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《公共科学图书馆·生物》。2012年2月；10（2）：e1001268。
2012年2月28日在线发布。 doi（操作界面）：10.1371/期刊.pbio.1001268
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p53调节细胞周期和microRNA促进人胚胎干细胞分化

阿比纳夫·贾因,1 肯德拉·奥尔顿,1 米歇琳娜·亚科维诺,2 伊丽莎白·马恩,2 罗伯特·米尔扎雷克,三 托马斯·兹瓦卡,三 迈克尔·基巴,2和米歇尔·克雷格·巴顿1,*
Connie J.Eaves，学术编辑
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摘要

多项研究表明，抑癌基因p53是去分化的屏障；这是否完全是由于抑制扩散，仍然是一个争论的主题。在这里，我们表明p53在促进人类胚胎干细胞（hESCs）分化和通过调节特定靶基因和microRNAs对抗自我更新方面发挥积极作用。与小鼠胚胎干细胞相比，人胚胎干细胞中的p53在细胞核中维持在低水平，尽管处于去乙酰化的非活性状态。作为对维甲酸的反应，CBP/p300在赖氨酸373处将p53乙酰化，从而导致E3-泛素连接酶HDM2和TRIM24分离。稳定的p53结合CDKN1A公司建立G1没有激活细胞死亡途径的细胞周期阶段。同时，p53激活miR-34a基因和miR-145型，进而抑制干细胞因子OCT4、KLF4、LIN28A和SOX2，防止向多能性倒退。诱导p53水平是一个关键步骤：RNA-干扰介导的p53敲除延迟分化，而p53负调控因子的缺失或p53异位表达则产生独立于维甲酸的hESCs自发分化。p53R175H是p53的一种突变形式，它的异位表达不能结合DNA或调节转录，也不能诱导分化。这些研究强调了p53调节网络在确定人类干细胞状态中的重要性。

作者摘要

有机体中的大多数细胞类型都是由胚胎干细胞（ESC）生成的，这些细胞能够无限次增殖，并有潜力产生该有机体的任何类型的细胞（这种能力称为多能性）。为了维护这些财产，ESC必须保持扩散状态，这是通过几个因素的合作实现的。在分化细胞中表达这些因子的组合可以产生ESC样品质；这些诱导的多能干细胞（iPSCs）可以像ESCs一样发挥功能。先前的研究表明，p53通过调节细胞周期和细胞死亡途径，在维持基因组完整性方面发挥着众所周知的作用，在诱导多能干细胞（iPSCs）的形成过程中，它也会阻碍成年细胞的重新编程；这是否完全是由于抑制扩散，仍然是一个争论的主题。在这里，我们发现p53在积极促进人类ESCs（hESCs）分化中发挥着重要作用。我们发现，在分化前，p53在人胚胎干细胞中的表达水平很低，受到两种负调控因子HDM2和TRIM24的抑制，这两种负调节因子触发了p53的降解。在诱导分化时，p53的赖氨酸373被乙酰化，这破坏了与负调控因子的现有相互作用，从而使p53稳定和活化。活性p53反过来促进细胞周期调节器p21的表达，减缓人胚胎干细胞周期；间隙中的电池（G1)细胞周期的阶段积累，阻止分裂。同时，p53激活特定的microRNA，miR-34a基因和miR-145型抑制多种干细胞因子的表达，防止分化细胞向多能性倒退。我们的结果强调了p53在确定人类干细胞状态中的一种新功能。

介绍

胚胎干细胞（ESC）具有无限的增殖潜能（自我更新）和生成和分化为大多数细胞类型的能力（多潜能）[1],[2]未分化ESC状态由转录因子网络（例如OCT4、SOX2、NANOG和KLF4）和表观遗传修饰物调节，这些转录因子促进ESC特异基因的表达并抑制分化[3]–[7]将OCT4、SOX2、NANOG和KLF4等转录因子外源性引入小鼠或人类成体细胞，通过将这些细胞重新编程为诱导多能干细胞（iPSCs）来诱导多能性，其功能和表型与ESCs相似[8],[9].

ESC自我更新和维持多潜能的能力与这些细胞保持增殖状态的能力有关。ESCs通过缩短细胞周期进行，导致细胞快速分裂[10]–[12]，特征为截断G1相，G的表达升高1-相关细胞周期蛋白、活性细胞周期蛋白依赖激酶（CDKs）和低水平抑制细胞周期蛋白p21、p27和p57[13]在向类胚体分化的过程中，小鼠ESCs（mESCs）在G1并表现出成年细胞中观察到的细胞周期从8–10小时延长到16小时以上[14]在诱导多能干细胞的产生过程中，多项研究表明，ARF/p53通路功能失调的细胞重新编程效率更高，细胞增殖增加，G1以及缺少细胞周期检查点[15]–[20]。其他研究确定了几个在细胞周期调控和ESC状态控制中发挥作用的小的非编码RNA[21]MicroRNAs（miRNAs）是长度为21–23个核苷酸的小的非编码RNA，通常在转录后水平上调节基因表达[22]特异性miRNAs调节自我更新、多潜能和mESC稳定性[23],[24]，其中一些在人类ESCs（hESCs）中差异表达[25],[26].

在这里，我们将两个调控臂，例如细胞周期进展和miRNA的转录，与hESCs分化调控中的肿瘤抑制因子p53联系起来。hESCs暴露于分化条件下表明乙酰化开关可以稳定p53蛋白。激活p53延长G1p21诱导细胞周期的时相，并增加miR-34a基因和miR-145型针对特定干细胞因子进行抑制。p53的这些功能是直接的，因为体外表达的p53结合这些染色质靶点，并在不添加维甲酸（RA）的情况下引起自发分化。p53的联合作用不仅拮抗自我更新和多能性，而且在促进人胚胎干细胞分化方面也有积极作用。

结果

p53蛋白在人胚胎干细胞分化过程中的诱导作用

通过添加RA和退出成纤维细胞生长因子（FGF）诱导hESCs（WA09细胞）的体外分化，标志着与多能性和自我更新相关的蛋白质和RNA水平稳步下降，例如NANOG、OCT4、SOX2和KLF4，以及内胚层标记物的表达增加GATA4协议,法新社，外胚层标记PAX6和神经祖细胞基因内斯汀(图1A–1C和第1部分)，如前所述[27]同时，p53蛋白水平显著但短暂增加(图1B和1C)没有增加TP53型转录(图1D). 作为对RA的反应，诱导的p53在分化细胞中有核定位(图1E、1F、和S1B级)可以通过p53高表达细胞中的均质性丧失和细胞核拉长来识别(图1E). 作为hESC与mESC不同的几个例子之一[28],[29]，p53在诱导前在hESCs中低水平表达并核富集(图1B、1E和S1C）。WA01 hESCs在RA介导的分化过程中也观察到p53蛋白水平的瞬时诱导(图S1D和S1E)以及BMP4介导的hESCs分化（数据未显示）。

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p53蛋白在hESCs分化过程中被诱导。

（A） qRT-PCR。在不含FGF的培养基中用RA处理5d（R0-R5）的人胚胎干细胞的RNA，进行qRT-PCR分析（数据以平均值±SEM表示）。（B和C）Western blot。用Western blotting分析从（A）中培养的人胚胎干细胞制备的裂解物（总细胞裂解物[TCL]），对（B）中的印迹进行定量（C）：绘制三个不同印迹的平均密度（*，第页<0.05). （D）TP53型qRT-PCR。按照（A）制备的RNA样品进行qRT-PCR分析（平均值±SEM）。（E） 免疫荧光。用p53和OCT4抗体对完全CM或RA治疗3d的hESCs进行染色，用DAPI对细胞核进行染色。比例尺为50µm。（F） p53核定位。用Western blotting分析培养的人胚胎干细胞的核提取物。（另请参见图S1.).

p53的应激激活主要归因于p53的翻译后修饰和蛋白质稳定性的增加[30]在RA-介导的hESCs分化过程中，p53在赖氨酸残基373（p53K373；图2A、2B未观察到DNA损伤相关的修饰，如p53S15或p53S46的磷酸化(图S2A). p53K373是组蛋白乙酰转移酶CBP/p300的已知底物[31]以及用CBP/p300抑制剂surin治疗分化hESCs[32]导致p53K373ac和p53在分化过程中失去稳定性(图2D). 在RA治疗的第1-3天，p53K373ac增加与SIRT1水平降低同时发生，这表明p53池通过SIRT1逃避脱乙酰化(图2C). 纳德+-如前所述，依赖性组蛋白去乙酰化酶SIRT1在hESCs分化过程中下调[33]; 然而，SIRT1蛋白水平和p53相互作用在hESCs分化后恢复（第4天，图2C)，因为p53和p53K373ac恢复到低水平(图1和​和2A）。2年). 添加SIRT1活性抑制剂烟酰胺[34]在RA治疗的第4天，维持p53K373ac(图2D). 这些结果表明，在hESCs分化过程中，主动乙酰化/去乙酰化开关调节p53。

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Lys373的乙酰化导致p53的稳定。

（A） p53乙酰化。通过调整从人胚胎干细胞制备的总细胞裂解物的数量，用p53K373ac抗体检测，等量的p53被免疫沉淀。（B） 免疫荧光。用抗p53K373ac和OCT4抗体对RA处理3d的人胚胎干细胞进行染色；细胞核用DAPI染色。（C） 协同免疫沉淀。用p53免疫沉淀RA-处理的人胚胎干细胞的细胞裂解物，然后进行Western blotting。（D） p53乙酰化。p53免疫沉淀自分化条件下培养的人胚胎干细胞，第2天用环己素或第4天用烟酰胺处理，并用p53K373ac抗体检测。（E） 免疫共沉淀。用HDM2或TRIM24抗体免疫沉淀分化人胚胎干细胞的细胞裂解液，并用Western blotting进行分析。（F） 内源性p53泛素化。分化条件下培养的人胚胎干细胞用MG132+RA或MG132+Adr处理；免疫沉淀内源性p53并检测泛素（顶面板）。用p53抗体重复相同的印迹，以显示相同的p53下拉（底部面板）。（另请参见图S2IP，免疫沉淀；Ub，泛素；WB、Western blot。

多能性hESCs的p53水平较低(图1和S1C系列)，类似于体细胞，其中p53水平由E3泛素连接酶、泛素修饰和蛋白酶体降解调节[35],[36].HDM2，删除后胚胎致死（如平方米)在小鼠中[37]和TRIM24，mESCs中鉴定的p53负调节蛋白[38]与多能性hESCs中的p53相关，但在RA添加后分离(图2E). 在蛋白酶体抑制剂MG132（第2和第4通道，图2F和S2B型)和乳酸菌素(图S2C). RA治疗后，泛素修饰的p53物种随着分化时间的延长而大量减少：相比之下（第5和第6车道，图2F,S2B型和S2C）。作为泛素修饰p53调控性缺失的阳性对照[39]，hESCs与DNA损伤剂阿霉素（Adr）平行处理(图2F、车道3和图S2B和S2C). 总之，乙酰化的获得和泛素化的丧失在人胚胎干细胞分化过程中暂时增加了p53的稳定性。

p53在人胚胎干细胞中蓄积的后果

mESCs的DNA损伤，其中p53在高水平表达，主要是细胞质，导致抑制NANOG公司以及自发分化为其他类型的细胞，这些细胞经历p53依赖性凋亡[28],[40],[41]然而，之前的一份报告显示，与mESCs不同，hESCs暴露于DNA损伤会导致p53依赖性细胞周期阻滞，而不是分化[42]为了评估p53在hESCs分化过程中的功能，我们对RA暴露时间点的hESCs细胞周期进行流式细胞术分析，并比较对照组和p53缺失的hESC(图3). 我们通过小干扰RNA（siRNA）池和改良的siRNA转染协议（参见材料和方法详细信息，平均转染效率为60%，RNA表达减少80%(图S3).

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p53在人胚胎干细胞中积聚的后果。

（A） 细胞周期分析。用非靶标（siControl）或p53特异性siRNA转染的hESCs(siTP53标准)或第21页(siCDKN1A)用PI染色，流式细胞仪分析DNA含量。结果显示了细胞周期中折叠变化的量化。（B） qRT-PCR。用RA处理4d或Adr处理6h的人胚胎干细胞RNA，使用人类特异性引物进行qRT-PCR分析CDKN1A公司.（C）ChIP。p53结合染色质从人胚胎干细胞免疫沉淀，p53富集于CDKN1A公司使用包含p53REs（*，第页<0.05). 代表p53RE位置的方案和用于ChIP-qRT-PCR的引物显示在顶部（星号表示基因的3′端）。（D） 对经RA或Adr处理的人胚胎干细胞进行裂解，并对细胞裂解产物进行γ-H2AX印迹。（E） 细胞凋亡检测。用Annexin V和PI对作为（D）处理的人胚胎干细胞进行染色，并用流式细胞术（mean±SEM）测定凋亡细胞百分比。（另请参见图S3和S4系列.).

流式细胞术显示60%的多能干细胞处于S期，约10%的干细胞处于G期1（时间 = 0），由于G的截断，与快速细胞周期（15–16小时）一致1 [13](图3A和第4页). 在分化过程中，人胚胎干细胞在G区的时间增加1随着时间的推移，RA治疗会减缓细胞周期：在第4天，G细胞的数量增加了3倍1(图3A). 人胚胎干细胞在G细胞中的积累1分化过程中继续；在RA治疗10天后，hESCs获得了与分化细胞（人包皮成纤维细胞）更相似的细胞周期特征，其中60%以上的细胞处于G1(图S4B). 当hESCs被siRNA耗尽p53并暴露于RA时，G1减弱，表明p53在该过程中起着不可或缺的作用(图3A和第4页). 人胚胎干细胞在G细胞中的积累1分化过程中与DNA损伤形成对比，DNA损伤导致G53依赖性阻滞2–暴露于Adr损伤诱导水平下的M转变和凋亡(图S4C–S4E系列).

细胞周期阻滞在G1期可能由p53下游基因靶点细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21/WAF1介导[43],[44]。我们观察到CDKN1A公司（第21页）(图3B)，依赖于p53(图4C)与WA09和WA01 hESCs分化过程中G1期hESCs的积累平行（）。p53直接调节p21的表达，因为染色质免疫沉淀（ChIP）分析显示RA诱导p53在p53反应元件（p53RE）末端富集CDKN1A公司(图3C). p21在RA-介导的hESC细胞周期改变中的重要性通过siRNA缺失CDKN1A公司和G中hESC积累的损失1(图3A). RA-介导的G伸长1hESCs分化阶段的标志是未修饰的视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白（非磷酸化RB）和上调的p21蛋白的特异性增加(图S4F). 以前的研究表明，RB在自我更新、循环的hESCs中是过磷酸化且不活跃的[11],[45].

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p53驱动hESCs分化。

（A） AP染色。转染非靶向（siControl）或p53特异性siRNA的人胚胎干细胞(siTP53标准)或第21页(siCDKN1A)用RA处理并对AP进行染色（蓝色菌落）。转染（B和C）hESCs并按（A）处理，用于Western blotting（B）和qRT-PCR（C）分析。对（B）中的斑点进行了量化，并绘制了三个不同斑点的平均密度（底部面板）（*，第页<0.05）（平均值±SEM）。（D） OCT4+SSEA4染色。转染siRNA的人胚胎干细胞经RA处理后，进行SSEA4和OCT4染色，并进行双流式细胞术分析。在每个实验中分析三种样品，并使用FACSDiva软件分析数据。与未经处理的siControl相比，OCT4阳性细胞的比例降低，用红色表示。（E）AP染色。转染人胚胎干细胞HDM2型或TRIM24阀内件siRNA经RA处理后进行AP染色。（F） 定量AP染色菌落。显示的数据是在三个单独的实验（在[A]和[E]中）中每个治疗组50个菌落的数据，得分为未分化、部分分化或完全分化的菌落，平均值±SEM。（G）OCT4+SSEA4染色和流式细胞术分析，如（D）中所示高密度平方米或TRIM24阀内件（H）细胞周期分析。转染人胚胎干细胞HDM2型或TRIM24阀内件siRNA用PI染色并进行细胞周期分析。（另请参见图S3和第5章.).

有趣的是，分化诱导的p53并没有激活基因的表达GADD45A公司和BAX基因与细胞凋亡有关(图S4G). 相反，人胚胎干细胞在暴露于适当水平的DNA损伤剂后发生细胞死亡(图3D和3E)，并显示p53RE上的p53富集和CDKN1A公司,MDM2型,BAX基因、和GADD45A公司在这些条件下(图S4G和S4H). 如Annexin V染色和γ-H2AX水平所示，RA诱导的p53和分化对凋亡的hESCs数量几乎没有影响(图3D和3E).

p53促进人胚胎干细胞分化

我们用来评估RA介导分化进展的一种方法是在每个时间点用碱性磷酸酶（AP）染色人胚胎干细胞培养物。如前所述[46]分化的标志是AP染色消失，出现细胞形态扁平的细胞(图4A). siRNA延迟RA介导的分化导致p53缺失(图4A和4B; 另请参见图5E)在RA治疗3天后，超过60%的人胚胎干细胞保持未分化状态（在图4F). 此外，与转染非靶向siRNA（siControl）的细胞相比，p53的siRNA、多能性标记物NANOG和OCT4保持表达，p21未被诱导(图4B和4C). 经OCT4和SSEA4染色的人胚胎干细胞流式细胞术分析证实了这些结果，结果表明，RA治疗后3d，缺乏p53的细胞OCT4染色没有减少，而siControl人胚胎干公司中OCT4阳性细胞仅为64%(图4D).

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p53的DNA结合活性是诱导人胚胎干细胞分化所必需的。

（A） 在CM+FGF中培养的tet诱导启动子控制下稳定表达p53WT和突变型p53（p53R175H和p53R175）的人胚胎干细胞用100 ng/ml的Dox处理2 d。用印迹法分析p53和OCT4蛋白水平。（B） AP染色。Dox处理（A）中的hESCs 2D（2D）或4D（4D），AP染色。（箭头表示分化细胞。）（C）qRT-PCR。用Dox治疗人胚胎干细胞1D（1D）或2D（2D）。用qRT-PCR分析RNA表达外源性TP53、CDKN1A、OCT4、和法新社(*,第页<0.05）（平均值±SEM）。（D） 细胞周期分析。用RA或Dox处理1d或2d的人胚胎干细胞，用PI染色，并进行细胞周期分析（平均值±SEM）。（E） 用siRNA转染稳定表达p53WT的hESCs，并用Dox处理2天。分析p53、p21和OCT4蛋白水平。用Dox处理表达p53WT的（F和G）hESCs 2 d或4 d，并裂解以分析蛋白质（F）或RNA（G）的各种分化标记；AFP和GATA4（内胚层）、Brachyury（中胚层）和PAX6（外胚层）。（H） p53乙酰化。用RA处理的人胚胎干细胞裂解液和用Dox处理的Dox诱导的p53WT进行p53K373ac和p53的印迹。（另请参见图S6.).

p53的上调在人胚胎干细胞分化过程中是短暂的，因为负调控因子HDM2和TRIM24的自动调节是由p53触发的(图S5). 我们瞬时转染了HDM2或TRIM24特异的siRNA池，并在每种情况下实现了约70%的基因表达水平降低(图S3和第5章). 未经治疗的人胚胎干细胞中siRNA对HDM2和TRIM24的消耗增加了p53蛋白水平(图S5A)p21 RNA和蛋白质增加，OCT4和NANOG表达降低(图S5B). HDM2或TRIM24的耗尽导致自发分化（约50%的分化菌落）(图4E和4F)以及G中的hESCs数量增加了4倍1相位(图4H). 流式细胞术显示OCT4阳性细胞显著减少(图4G)与siRNA介导的HDM2和TRIM24耗竭相关(图S3). hESCs的自发分化，p53和p21的表达增加，即使在正常维持多能性的细胞培养条件下，也会发生，并且没有RA治疗(图4E–4H和第5章). 这与p21缺失的hESCs形成鲜明对比，后者表现出明显的延迟分化(图4A、底部面板和图4F)，OCT4阳性染色细胞百分比无变化(图4D)G中的细胞没有增加1(图3A). 在这些条件下多能性标记的表达进一步支持了p53、p21和分化之间的联系(图S5B).

p53介导的分化调控需要DNA结合

我们在人胚胎干细胞中建立了一个系统，在该系统中，p53的表达以剂量依赖的方式进行控制，而不添加RA。在四环素（多西环素[Dox]）应答启动子的控制下，慢病毒构建物表达野生型或突变型p53，并选择稳定整合。通过流式细胞术分析，在缺乏Dox的情况下，野生型p53（p53WT）或在其DNA结合结构域内突变的p53（p53R175H和p53R175P）的表达受调节的细胞系对OCT4和SSEA4干细胞标志物均呈阳性(图S6A)并表现出Dox调节的p53表达(图5). 在没有RA的情况下，Dox诱导的p53WT表达导致OCT4表达缺失。相反，突变型p53的表达不能与DNA结合并调节p53靶基因表达（p53175H），即使p53R175H蛋白水平高于p53WT蛋白水平，也与OCT4降低无关(图5A). 有趣的是，Dox诱导突变型p53，p53R175P，已知其在小鼠模型中诱导细胞周期阻滞但不诱导凋亡[47],[48]导致OCT4表达缺失，尽管下降幅度小于p53WT诱导的显著下降(图5A和5C). 暴露于p53R175H和p53R175 P的人胚胎干细胞的反应之间的二分法支持p53在人类细胞分化过程中激活细胞周期阻滞而非凋亡的功能。

在没有RA的情况下，进一步分析由条件调控的p53驱动的分化，发现p53靶基因，CDKN1A公司和HDM2型，在Dox暴露的一段时间内被激活(图5C和S6B系列). 同时，多能性标记基因表达KLF4，毫微克、和华侨城4号随着接触Dox的时间的延长，剂量显著降低(图5C和S6C系列). Dox治疗导致外源性野生型和突变型p53 RNA的诱导增加了约4到5倍，内源性p53 RNA无显著变化TP53型水平(图5C和S6B系列). 分化以以下方面的增加为标志法新社表达p53WT或p53R175P但不表达p53R175 H的人胚胎干细胞中AP染色缺失(图5B和5C). p53WT和p53R175P的异位表达导致G1与RA治疗诱导相似；然而，p53R175H对人胚胎干细胞的细胞周期没有影响(图5D). hESCs中p53WT的诱导导致内胚层标记GATA4和AFP以及外胚层标记PAX6的表达(图5F和5G). 然而，这些细胞不表达中胚层标记物Brachyury(图5F和5G). 分化对p53是特异性的，因为在t吨 = 0，拯救OCT4蛋白表达(图5E). 同样，在siRNA-介导的过表达p53的人胚胎干细胞p21缺失后，OCT4蛋白水平被挽救，进一步证实p21是p53诱导的人胚胎细胞分化的介体，无论是由外源性p53WT还是RA诱导的(图5E).

有趣的是，Dox诱导的p53在K373没有乙酰化，当RA用于诱导同等水平的内源性p53和hESCs分化时，很容易检测到这一点(图2和​和5H）。5小时). 这一发现表明，p53的异位诱导绕过了K373乙酰化，后者在RA诱导的分化过程中促进了内源性p53从负调控蛋白中的释放(图2). 综上所述，这些结果支持了p53作为hESC分化的关键调节器的观点，能够在RA和RA治疗可能诱导的其他刺激物不存在的情况下发挥作用。突变型p53的表达强调了细胞周期调节器在这一过程中的作用，p53特异性调节导致G1在小鼠模型中阻止但不能调节细胞凋亡[47].

p53调节miR-34a基因和miR-145型促进hESCs分化

为了了解p53介导的hESCs分化的机制，我们对RA培养的hESC进行了高通量ChIP测序分析（未发表数据）。推测的p53靶点包括miRNAs；其中，我们重点关注miR-34a基因和miR-145型在p53介导的hESCs调节中可能具有重要意义。在体细胞中，miR-34a基因作用于p53控制的前馈回路。作为对应激刺激的反应，p53被激活并诱导miR-34a基因，进而抑制p53负调控因子SIRT1以增加p53激活[49],[50]、CyclinD1和CDK6支持细胞周期阻滞[51]SIRT1去乙酰化p53，降低p53结合DNA和调节基因表达的能力[52]，正如我们在多能性hESCs中所示(图2). 的规定miR-34a基因据我们所知，其在ESC中的下游目标此前尚未报告。相比之下miR-145型人胚胎干细胞的分化是已知的，其中miR-145型通过负向调节多能性基因水平发挥作用，OCT4、SOX2、和KLF4型 [53].miR-145型已知是体细胞中的p53靶点[54]; 然而，导致miR-145型人胚胎干细胞分化过程中的上调尚未明确。

针对RA治疗和hESCs分化，miR-34a基因和miR-145型以p53依赖的方式显著上调(图6A和6B)，一种诱导作用，也与DNA损伤剂Adr发生(图S7A). RA治疗导致p53在两种药物的预测p53RE处呈时间依赖性富集miR-34a基因和miR-145型(图6C)与p53的瞬时激活平行。有趣的是，p53在两个经鉴定的p53RE上富集miR-145型与DNA损伤相比，在分化过程中表现出不同的模式：p53在两个p53RE都发生了积聚，但在分化过程中近端p53RE（p53RE2）和DNA损伤后远端p53RE（p53RE1）的积聚更强(图6C和第7b页).介绍小分子抑制性寡核苷酸，以对抗靶向miRNAs（抗miRNA）的表达-miR-34a基因和反-miR-145型导致约80%的miRNA缺失(图S6C)，对干细胞因子的表达有特异性影响：抑制miR-34a基因导致OCT4、KLF4、LIN28A和SOX2蛋白的表达增加，在较小程度上SIRT1(图6E)，以及索2和SIRT1公司核糖核酸(图6D). 抑制miR-145型OCT4、SOX2和KLF4的诱导蛋白水平，以及索2和KLF4型(图6D和6E). 流式细胞术定量检测OCT4/SSEA4阳性细胞，结果表明，人胚胎干细胞在抑制激素分泌后可与RA分化miR-34a基因但不是在反-miR-145型(图6F). 两种miRNA的缺失显著延迟了hESCs的分化，因为在RA治疗后3天，约97%的hESCs仍保持OCT4阳性(图6F)表明这些miRNAs在分化过程中的重要性。

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p53调节miR-34a基因和miR-145型促进人胚胎干细胞分化。

（A和B）miRNA-TaqMan分析。利用人胚胎干细胞总RNA和人类特异探针分析miRNAsmiR-34a基因和miR-145型并归一化为RNU6B作为内部控制（*，第页<0.01). （B） 分析转染siRNA的人胚胎干细胞制备的总RNA表达miR-34a基因和miR-145型数据表示为平均值±SEM。（C）ChIP。p53结合染色质从人胚胎干细胞免疫沉淀，p53富集于miR-34a基因和miR-145型启动子通过qRT-PCR（*，第页<0.05). 代表p53RE位置的方案和用于ChIP-qRT-PCR的引物显示在顶部（星号表示基因的3′端）。数据以平均值±SEM表示。（D和E）抗miRNA测定。转染抗miRNA寡核苷酸的非特异性hESCs，miR-34a基因、和miR-145型进行qRT-PCR分析（D）和Western blotting（E）（平均值±SEM）。（F） OCT4+SSEA4染色。转染为（D）的hESCs经RA处理3d后，进行SSEA4和OCT4染色，并进行流式细胞术分析。与未经处理的对照组相比，OCT4阳性细胞分数的减少用红色表示。（G）miR-34a基因3′UTR中的目标站点KLF4型和LIN28A系列.D，狗；H、 人；M、 小鼠；R、 老鼠。miRNA靶位点中带下划线的核苷酸在突变的3′UTR结构中发生突变。（H） 荧光素酶分析。将含有野生型（WT）或突变型（Mut）3′UTR的荧光素酶质粒与miRNA前体一起转染HEK293细胞，用于打乱或miR-34a基因计算相对荧光素酶水平，Student’st吨测试用于比较数据集（*，第页<0.01). 误差线代表三个独立实验的标准偏差。（另请参见图S7.).

耗尽miR-145型也显著影响了G中hESCs的积累1RA治疗后(图S7D).miR-145型目标c-Myc[54]，已知其抑制p21[55]; 因此，miR-145型抑制多能性因子，并可能通过减少c-Myc公司在分化过程中间接激活p21。TargetScan的电子分析[56]，皮卡尔[57]，米兰达[58]和miRBase[59]基因的潜在调控miR-34a基因和miR-145型确定了几个对ESC生物学重要的基因(图S7E). 靶向多能性基因mir-145型已知的[53]; 此外，我们发现mir-34a型预测了3′UTR范围内的靶点KLF4型和LIN28A系列，跨物种保存(图6G). 调查是否KLF4型和林28a直接针对miR-34a基因，我们设计了荧光素酶报告子，这些报告子要么具有这些基因的野生型3′UTR，要么在预测的靶位点中突变了4 bp的3′UTRs。荧光素酶报告子与miRNA前体（pre-miRNAs）模拟物共转染，在HEK293细胞中加工成成熟miRNAs。一个与人类基因组没有同源性的加扰前体被用作对照。miRNA前体模拟物miR-34a基因（预-miR-34a基因)显著降低野生型的荧光素酶活性LIN28A系列报告者（～30%），与加扰前体控制（双尾学生t吨测试；图6H)并没有改变变异记者的活动(图6H). 镇压是特定于LIN28A系列，因为pre-miR-34a基因转染KLF4型记者。这些结果表明miR-34a基因直接针对LIN28A系列3英尺UTR。总之，p53激活的miRNAs减少主要干细胞因子的表达，以对抗hESCs的自我更新，并抑制SIRT1公司是p53的负调控因子。因此，p53介导的miRNAs调控增强并扩大了p53在hESCs分化过程中调节细胞周期的直接作用。

讨论

TP53型在超过一半的人类癌症中发生突变，并在体细胞中保持基因组稳定性，主要是作为控制细胞周期阻滞和凋亡的基因的应激反应转录调节器[60],[61]p53在细胞新陈代谢、体内平衡和发育中的功能尚不清楚，但越来越受到重视[62],[63]在成人干细胞中，p53负调控神经干细胞和造血干细胞的增殖和自我更新，以维持其静止状态[64],[65]一份报告首次提出p53在ESC调节中的作用，即p53直接抑制纳米单位：mESC[40]同样，p53在人胚胎干细胞凋亡和分化中的作用以前也有报道，但没有明确的机制被揭示[66],[67].

在这里，我们表明p53积极促进人胚胎干细胞的分化，并通过不同于直接调控细胞凋亡的机制来实现NANOG公司转录(图7). 与mESCs相反，人类p53在低浓度和脱乙酰状态下定位于hESCs细胞核。作为对分化信号的响应，SIRT1下调[33]，使p53在CBP/p300的靶点Lys373处乙酰化。p53乙酰化激活其作为转录因子的功能[68]，并从HDM2和TRIM24阀内件（此处显示）-介导的泛素化和降解[34]p53浓度及其调节的重要性通过显著的分化水平显示出来，分化水平是对siRNA-介导的MDM2型TRIM24或p53的异位表达。在这些情况下，分化发生在没有RA和正常维持干细胞的培养基中。

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描述p53在诱导人胚胎干细胞分化中作用的模型。

在多能性hESCs中，p53受HDM2和TRIM24负调控。分化通过CBP/p300诱导p53的Lys373乙酰化，p53K373ac然后通过结合p53RE激活转录CDKN1A公司（第21页），miR-34a基因、和miR-145型p21的诱导导致G的p53依赖性伸长1相，而诱导miR-34a基因支持G1伸长，通过靶向脱乙酰酶SIRT1阻止p53失活，并通过靶向对抗多能性LIN28A系列另一方面，miR-145型靶向OCT4、KLF4和SOX2并对抗多能性。因此，p53通过延长hESC G发挥累积的促分化作用1p21介导的相位与协同上调miR-34a基因和miR-145型抵消多能性。Ub，泛素。

RA介导的分化和DNA损伤条件下细胞周期谱的比较突出了p53在限制细胞分裂和启动分化或DNA修复方面分别发挥的不同作用。分化激活的p53与下游基因靶点的p53RE结合CDKN1A公司提升G1有效延长G的块1延长人胚胎干细胞的细胞周期，诱导的凋亡最少。p53的翻译后修饰模式和G中hESCs的积累1RA诱导的hESCs与Adr处理的hESC在G2–经典的p53介导的DNA损伤反应中的细胞周期M[60]我们发现，在分化过程中短暂激活的p53调节细胞周期，但不诱导显著的凋亡。虽然p53在激活细胞周期阻滞与凋亡之间的选择性仍不完全清楚[30]，我们对hESC分化的发现概括了先前在表达p53特异性点突变体的小鼠模型中显示的特异性[48],[69]并表明这些机制是高度保守的。当TP53型和/或CDKN1A公司AP染色、细胞周期分析和转染siRNAs的人胚胎干细胞中多能性标记物的表达表明，其水平降低。最近，Dox诱导的p21在人胚胎干细胞中的外源性表达被证明可以诱导细胞周期阻滞和大规模分化[70]，进一步支持诱导的p21水平和细胞周期控制是hESCs分化所必需的。

许多p53下游靶基因已经被广泛研究，特别是在转化细胞中，并且现在正在确定由p53调节的非编码RNA[71]最近有报道称，miRNAs在人胚胎干细胞分化或体细胞重编程过程中的作用[24],[53],[72]–[76]，在p53调节的不同多能性干细胞状态中显示miRNAs的特异性特征[77]已知的p53靶点，miR-34a基因，显示通过抑制培养细胞中的SIRT1来增加p53激活[49]但之前与人类胚胎干细胞没有关联。miR-145型被发现是多潜能因子的直接阻遏物，但在干细胞中没有被p53调节[53]在这里我们发现p53激活miR-34a基因和miR-145型RA-介导的hESCs分化过程中的表达。这些miRNAs的表达由p53RE处p53的染色质相互作用直接诱导，直接或间接影响控制多能性的靶转录物网络。此外，在编写这份手稿的过程中，Choi等人。[78]表明miR-34a基因为体细胞重新编程提供了障碍。这项研究为我们的发现提供了进一步的支持miR-34a基因拮抗hESCs的多能性，在干细胞生物学中具有促分化功能。我们发现了miR-145型在hESCs分化中起着更重要的作用miR-34a基因采取行动增强其功能。然而，由于DNA损伤诱导了miRNAsmiR-34a基因和miR-145型但不促进G中hESCs的积累1和hESCs的分化，如RA治疗或异位p53表达所示，很明显，单靠miRNAs不足以诱导hESCs分化。我们发现p53激活在hESCs分化过程中是短暂的；因此，抑制干细胞因子表达的miRNAs的激活扩大了p53激活的影响，并可能防止p53在分化至承诺状态期间恢复到正常低浓度时向多能性“倒退”。

最近TP53型−/−同源重组的hESCs显示p53的缺失促进了多能性，p53在小鼠和人类ESCs中的作用是保守的[79]然而，TP53型−/−在SCID小鼠的畸胎瘤形成过程中，hESCs对所有三个胚层都有贡献，可能是因为p53家族p63和p73结构相似的成员进行了补偿。小鼠中所有p63和p73亚型的缺失揭示了其在发育和分化中的关键作用[80],[81]p63和p73可以结合典型的p53 DNA结合位点，并在p53自身存在或不存在的情况下调节p53应答启动子的转录[82]–[84]补偿可能是不完整的，因为p53基因缺失的小鼠表现出一些发育异常，例如雌性小鼠出现高百分比的无脑畸形，并且特定基因在发育过程中表现出p53调节基因表达的改变[85]–[87].

在干细胞中建立与体细胞中更相似的拉长Gap相时间，以前被认为是接受分化信号的一项要求[11]我们的研究表明，在没有细胞应激或DNA损伤的情况下，p53在这个过程中是不可或缺的，并积极促进hESCs的分化。p53激活的集体效应延长了G1诱导多能性并拮抗多能性miR-34a基因和miR-145型(图7). 重要的是，p53在人胚胎干细胞分化过程中的激活是暂时的，允许后期的生长和分化，而p53诱导的miRNAs调节支持向前分化的基因网络。ESCs中的这些发现如何与成人和肿瘤干细胞相关，在那里它们可以被引导到治疗应用中，以重组细胞周期和调节miRNA网络，这是进一步研究的一个重要领域。

材料和方法

细胞培养

人胚胎干细胞（WA09和WA01）从国家干细胞库获得，并根据WiCell研究所的方案进行培养。简单地说，WA09细胞保存在hESC培养基中，培养基位于使用WiCell指令制备的经γ射线照射的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）上。我们所有的实验都使用了从第32代到第38代的人胚胎干细胞。hESC完整培养基由补充有20%敲除血清替代物的DMEM/F12、1 mM L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、4 ng/ml人FGF2（均来自Invitrogen）和0.1 mM 2-巯基乙醇（Sigma）组成。每天更换培养基，每4-6天用1 mg/ml胶原蛋白IV（Invitrogen）传代一次细胞。为了进行分化研究，在含有1µM RA的分化培养基（不含FGF的hESC培养基）中培养5d，每天更换新鲜培养基。在mTeSR1培养基（Stemcell Technologies）和MEF条件培养基（CM）中，hESCs也作为无饲料培养物保存在hESC合格的Matrigel（BD Biosciences）上。第32代人胚胎干细胞在mTeSR1培养基上培养5代。按照制造商的说明在Matrigel上培养人胚胎干细胞，并每天接受新鲜的mTeSR1培养基，每4-6天用1 mg/ml Dispase（Stemcell Technologies）对细胞进行传代。为了分化在mTeSR1上培养的hESCs，将1µM RA添加到自制MEF CM中（不添加FGF）。CM是在我们的设施中通过在完整的hESC培养基中培养24小时、每天收集、过滤并在−20°C下冷冻的γ辐照MEF而制备的。在使用前将FGF添加到CM中，最终浓度为10 ng/ml，以便在多功能条件下培养生长在Matrigel上的细胞。

RNA和miRNA敲除

人胚胎干细胞集落生长在Matrigel上的六孔培养板中。靶向人类的siRNATP53型,CDKN1A公司（第21页），HDM2型,TRIM24阀内件(表S1)和非靶向（对照）药物是从Dharmacon购买的，靶向人类的抗miRNA寡核苷酸miR-34a基因,miR-145型、和miR-非特异性从Applied Biosystems购买。根据制造商的方案，在5d内使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染试剂将75 nM siRNA或75 nM抗miRNA寡核苷酸转染到细胞中两次。第一次siRNA转染在细胞分裂后24 h进行，然后在转染后6 h更换培养基。首次siRNA转染36小时后，细胞在分化培养基（−FGF，+RA）中培养3天，然后收获以分析蛋白质、RNA、AP或细胞周期状态。在RA治疗的第2天开始时，用siRNA再次转染细胞，以保持敲除效率。为了确定转染效率，这些siRNA与同样从Dharmacon购买的siGLO Green（FAM）共同转染。转染后20小时的细胞要么通过显微镜观察，要么通过流式细胞仪分析来确定转染细胞的百分比。请参见图S3siRNA的转染率和敲除效率。在抗miRNA转染的情况下，在转染24小时后采集细胞进行RNA和miRNA分析，并在转染48小时后分析蛋白质水平。

与tet-Inducible整合生成hESCsTP53型

WA09细胞在上述mTeSR1培养基中培养。在每一代（Accumax、Millipore）细胞中，用1µM Y-27632（岩石抑制剂；Alexis）处理24小时。使用Fugene HD转染试剂（Roche）将pSAM2.gw载体、pCMV-VSV-G和pCMV-ΔR8.91转染293T细胞，产生慢病毒上清液，并在转染后48 h收集。WA09 rtTA细胞是由带有Lenti-rtTA的WA09细胞的自旋感染产生的[88]在37°C下以2500 rpm的转速，用聚brene（4µg/ml）培养90分钟，并在用mTeSR1替换培养基之前，在37℃下再培养2小时。随后用上述列出的pSAM2.gw质粒转导WA09 rtTA细胞。在低剂量瞬时诱导（添加0.05µg/ml Dox[Sigma]）8小时后，通过FACS分选（FACSAria II，BD Biosciences）对GFP阳性细胞进行富集（最终富集约80%）。分选前约16小时，去除Dox，用常规mTeSR1培养基培养细胞。对阳性细胞进行分类，将其置于新鲜的mTeSR1中，并进行二次/三次浓缩或检测。

质粒生成

pSam2.gw是通过取代FUGW的泛素C启动子产生的[89]带有第二代四环素反应元件[90]插入位于attR1和attR2序列（Invitrogen）两侧的Gateway阳性/阴性选择盒，并用pMSCV-IRES-GFP中的IRES-GFF序列替换GFP[91]然后将所有待表达的结构克隆到pENTR1a（Invitrogen）中，并通过Gateway重组转移到pSAM2.gw中。

RNA分离和实时PCR分析

按照制造商的规范，使用TRIzol试剂（Invitrogen）和miRVana分离试剂盒（Ambion）分离RNA。为了进行RNA分析，用DNase I处理500 ng总RNA，并按照前面所述合成cDNA[38]并用人类基因特异性引物扩增(表S2)采用Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）。靶向3′UTR的引物用于检测内源性TP53型，并使用针对编码区的引物检测Dox诱导的外源性TP53型.确定每个基因的平均阈值（Ct），并将其归一化为肌动蛋白mRNA水平作为内部标准化控制。根据制造商的说明，在Applied Biosystems PRISM 7900HT快速实时PCR系统中用TaqMan基因表达测定和TaqMan通用PCR Master Mix测定miRNA水平。简单地说，使用高容量cDNA档案试剂盒（Applied Biosystems）逆转录10 ng总RNA，然后使用TaqMan Fast Universal PCR Master Mix进行18个周期的预PCR和40个周期的实时PCR。对照对照RNU6探针对miRNA水平进行标准化。

西方印迹法

在RIPA缓冲液（50 mM Tris[pH8.0]、150 mM NaCl、1%NP-40、0.5%脱氧胆酸、0.1%SDS、1 mM PMSF和1 mM Na-Vanadate）中溶解人胚胎干细胞，并添加蛋白酶抑制剂混合物（钙生物化学）和磷酸酶抑制剂混合物I和II（西格玛）。蛋白质浓度由Bradford蛋白质检测试剂盒（Bio-Rad）估算。然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离50µg细胞裂解液，并转移至硝化纤维素膜。用5%的牛奶封闭膜，通过免疫印迹法分析蛋白水平，包括抗p53（DO1）、抗OCT4、抗SIRT1、抗SIN3A（Santa Cruz Biotechnology）、抗NANOG、抗KLF4（R&D Systems）、抗SOX2、抗p53K373ac、抗p 53S15ph、抗p 53 S46ph、抗p53 K320ac（Cell Signaling Technologies）、抗p21（BD Pharmingen）、，抗pRB（癌基因科学）、抗HDM2（钙生物化学）、抗TRIM24（Novus Biologicals）、抗γ-H2AX（Trevigen）和抗肌动蛋白（GeneTex Biotechnology），然后是相应的HRP标记的二级抗体（GE Healthcare）。

共免疫沉淀分析

在灭活的MEF饲养器上生长的人胚胎干细胞在完整的人胚胎细胞培养基中培养，或在分化培养基中用RA处理5d，然后收集细胞并在RIPA缓冲液中溶解。使用0.5mg细胞裂解物与一级抗体进行免疫沉淀。将提取物与2.5µg抗体在4°C下孵育过夜并摇晃。添加40微升洗涤过的蛋白A珠悬浮液（GE Healthcare），并在4°C下摇晃使提取物再培养1小时。免疫复合物用RIPA缓冲液洗涤两次，用1×SDS样品染料煮沸，在10%SDS-PAGE凝胶上溶解，然后用相应抗体进行免疫印迹。

亚细胞分离

hESC在100mm组织培养板上，在完全hESC培养基或分化培养基（−FGF，+RA）中生长4天。处理结束时，用冰冷的PBS洗涤细胞两次，在PBS中刮除，并以500rpm离心5分钟。使用核提取试剂盒（活性基序）进行细胞的生化分级遵循制造商的协议。简单地说，将细胞颗粒重新悬浮在补充有完整蛋白酶抑制剂混合物（钙生物化学）的1×低渗缓冲液（细胞质缓冲液）中，在4°C下培养15分钟，在洗涤剂存在下旋转，并短暂离心。将上清液（细胞质部分）收集到预冷的微型离心管中。用细胞质缓冲液清洗核颗粒两次，然后在补充有1mm二硫苏糖醇和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中再次悬浮。将悬浮液在4°C的摇摆平台上孵育30分钟，短暂旋涡并在14000下离心10分钟克并收集上清液（核部分）。使用蛋白质分析试剂（Bio-Rad）测定蛋白质浓度。50µg细胞组分在10%SDS-PAGE凝胶上溶解，进行Western blotted，并用抗p53、抗OCT4和抗NANOG抗体进行探测。为了确认亚细胞分离的纯度，用细胞质特异性抗LDH抗体（Chemicon）和细胞核特异性抗TBP抗体（Santa Cruz Biotechnology）对提取物进行免疫印迹。

免疫染色

hESC集落在涂有Matrigel的盖玻片上在mTeSR1或MEF完全CM（CM+FGF，10ng/ml）或CM分化培养基（+RA，1µM）中生长3天。细胞在室温（RT）下用4%多聚甲醛在水中固定15分钟。用PBS清洗细胞三次，并在RT时用封闭缓冲液（PBS中的10%正常山羊血清）封闭细胞2小时，在RT时与抗p53和抗OCT4抗体（圣克鲁斯生物技术）孵育过夜，并在PBST（PBS+Tween20）中清洗两次。然后将细胞与二级抗体（Alexa-Fluro goat anti-rabbit 488 for OCT4和Alexa-Furo goat anti-mouse 546 for p53；Molecular Probes）在RT黑暗中孵育45分钟，然后用PBST冲洗两次。然后使用Slowfade Antifade Kit（分子探针）中的防褪色安装试剂将带有细胞的盖玻片安装在玻璃载玻片上。用奥林巴斯共焦显微镜对细胞进行检查和显微照相。

炸薯条

在灭活MEF饲养器上生长的人胚胎干细胞在完整的人胚胎细胞培养基中培养，或在分化培养基中用RA处理4天，然后收集、洗涤PBS，并在1%甲醛中在RT中交联10分钟。在甘氨酸和PBS洗涤后，使用裂解缓冲液（5 mM HEPES[pH8.0]、85 mM KCl、0.5%NP40）裂解细胞添加蛋白酶抑制剂（钙生物化学）。去除细胞质提取物后，在核溶解缓冲液（50 mM Tris-HCl[pH7.5]，10 mM EDTA，1%SDS）和蛋白酶抑制剂中溶解剩余的细胞颗粒。用玻璃珠（Sigma）在冰上对裂解液进行10次10秒脉冲超声处理，以获得平均长度小于500 bp的DNA片段。离心后，用40µl蛋白A珠（GE Healthcare）和IgG预吸收上清液2小时，然后用5µg p53抗体（Santa Cruz Biotechnology）或对照IgG（Millipore）在4°C下培养过夜。将免疫复合物收集在蛋白A珠上并清洗，洗脱结合DNA并在65°C下反向交联过夜。通过SYBR定量实时PCR（qRT-PCR），使用包含相应基因上p53RE的引物检测感兴趣的DNA区域（参见表S3用于ChIP-qRT-PCR的引物序列）。

p53乙酰化分析

在灭活的MEF饲养器上生长的人胚胎干细胞在完整的人胚胎细胞培养基中培养，或在分化培养基中用RA处理5d，然后收集细胞并在RIPA缓冲液中溶解。通过改变每个治疗组的总裂解物的数量来降低等量的p53，并用p53K373ac抗体进行检测。为了分析CBP/p300对RA-介导的p53乙酰化的影响，用RA处理人胚胎干细胞2 d，并在第2天收获前24 h添加25µM环糊精（Sigma）[32]类似地，为了抑制SIRT1对p53的脱乙酰酶活性，在收获经RA处理的细胞4天之前24小时添加5 mM烟酰胺（Sigma）[34].

p53泛素化检测

用蛋白酶体抑制剂MG132（Calbiochem）或乳酸菌素（Calbiochem）处理人胚胎干细胞6小时，然后在补充有10 mM碘乙酰胺（GE Healthcare）和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中进行裂解。使用p53（DO1）抗体从1 mg蛋白裂解物中免疫沉淀内源性p53，并使用抗泛素抗体（Sigma）进行免疫印迹。用p53重复印迹，以确认p53的下拉作用相等。

碱性磷酸酶染色

将人胚胎干细胞集落固定在2%甲醛（Sigma）中，并按照制造商的说明用矢量蓝碱性磷酸酶底物试剂盒I（矢量实验室）染色。自我更新的菌落对AP染色阳性，但分化的菌落染色较少或对AP染色阴性。

细胞周期分析和凋亡检测

对于细胞周期分析，1−5×105将每个样品中的细胞进行胰蛋白酶化，制成单细胞悬浮液，用PBS洗涤，并用95%乙醇（Sigma）固定。然后用RNaseA处理细胞，并按照制造商的说明用碘化丙啶（PI）（Calbiochem）染色。在Epics XL流式细胞仪（Coulter）上分析了20000例事件，并通过ModFit LT程序分析了细胞周期分布。对于凋亡检测，按照制造商的说明（BD Pharmingen），用Annexin V–FITC和PI对细胞进行双重染色。使用Epics XL流式细胞仪分析20000例事件，并使用System II软件（Coulter）测定细胞凋亡百分比。

人胚胎干细胞标志物的FACS分析

人胚胎干细胞生长在六孔板中，并提交给德克萨斯州休斯顿贝勒医学院的人类胚胎干细胞核心，进行FACS染色和质量控制。简单地说，用胰蛋白酶/EDTA（Invitrogen）从培养皿中取出细胞。用MEF培养基（含有10%FBS的DMEM[Hyclone]）中和胰蛋白酶，并在250℃下离心5分钟造粒克细胞重新悬浮在FACS缓冲液（含有2%FBS和0.1%叠氮化钠的PBS）中，并用与Alexa-488（Invitrogen）偶联的SSEA4（R&D系统）探测表面抗原。然后在RT下用2%多聚甲醛固定细胞30分钟，并用0.1%皂苷（Sigma）在含有0.1%BSA（Sigma-）的PBS中渗透30分钟。用FACS缓冲液清洗细胞，并用与R结合的OCT4抗体在RT下探测30分钟-藻红蛋白（均来自BD Biosciences）作为细胞内蛋白。使用LSRII设备（BD Biosciences）对样品进行分析。确定感兴趣的细胞群，并使用正向和侧向散射参数排除死亡细胞。每个样本采集30000个事件。使用FACSDiva软件（版本4.1.2；BD Biosciences）对数据进行分析。在每次实验中分析三种样品。

荧光素酶报告质粒和双荧光素素酶测定

引物对被设计用来扩增约200-300个区域 每个预测值周围的bpmiR-34a基因目标站点位于KLF4型和LIN28A系列(表S4). 在HindIII和SpeI位点的pMir-Report载体（Ambion）中克隆扩增子。在miR-34a基因使用突变引物进行定点突变（Stratagene），对3′UTR中的靶位点进行突变。在3′UTR分析中，10×104用100 ng UTR报告基因（pMir-Report）、10 ng转染对照Renilla载体（phRLTK，Promega）和20 nM预处理基因转染293个细胞-miR-34a基因前体分子或用3µl Lipofectamine 2000打乱的对照miRNA（Ambion）。转染后24小时，细胞在1×被动溶出缓冲液中溶解，并使用双荧光素酶测定法（Promega）测量报告活性。在三个独立的实验中对每种分析进行了三次测试。

支持信息

图S1

维甲酸诱导人胚胎干细胞分化。（A） 用RA处理WA09（H9）hESCs 5 d，并使用针对不同分化标记的特异性引物进行qRT-PCR分析：GATA4协议和法新社（内胚层），Brachyury公司（中胚层），和PAX6和内斯汀（外胚层）。（B） p53核定位。用Western blotting分析从培养的人胚胎干细胞中制备的细胞液和核提取物，对印迹进行定量，并将三种不同印迹的平均密度绘制为核蛋白水平的相对变化。（C） 用抗p53（FL393）抗体检测mESCs、MEF和hESCs制备的总细胞裂解物。（D和E）WA01（H1）hESCs在自我更新条件下培养（R0）或用RA处理5天（R1-R5），在指定的时间点收获细胞，分析p53蛋白（D），并通过qRT-PCR检测基因表达（E）。

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图S2

p53在分化和DNA损伤过程中被激活。（A） 在自我更新条件（R0）下培养人胚胎干细胞，或用RA处理1或2天，或用DNA损伤剂Adr（250 ng/ml），或用足叶乙甙和曲古菌素A处理6小时。用抗p53、p53K373ac、p53K120ac、p 53S15ph、p53S45ph和肌动蛋白抗体检测总细胞裂解物。（星号表示非特定波段）。（B） 用RA（0-3天）或Adr（6小时）+MG132处理的人胚胎干细胞的细胞裂解物用抗泛素抗体免疫沉淀，并探测p53以检测泛素化p53。（C） 用抗p53抗体免疫沉淀RA或Adr（6 h）+乳酸菌素处理的人胚胎干细胞的细胞裂解物，并检测抗泛素以检测泛素化的p53。

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图S3

人胚胎干细胞中siRNA的转染和敲除效率。（A和B）siRNA的转染效率。hESCs与基因特异性siRNA和siGLO-Green（FAM）的SMART池共同转染，24小时后通过显微镜观察（A）或流式细胞术分析，以确定转染siRNA的细胞百分比。（C和D）siRNA的敲除效率。转染两次siRNA的人胚胎干细胞TP53、HDM2、TRIM24、，和CDKN1A公司采集以分析RNA（C）和蛋白质（D）水平。第二次转染后36h，我们可以达到70%到80%的敲除效率。另请参见图S4.

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图S4

p53在人胚胎干细胞中积聚的后果。转染siRNA并用RA（A）或Adr处理6 h（+Adr）（C）的（A–C）hESCs用PI染色并进行流式细胞术分析。（B） 对RA处理不同时间的人胚胎干细胞进行细胞周期分析。（D和E）hESCs暴露于递增剂量的Adr后，进行Western blot分析以检测p53和γ-H2AX（D），Annexin V染色后进行流式细胞术分析以确定凋亡细胞（E）。250 ng/ml浓度的Adr对hESCs没有毒性，因为只有～20%的hESCs呈Annexin V阳性(图3E和3F)而凋亡反应在1µg/ml时达到峰值，p53稳定，γ-H2AX水平增加，Annexin V染色显示凋亡细胞积聚。（F） 用Adr或足叶乙甙处理6h的人胚胎干细胞制备的细胞裂解物用抗RB抗体进行印迹（左面板）。培养和处理的人胚胎干细胞图1用Western blotting分析细胞总裂解物（右侧）。（G） qRT-PCR检测。在分化条件下培养的人胚胎干细胞（+RA 0–4 d）或用Adr处理6 h后，使用人类特异性引物进行qRT-PCR分析GADD45A袋，并规范化为肌动蛋白.（H）ChIP。经Adr处理的人胚胎干细胞免疫沉淀p53结合染色质，p53富集于CDKN1A、HDM2、BAX、和GADD45A公司使用包含p53RE的引物进行qRT-PCR分析，并绘制为与输入相比p53富集倍数。

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图S5

p53调节人胚胎干细胞的分化。（A） 蛋白质印迹。在自我更新条件下培养的人胚胎干细胞转染非靶向（siControl）或特异于HDM2（siHDM2）、TRIM24（siTRIM24），或CDKN1（siCDKN1）将转染后36 h的细胞在完全培养基（R0）或分化培养基中培养3 d（R1、R2和R3）。按指示分析总细胞裂解物。蛋白质印迹被定量，三个不同印迹的平均密度被绘制成蛋白质水平的倍数变化。（B） RNA分析。收集（A）中处理的细胞，并通过qRT-PCR进行基因表达分析。

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图S6

p53的DNA结合活性是诱导人胚胎干细胞分化所必需的。（A） 稳定表达tet-inducible p53的人胚胎干细胞的质量控制。将WA09 p53WT、WA09 p53 R175P和WA09 p52 R175H细胞固定在甲醛中，并用ESC表面标记物SSEA4和ESC内部标记物OCT4染色。使用LSRII设备（BD Biosciences）对人胚胎干细胞进行双流式细胞术分析。确定感兴趣的细胞群，并使用正向和侧向散射参数排除死亡细胞。每个样本采集30000个事件。使用FACSDiva软件（4.1.2版）对数据进行分析。在每次实验中分析三种样品。（B和C）qRT-PCR分析。从表达外源性Dox-诱导型p53的细胞制备的RNA分析内源性p53的mRNA水平TP53型（左侧面板），HDM2型,NANOG公司和，KLF4型通过qRT-PCR分析。数据表示为平均值±平均值标准误差（SEM）。

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图S7

p53转录调节hESCs中的miRNAs。（A） miRNA-TaqMan分析。将在自我更新条件下培养的WA09细胞（对照）或用Adr处理的WA09进行裂解以制备RNA，用人类特异性探针进行TaqMan qRT-PCR分析miR-34a基因和miR-145型并归一化为RNU6B。（B） ChIP公司。用Adr处理的WA09细胞的p53抗体免疫沉淀染色质miR-34a基因和miR-145型使用包含p53RE的引物的启动子。扩增非特异性启动子区域的引物被用作阴性对照。（C） miRNAs的敲除效率。转染抗miRNA的人胚胎干细胞miR-34a基因和miR-145型通过TaqMan分析（A）中的miRNA水平。（D） 细胞周期分析。转染抗-miR-NS型（控制）或反-miR-145型寡核苷酸和RA处理后用PI染色并进行流式细胞术分析。（E） 的目标列表miR-34a基因和miR-145型对通过TargetScan、PicTar、miRanda和miRBase浏览器识别的p53和hESC生物学意义重大（星号表示已验证的目标）。

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表S1

siGENOME SMARTpool（Dharmacon）siRNA的序列信息。

（文档）

表S2

用于qRT-PCR基因表达分析的寡核苷酸序列。

（文件）

表S3

p53 ChIP后qRT-PCR分析的寡核苷酸序列。

（文件）

表S4

用于在pMir-Report荧光素酶载体中克隆3′UTR的寡核苷酸序列。

（文件）

致谢

我们感谢德克萨斯州休斯顿贝勒医学院的人类胚胎干细胞核心设施提供的材料，感谢辛辛那提儿童研究基金会生物医学信息学部门的A.Jegga在miRNA靶点鉴定方面的帮助，以及L.Adam和C.Das在免疫染色和共聚焦显微镜方面的帮助。我们感谢S.Stratton和我们实验室的成员对这项工作的帮助。

缩写

Adr公司阿霉素
AP公司碱性磷酸酶
炸薯条染色质免疫沉淀
Dox公司强力霉素
厘米条件培养基
电子稳定控制系统胚胎干细胞
FGF公司成纤维细胞生长因子
人类电子稳定控制系统人类胚胎干细胞
iPSC公司诱导多能干细胞
MEF公司小鼠胚胎成纤维细胞
移动电子稳定控制系统小鼠胚胎干细胞
微小RNA微小RNA
圆周率碘化丙锭
第53页p53反应元件
第53页野生型p53
定量RT-PCR定量实时PCR
无线电高度表维甲酸
RT公司室温
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
扫描电镜平均值标准误差
小干扰RNA小干扰RNA

脚注

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

这项工作得到了NIH GM081627对MCB、TPZ和MK的资助，以及NCI癌症中心对德克萨斯大学MD Anderson癌症中心的资助。AKJ是得克萨斯大学MD安德森癌症中心Odyssey项目和劳拉和约翰·阿诺德基金会支持的Odyssei研究员。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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