显示，缺氧预处理细胞中的侵袭性细胞数量显著增加，包括OVCAR-3和ES-2细胞。如图所示 2B型OVCAR-3细胞在缺氧条件下侵袭细胞数量增加2.9倍，ES-2细胞在缺氧情况下侵袭细胞数增加3.5倍(P（P） < 0.0001）。

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图2

缺氧预处理诱导细胞增殖和侵袭潜能。所有细胞均在缺氧或常压下培养48小时 在恢复到常氧状态前的小时进行增殖或侵袭检测。（A）缺氧预处理细胞48 hrs的生长速度明显快于常氧培养的细胞(P（P） < 0.05).（B）细胞侵袭试验表明，在两种细胞系中，缺氧预处理组的浸润细胞明显多于正常氧对照组(P（P） < 0.0001).

缺氧增加细胞的球形和集落形成能力

在常氧条件下，两种细胞系中都可以观察到球体（图 3A级). 相比之下，缺氧预处理增加了球体的数量，VCAR-3细胞增加了1.96倍，ES-2细胞增加了1.59倍（图 3B公司). 用集落形成实验检测缺氧预处理后的细胞。与常压下保存的细胞相比，缺氧预处理细胞中观察到更多的菌落（图 3C公司)OVCAR-3细胞和ES-2细胞分别增加了2.38倍和2.86倍（图 三维).

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图3

低氧预处理提高了细胞的球形和集落形成能力。（A）图 3A级显示了在常压下培养的具有代表性的细胞球体。（B）三个独立实验的结果显示，对于两种细胞系，缺氧预处理组的球体明显多于对照组(P（P） < 0.0001).（C）集落形成实验显示缺氧预处理细胞中有更多的集落。（D）三项独立实验的结果显示，低氧预处理组的菌落数明显多于正常氧对照组(P（P） < 0.0001).

缺氧上调CD44和CD133的表达

考虑到缺氧的影响，用流式细胞术检测表面标志物CD44和CD133。低氧条件下，OVCAR-3细胞中CD44表达增加1.99倍，低氧培养的ES-2细胞中CD42表达增加2.73倍（图 4A级). OVCAR-3细胞中CD133的表达也增加了1.48倍，而ES-2细胞在缺氧条件下几乎没有变化（图 4B类). 所有这些数据表明，缺氧诱导这些细胞系中CD44的表达，并对CD133的表达产生积极影响，至少在OVCAR-3细胞中是如此。

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图4

缺氧诱导的分子干样表型。卵巢癌细胞在缺氧（1%O₂)或48小时正常氧 小时后再进行其他分析。（A）相比之下，低氧培养的OVCAR-3和ES-2细胞中CD44的表达水平明显较高。（B）缺氧培养的OVCAR-3细胞中CD133的表达水平也显著升高，但ES-2细胞中CD133的表达增加并不明显。（C）SP分析也显示，缺氧条件下OVCAR-3和ES-2细胞中的SP细胞数量显著增加。（D）缺氧培养的OVCAR-3和ES-2细胞中诱导HIF-1α和HIF2-α表达；（E）OVCAR-3和ES-2细胞中Oct3/4和Sox2的表达也相应增加。

缺氧丰富SP细胞

为了确定缺氧是否影响卵巢癌细胞的干细胞特性，对在常压（20%O₂)或缺氧（1%O₂)用于48 小时。如图所示 4厘米缺氧可使OVCAR-3和ES-2细胞中的SP细胞富集，与常压培养的细胞相比，缺氧培养的OVCAR-2细胞和缺氧培养的ES-2细胞分别增加了约7倍和3.7倍。

缺氧上调HIF和转录因子

低氧诱导因子是低氧激活的转录因子的主要家族。研究缺氧对卵巢癌细胞株HIF-1α和HIF-2α表达的影响。缺氧培养48小时后，OVCAR-3和ES-2细胞中HIF-1α和HIF-2α的表达均显著增加 hrs，而细胞在常压下培养48小时 hrs仅呈弱阳性（图 4D（四维）). 在常氧培养中，HIF-2α水平高于HIF-1α水平。在缺氧条件下培养48小时的ES-2和OVCAR-3细胞中，Oct3/4和Sox2的表达均显著增加 小时，与正常氧条件下培养的细胞相比（图 第四版).