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英国癌症杂志。2010年4月13日；102(8): 1276–1283.
2010年3月30日在线发布。 数字对象标识：10.1038/sj.bjc.6605626号
预防性维修识别码：项目经理2856005
PMID：20354527

卵巢癌干细胞样副细胞具有致瘤性和抗化疗性

L Hu先生，1 C麦克阿瑟，2和R B杰菲1,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景：

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤。尽管卵巢癌患者最初对化疗有反应，但他们通常会产生化疗耐药性。我们假设，一小部分卵巢癌细胞具有干细胞特性，有助于肿瘤发生和耐药性。

方法：

流式细胞术和Hoechst 33342流出法从卵巢癌患者腹水和接种人卵巢癌细胞系的小鼠腹水中分离出副群（SP）细胞。通过免疫细胞化学和RT-PCR检测SP细胞的干细胞标记物OCT4、NANOG、STELLAR和ABCG2/BCRP1。研究SP细胞和非SP细胞的肿瘤发生和化疗耐药性在体外和体内.

结果：

免疫细胞化学和RT-PCR检测到SP细胞表达ABCG2/BCRP1、OCT4、STELLAR和NANOG。SP细胞中ABCG2/BCRP1的表达高于非SP细胞。接种SP细胞的异种小鼠比接种非SP细胞的小鼠产生更多的肿瘤。同时，SP细胞培养导致广泛的细胞增殖，这明显高于非SP细胞。与非SP细胞相比，SP细胞对化疗有抵抗力体内和在体外.

结论：

卵巢癌SP细胞具有致瘤性和化疗耐药性。ABCG2/BCRP1在化疗耐药中起着重要作用，这对新的治疗方法具有指导意义。

关键词：副群，卵巢癌干细胞样细胞，肿瘤发生，耐药性，ABCG2

大多数患有晚期疾病的卵巢癌患者最终会产生化疗耐药性。实体肿瘤中肿瘤干细胞的概念为致癌和化疗开辟了新途径。肿瘤干细胞与正常干细胞有许多共同的特性：它们具有延长寿命、相对静止、自我更新能力、诱导肿瘤发生的能力以及对化疗药物和凋亡的抵抗力(雷亚等, 2001;比奇等, 2004;销售额等, 2007;吴等, 2007).

在癌干细胞上表达的表面标记物可用于分离这些细胞。然而，这些标记物在不同类型的肿瘤中不同。作为干细胞特征之一，挤出Hoechst染料的能力也被用于鉴定癌症干细胞(院长等, 2005). 这些细胞表达药物转运蛋白，使其对许多化疗药物产生耐药性(Allikmets公司等，1998年a;院长等, 2005). ABCG2/BCRP1（乳腺癌耐药蛋白-1）是一种ATP-结合盒（ABC）转运体，也是一种细胞表面抗药性标记物，已被用于识别各种组织中的干细胞，包括肿瘤(周等，2001年1月;迪埃斯特拉等，2002a年). ABCG2/BCRP1表达使细胞对化疗药物产生耐药性，并允许细胞排除Hoechst染料33342（Molecular Probes，尤金，俄勒冈州，美国）(Allikmets公司等，1998年a;院长等, 2005). 这种排除染料的副群（SP）表型已用于各种组织中，以选择假定的干细胞。在多种癌症中，侧群细胞富含癌干细胞样细胞(近藤等，2004年a;Hirschmann-Jax公司等, 2005;原口等, 2006;霍等, 2007;王等, 2007). 这些细胞存在于多种组织和细胞系中，包括骨髓、皮肤、肺、乳腺上皮和胚胎干细胞(阿尔维等, 2003;西村等, 2003;马吉卡等, 2005;亚诺等, 2005). 他们已从包括白血病在内的恶性肿瘤中分离出来(Feuring-Buske和Hogge，2001年;沃尔夫等, 2001)和乳房(Doyle和Ross，2003年)，大脑(Hirschmann-Jax公司等, 2005)，前列腺(Hirschmann-Jax公司等, 2005)、视网膜母细胞瘤(塞格尔等, 2005)，肺(詹格雷科等, 2004)和卵巢(帕特拉瓦拉等, 2005;绍特克等, 2006)癌症。

SP表型和干细胞标记物的表达是正常干细胞和癌干样细胞的标志(周等，2001年1月;沙伦贝格等, 2002;迪埃斯特拉等，2002a年;院长等, 2005).

我们探讨了流式细胞术显示干细胞特性后，通过Hoechst染料排斥法从人卵巢癌细胞中分离出SP细胞的原理。通过免疫细胞化学和RT-PCR检测SP细胞的耐药转运体ABCG2/BCRP1和其他干细胞标记物OCT4、NANOG和STELLAR。研究SP和非SP细胞的肿瘤发生和化疗耐药性在体外和体内.

材料和方法

材料

ABCG2/BCRP1单克隆抗体（BXP-21）来自Sigma Chemicals（美国密苏里州圣路易斯）。OCT 4单克隆抗体来自Chemicon（美国纽约州塔里敦）。NANOG和STELLAR多克隆抗体由加利福尼亚大学旧金山分校（UCSF）的A.Clark博士提供。顺铂来自Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。人类OVCAR3细胞系是T.Hamilton博士（美国宾夕法尼亚州费城福克斯蔡斯癌症中心）赠送的，卵巢癌顺铂耐药细胞系A2780-CP是J.Chan博士（UCSF）赠送的。所有其他细胞系均来自UCSF妇科卵巢组织库。培养试剂来自UCSF细胞培养设施。

人卵巢癌腹水

通过UCSF妇科卵巢组织库在剖腹手术时从III期新鲜卵巢癌患者腹水中收集原发性卵巢癌细胞。收集腹水，并于4点放在冰箱中 1–2°C h.丢弃上清液后，将细胞重悬于培养基（RPMI-1640）中，并离心分离细胞成分。然后用添加2.0的培养基RPMI-1640培养细胞 克 我–1葡萄糖和0.3 克 我–1 L（左）-谷氨酰胺、10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素和1%真菌酮，37℃孵育 摄氏度。在7天内对细胞进行分析，在此期间通过流式细胞术、RT-PCR和免疫分析对SP细胞进行分类。

实验动物

雌性无胸腺免疫缺陷小鼠（Simonsen Laboratories，Gilroy，CA，USA）被送往加州大学旧金山分校实验动物资源中心（UCSF Laboration Animal Resource Center），并被隔离，喂食高压灭菌标准颗粒和水，并允许其适应新环境。所有涉及免疫缺陷小鼠的方案都得到了UCSF动物研究委员会的批准。

小鼠卵巢癌腹水

小鼠腹水收集自腹腔接种人OVCAR3细胞6周的雌性裸鼠（5-7周龄）。在7天内通过流式细胞术对细胞进行分析，对SP细胞进行分选，并如人类卵巢癌腹水切片所述进行RT–PCR和免疫测定。

SP细胞的鉴定

SP细胞的鉴定如前所述古德尔（2002）). 细胞与5 μ克 毫升–1用于90的Hoechst 33342染料（分子探针） 带和不带50的最小值 μM（M）维拉帕米。使用Moflo MLS细胞分选机（Beckman-Coulter，Inc.，Hialeah，FL，USA）对细胞样本进行分析和分选，该分选机具有紫外线功能，并使用SUMMIT软件进行数据采集和分析。用氩激光激发赫斯特染料。荧光发射用405/30 用于赫斯特蓝和670/40的nm带通滤波器 Hoechst红的nm带通滤波器。通过670/30碘化丙啶荧光排除死细胞 纳米。

肾包膜移植

从接种人卵巢癌细胞系OVCAR3的小鼠腹水或卵巢癌患者腹水中分离出侧群细胞或非SP细胞（每个细胞500个 μ如前所述的鼠尾胶原蛋白凝胶(海沃德等, 2001)并移植到雌性裸鼠宿主的肾包膜下。生长8周后杀死宿主，移植肾脏，福尔马林固定，石蜡包埋。

腹膜内接种SP细胞

两组裸鼠(n个=12）分别腹腔接种SP细胞与非SP细胞（20 来自A2780-CP（顺铂耐药人卵巢癌细胞系）。接种后8周，处死小鼠并量化肿瘤负担。在另一项实验中，四组裸鼠（5-7周龄，n个＝16）经腹膜内接种SP与非SP细胞（20 000个细胞）。接种后2周，两组（SP(n个=4)与非SP细胞(n个=4））用顺铂治疗（10 毫克 公斤–1B.W.）每周3次，持续3周。另外两组（SP(n个=4)与非SP细胞(n个=4））仅接收车辆。

SP培养

从卵巢癌患者腹水中获得的侧群细胞和非SP活细胞（各500个细胞）接种在24孔塑料培养板上。细胞在含有10%FBS的RPMI-1640中培养，100 单位 毫升–1青霉素和100 μ克 毫升–1链霉素。培养物在37 °C，在95%O的增湿大气中2和5%CO2。培养基每隔一天更换一次。在培养的第五天结束时捕获细胞的形态学外观。至少对10×150个微观区域进行了评分。

逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）

根据制造商的方案，使用RNeasy minikit（德国希登市齐根市）从携带人OVCAR3细胞的患者和小鼠的腹水中提取人卵巢癌细胞颗粒的总RNA。然后使用OneStep RT-PCR试剂盒（Qiagen）进行反转录-聚合酶链反应。用于PCR扩增的引物为BCRP1（231 bp）：5′-CAACCATTGCATTGTG-3′和5′-CAGGCACGTGTCC-3′STELLAR（174 bp）：5′-GTTACGTGGCGGAGTTCGTA-3′和5′-TGAAGTGCTTGGTGTCTTG-3′。BCRP1和STELLAR的条件均为95 1°C 最小值，58 1°C 最小值和72 2°C 最小值，持续40个循环。将采集的DNA样本加载到2%琼脂糖凝胶上并进行分析。

悬浮液中的荧光免疫染色

患者卵巢癌细胞或OVCAR3细胞在悬浮液中用Hoechst 33342和ABCG2/BCRP1或OCT4进行双重标记。电池（2×106)在800℃下离心 下午5点 分钟。倒出上清液，并在4分钟内将细胞重新悬浮 ml RPMI，含10%胎牛血清。在5时添加Hoechst 33342染料（分子探针） μ克 毫升–1，细胞在37 90°C 分钟。细胞在PBS中清洗两次，并离心5次 分钟。细胞重新悬浮在PBS中，然后接受1 : 200 ABCG2/BCRP1抗体或OCT 4抗体，并孵育1 室温下h。用PBS清洗细胞两次并重新悬浮。在1添加TRITC结合的抗鼠IgG（Sigma Chemicals） : 100稀释。将细胞孵育1 室温下h。用PBS冲洗两次后，细胞被重新悬浮，用吸管移到载玻片上，并用盖玻片覆盖以进行显微镜观察。

SP细胞的免疫荧光分析

侧群细胞直接分类到聚-L（左）-赖氨酸涂层载玻片，然后风干并固定在50 : 50甲醇/丙酮5 最小值，如所述阿尔维等(2003). 用3%马血清加0.05%吐温-20预处理细胞1次 h、 然后在PBS中冲洗并与1 : 500兔抗NANOG抗体和1 : 200只小鼠抗ABCG2/BCRP1抗体1 h.在使用1之前，在PBS中彻底清洗细胞 : 200份FITC-结合的抗兔IgG和TRITC-结合的抗鼠IgG，最后在PBS中再次洗涤。CD34-1染色采用类似程序 : 200用小鼠抗CD34抗体和CD44 1染色 : 200带有小鼠抗CD44抗体。

肿瘤组织中的免疫荧光

接种OVCAR3细胞的小鼠卵巢癌组织在PBS中广泛清洗。在免疫染色之前，用3%马血清加0.05%吐温-20预处理组织1次 h.在PBS中冲洗组织，并与1 : 500兔抗NANOG抗体和1 : 200只小鼠抗ABCG2/BCRP1抗体16 轨道振动筛上的h为4 摄氏度。在使用1 : 200份FITC-结合的抗兔IgG和TRITC-结合的抗鼠IgG，最后在PBS中再次清洗。免疫染色组织用显微镜检查。

细胞凋亡评估

侧群细胞与将非SP细胞（5000个细胞）接种在8孔玻璃培养玻片上。细胞在RPMI-1640中培养24小时 h.然后取下培养基，用培养基替换四个单独的SP细胞孔中的培养基与非SP细胞：（1）载体，（2）顺铂5 μM（M），（3）维拉帕米50 μM（M）（4）顺铂加维拉帕米，再加48 h.用2%多聚甲醛固定后，用细胞评估凋亡。使用载脂蛋白试剂盒（Intergen，Purchase，NY，USA）中提供的试剂，用地高辛-dUTP和末端转移酶进行DNA标记，然后用过氧化物酶偶联抗地高辛抗体和二氨基联苯胺进行免疫细胞化学染色。苏木精光复染后，染棕色的细胞核凋亡得分为阳性，染蓝色的细胞核为阴性。至少对10×150个显微视野进行评分，并将凋亡指数计算为评分为阳性的细胞百分比。

光学显微镜和分析

用Leica DMRB或Leica（Allendale，NJ，USA）Ortholux II光显微镜在低倍和高倍下检查用ABCG2/BCRP1、OCT4和NANOG免疫染色的卵巢癌组织和细胞。图像是用Photonics（日本福冈）DEI-470 CCD相机和RasterOps（美国加利福尼亚州圣克拉拉）24X LTV帧捕捉器采集的，直接导入Adobe Photoshop（美国加州圣何塞）。显微照片板由Photoshop中的原始数据组成，未经修改或操作。

统计

使用未配对学生的t吨-测试各组之间的比较。各组之间的差异在P（P）<0.05. 实验体内重复进行，而实验在体外一式三份。

结果

卵巢癌SP细胞

图1显示了流式细胞术的两个代表性实验。面板A显示，框R4中有少量来自OVCAR3细胞SP的细胞（1.65%）。SP被50阻止了88% μM（M）维拉帕米。图B显示了框P3中来自人类卵巢癌细胞SP的少量细胞（0.3%）。SP被50阻止了80% μM（M）维拉帕米。

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(一个)流式细胞术检测小鼠腹水中人OVCAR3卵巢癌细胞的侧群（SP）。盒装电池（标记为R4）表示Hoechst-不包括SP(B类)流式细胞术检测患者腹水来源卵巢癌细胞的SP。盒装电池（标记为P3）表示Hoechst-不包括SP。增加50 μM（M）维拉帕米导致SP显著降低一个和B类.

卵巢癌患者腹水、接种OVCAR3小鼠腹水和A2780-CP细胞系的SP细胞平均百分比分别为0.4±0.05%、1.01±0.27%和0.45±0.05%。我们还从其他人类卵巢癌细胞系中筛选出SP细胞，包括A2780、HEYA8、OCC1和SKOV3。这些细胞系的百分比范围为0.1至2.4%（A2780:0.2%HEYA8:2.4%OCC1:0.1%和SKOV3:1.7%）。

OCT4和ABCG2/BCRP1免疫阳性细胞与OVCAR3细胞中的Hoechst-dim细胞共定位

在Hoechst-dim细胞中检测到OCT4-免疫阳性OVCAR3细胞染色，进一步表明干细胞表型(图2A-D). Hoechst-dim的OVCAR3细胞(图2B)是OCT4-b右(图2C)，如合并图像中所示(图2D). 拍摄了亮场图像(图2A)以确保标记的细胞看起来完好无损。

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(A–D)用OCT4和Hoechst染料33342对荷人卵巢癌细胞的小鼠腹水细胞进行染色。(E–H（E–H）)用ABCG2/BCRP1和Hoechst染料33342对来自携带人卵巢癌细胞的小鼠腹水的细胞进行共培养。(A、 E）亮场；(B、 F类)Hoechst-染料吸收（蓝色）；(C类)OCT4（青铜）；(G公司)ABCG2/BCRP1（青铜）；(D类)合并的图像B类和C类; 和(H（H）)合并的图像F类和G公司箭头指示对OCT4或ABCG2和Hoechst dim具有免疫反应性的细胞。条形=10 μ米(I–L型)ABCG2/BCRP1（红色荧光）和NANOG（绿色荧光）在来自小鼠腹水的人类卵巢癌细胞（OVCAR3）的副群中的免疫定位。(我)ABCG2/BCRP1；(J型)亮场；(K（K）)NANOG；(L（左）)合并我和J型.Bar=10 μ米(M（M）–P（P）)携带人类卵巢癌细胞的小鼠肿瘤组织中ABCG2/BCRP1（红色荧光）和NANOG（绿色荧光）的免疫定位。(M（M）)ABCG2/BCRP1；(N个)亮场；(O（运行）)NANOG；和(P（P）)合并M（M）和O（运行）箭头表示对OCT4或ABCG2呈免疫反应的细胞。条形=10 μ米(问–X（X）)SP（标准普尔）与非SP细胞凋亡在体外.SP的凋亡(问–T型)与非SP细胞(U型–X（X）)顺铂和/或维拉帕米治疗48小时后在体外(问，U型)控制；(R（右），V（V）)顺铂；(S公司，W公司)维拉帕米；和(T型，W公司)顺铂加维拉帕米。棕色细胞核表示凋亡细胞。比例尺=10 μm.注意SP细胞对顺铂有耐药性(R（右）)但维拉帕米可以逆转这种阻力(T型).

图2E-H表明ABCG2/BCRP1具有排除Hoechst染料的能力。ABCG2/BCRP1的OVCAR3细胞呈Hoechst-dim(图2F和G). ABCG2/BCRP1亮的OVCAR3细胞Hoechst-dim，如合并图像所示(图2H). 拍摄了亮场图像(图2E). 这些发现表明ABCG2/BCRP1与Hoechst-dim细胞共定位。

OVCAR3细胞亚群中干细胞标志物的免疫反应性

SP表型被认为是通过ABCG2/BCRP1转运盒蛋白的作用发生的(周等，2001年a;艾哈迈德·贝卡西姆等, 2006). 为了分析SP细胞是否同时表达干细胞标记物ABCG2/BCRP1和NANOG，我们检测了它们的免疫活性。我们发现SP细胞被ABCG2/BCRP1抗体强烈染色(图2I)SP细胞也与NANOG共染(图2K)，特别是在合并图像中(图2L). 亮场图像拍摄于图2J相反，SP细胞未被CD34（造血干细胞标记物）染色（数据未显示），表明制剂未被造血干细胞污染。SP细胞也未被CD44显著染色（数据未显示）。

癌症干细胞生态位

图2M–P显示了肿瘤组织中的癌干样细胞龛。这些细胞具有SP表型，并与ABCG2和NANOG共染，如图2I-L.图2M显示细胞被ABCG2/BCRP1抗体强烈染色，并且与NANOG共染色(图2O)，如合并图像中所示(图2P). 在中可以看到亮场图像图2N.

耐药与细胞凋亡

图2Q-T说明了48小时后A2780-CP培养的SP细胞的凋亡 顺铂和/或维拉帕米治疗h在体外顺铂治疗组SP细胞的凋亡率<20%，表明SP细胞对化疗耐药。然而，在顺铂加维拉帕米治疗组中，超过95%的SP细胞凋亡。对照组SP和维拉帕米处理的SP细胞均无明显凋亡细胞。棕色细胞核和碎片反映出细胞发生了凋亡。至少对10×150个微观区域进行了评分。

在一项平行研究中，我们还发现培养的非SP细胞在图2U–X顺铂治疗组和顺铂加异搏定治疗组的非SP细胞凋亡均超过总细胞数的90%。然而，对照组和维拉帕米治疗组没有显著变化。

基因表达

逆转录酶-PCR显示ABCG2/BCRP1和STELLAR mRNA在人类胚胎干细胞和OVCAR3细胞中都有表达(图3A). 由于耐药转运体ABCG2/BCRP1是SP细胞中的关键分子，因此对分选的SP细胞和非SP细胞中ABCG2/BCRP1 mRNA进行了分析。ABCG2/BCRP1在SP细胞中的表达比在非SP细胞中更广泛(图3B). 患者腹水中的人卵巢癌细胞中也发现ABCG2/BCRP1表达(图3C)在SP细胞中的表达比在非SP细胞中更广泛。

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(一个)人类卵巢癌（OVCAR3）和人类胚胎干细胞（hESCs）小鼠腹水中ABCG2和STELLAR的RT–PCR分析。(B类)人卵巢癌细胞（OVCAR3）非SP和SP中ABCG2的RT-PCR分析。(C类)人卵巢癌细胞（hOCC）非SP细胞和SP细胞中ABCG2的RT-PCR分析。

SP与肿瘤发生

图4A和B显示从卵巢癌患者腹水中获得并培养5天的非SP和SP活细胞。SP细胞(图4B)具有高密度染色质并进行广泛增殖(图4A)，而非SP(图4B)细胞不会显著增殖。

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非SP细胞(一个)与SP细胞(B类)卵巢癌患者腹水培养5天。非SP细胞(C类)和SP细胞(D类)将来自患者腹水的人卵巢癌细胞（500个细胞）移植到两个小鼠的肾胶囊下8周。非SP细胞(E类)和SP细胞(F类)将来自小鼠模型腹水的OVCAR3细胞（500个细胞）移植到两个小鼠的肾包膜下8周。非SP细胞(G公司，三只小鼠）和SP细胞(H（H）将来自A2780-CP（顺铂耐药）细胞的三只小鼠腹腔注射到六只小鼠（20 每只小鼠1000个细胞），持续8周。条形=10 μ米。

图4D显示肿瘤生长来自卵巢癌患者腹水中的SP细胞，并移植到肾包膜下。相反，肾包膜下移植的非SP细胞没有肿瘤发生(图4C).图4F图示了来自接种OVCAR3细胞并移植到肾包膜下的小鼠的SP细胞的肿瘤生长。相反，在类似移植的非SP细胞中不会发生肿瘤(图4E).

图4G和H显示小鼠接种来自腹腔注射的A2780-CP细胞系的非SP或SP细胞8周后的肿瘤负担（每组有三只代表性小鼠）。请注意，与非SP细胞接种小鼠相比，SP接种小鼠的广泛肿瘤发生。SP-小鼠的平均肿瘤负担（7.29±0.73）显著(P（P）<0.0001）大于非SP小鼠（0.44±0.12）（93.85%）。

小鼠模型的耐化学性

顺铂对裸鼠肿瘤生长的影响(n个=16）如所示图5.小鼠接种SP后2周开始治疗与来自A2780CP细胞的非SP。SP顺铂治疗小鼠的肿瘤负担（6.920±1.226 g） 与SP对照小鼠（8.997±1.297）相比，未显著降低（23.08% g） ，表明SP细胞对化疗具有耐药性。顺铂治疗小鼠的肿瘤负担（0.0325±0.018 g） 接种非SP细胞减少94.9%(P（P）<0.05）与未接种SP的对照小鼠相比（0.6426±0.23 g） ●●●●。关于SP小鼠和非SP小鼠之间的肿瘤负担差异，SP对照组小鼠的肿瘤负担高于非SP对照组（92.3%）。

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顺铂对SP腹腔注射小鼠肿瘤负荷的影响与从A2780-CP细胞分离的非SP。接种后8周开始治疗。治疗组包括对照组（溶媒）和单用顺铂。实验结束时（治疗3周），将小鼠处死。尸检时，肿瘤被切除并称重。SP-Con（对照）=未经治疗的旁观者；SP-CP=接受顺铂治疗的副作用人群；NSP-Con=未经治疗的非住院人群（对照组）；NSP-CP=接受顺铂治疗的非住院人群；*P（P）<0.05与NSP-CP；**P（P）<0.01与SP-CON.数据表示为平均值（bar±s.d.）。

讨论

在这项研究中，我们发现SP细胞在人类卵巢癌的肿瘤发生和耐药性中起着重要作用体内和在体外我们从患者腹水和接种人OVCAR3细胞系的裸鼠卵巢癌细胞以及其他人卵巢癌细胞系（包括A2780、A2780-CP、HEYA8、OCC1和SKOV3）中鉴定出一小部分SP。这与其他肿瘤类型的发现一致(帕特拉瓦拉等, 2005;绍特克等, 2006).

我们的研究表明卵巢癌细胞是异质性的。与非SP细胞相比，SP细胞具有高度增殖性；其他研究表明，SP异种移植小鼠比非SP异种移植物小鼠长出更多的肿瘤(千叶等, 2008;哈里斯等, 2008;施泰尼格尔等, 2008). SP细胞具有肿瘤干细胞的特征。它们具有惊人的增殖、分化和自我更新能力，使其能够在治疗后导致肿瘤形成和肿瘤再生(阿尔维等, 2003;近藤等，2004年b;Hirschmann-Jax公司等, 2005). 这一小部分人群可能与肿瘤发生有关。尽管目前卵巢癌的化疗以较高的初始反应率根除了大多数肿瘤细胞，但大多数晚期患者最终对化疗产生了耐药性。这就增加了一种可能性，即未能根除卵巢癌可能是因为未能治疗最终目标：肿瘤干细胞。我们的在体外和体内实验表明SP细胞对化疗有抵抗力。这一新发现表明，SP细胞有助于耐药，可能是癌症治疗的一个有吸引力的靶点。

我们的研究表明，卵巢癌SP细胞表达胚胎干细胞标记物NANOG、OCT4、STELLAR和ABCG2/BCRP1。OCT4和NANOG是胚胎干细胞中的转录因子(尼科尔斯等, 1998;钱伯斯等, 2003;三井等, 2003). 分化不良的肿瘤显示通常在胚胎干细胞中富集的基因过度表达(Ben-Porath公司等, 2008). NANOG和OCT4在低分化肿瘤中的过度表达比在高分化肿瘤中更显著(Ben-Porath公司等, 2008). 这些基因有助于在许多肿瘤中发现干细胞样表型(德沃夏克和汉普尔，2005年;Wong（王）等, 2008). STELLAR，也称为发育性多潜能相关-3（DPPA3），在人类胚胎细胞中表达。特别相关的是ABCG2/BCRP1的表达，这是一种钙敏感的细胞表面蛋白，不包括Hoechst染料，赋予对几种化疗药物的耐药性(迪埃斯特拉等，2002b年;艾哈迈德·贝卡西姆等, 2006). ABCG2/BCRP1基因首次从人类肿瘤细胞系中分离出来，该基因与耐药有关(多伊尔等, 1998;Allikmets公司等，1998年b;三宅一生等, 1999). ABCG2/BCRP1是Hoechst染料提取干细胞的重要标志物(周等，2001年a). 已经描述了各种类型的ABC转运蛋白，包括由多药耐药基因1（MDR1，p-糖蛋白）、多药耐药相关蛋白1（MRP1）以及ABCG2/BCRP1编码的蛋白。骨髓中mdr1a1b型–/–敲除小鼠后，获得了正常百分比的SP细胞，表明MDR1与Hoechst鉴定的SP细胞无关(内田等, 2002). MDRI和MRP1不是骨髓细胞SP表型的主要贡献者(沙伦贝格等, 2002). 在我们的研究中，MDR1（CD44）在SP细胞中不是一个显著的标志物。然而，一些研究表明ABCG2/BCRP1转运体的存在与各种细胞中的SP表型高度相关(Hirschmann-Jax公司等, 2005)并在承诺的祖细胞中下调(沙伦贝格等, 2002;周等, 2002). 因此，ABCG2/BCRP1的表达是阳性选择几种类型肿瘤干细胞的有用标记(基姆等, 2002;沙伦贝格等, 2002;帕特拉瓦拉等, 2005;艾哈迈德·贝卡西姆等, 2006). 在这项研究中，我们发现SP细胞比非SP细胞表达更多ABCG2，这支持了癌症干细胞高表达ABCG2的概念，正如在其他肿瘤类型中一样(帕特拉瓦拉等, 2005;雅培，2006;Lou和Dean，2007年;奥列姆普斯卡等, 2007). 维拉帕米，一种ABC转运体抑制剂(周等，2001年a)不会显著抑制MDRI转运体(古德尔，2002年)，阻止SP细胞排除Hoechst染料，表明ABCG2/BRCP1在卵巢癌细胞SP中的重要作用。我们的在体外对顺铂耐药卵巢癌细胞（A2780-CR）的研究表明，SP细胞对化疗耐药，维拉帕米逆转了这种耐药。结果表明，SP细胞抵抗化疗，至少部分原因是ABCG2的过度表达。

干细胞标记物NANOG和ABCG2/BCRP1在SP和非SP细胞中共定位，如我们的研究所示，卵巢癌组织中的特定单个细胞使我们有理由假设卵巢癌中存在癌干细胞样细胞龛。干细胞生态位位于一个特定的位置，在这个结构中，微环境维持干细胞的“干细胞”(Fuchs和Segre，2000年). 癌干样细胞生态位对于维持不对称分裂和干样特性可能很重要(岩崎和苏达，2009年). 肿瘤干细胞生态位和肿瘤微环境的相互作用可能导致肿瘤发生(豪等, 1998;施德利西特等, 1999).

总之，我们已经证明卵巢癌细胞是异质性的。SP细胞具有肿瘤干细胞的特征。它们都具有很高的致瘤性和抗药性。SP细胞中ABCG2/BCRP1表达的增加是化疗耐药性的原因。这些观察结果对未来针对卵巢癌干细胞的治疗策略具有潜在的重要意义。

致谢

我们感谢Renee Reijo Pera提供的有益建议和讨论。这项研究得到了Helene Jaffe卵巢癌基金会的部分资助。

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文章来自英国癌症杂志由以下人员提供英国癌症研究