p53 regulates hematopoietic stem cell quiescence

doi:10.1016/j.stem.2008.11.006

.2009年1月9日；4(1):37-48.

doi:10.1016/j.stem.2008.11.006。

p53调节造血干细胞静止

刘燕（Yan Liu）¹, 香农·E·埃尔夫, 宫田康彦, 佐田五郎, 刘玉辉, 黄刚（Gang Huang）, 西尔瓦娜·迪·詹多梅尼科, 詹妮弗·M·李, 安东尼·德布拉西奥, 西尔维娅·梅内德斯, 杰克·安提宾, 鲍里斯·雷瓦, 安德鲁·科夫, 斯蒂芬·尼默

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p53调节造血干细胞静止

刘燕（Yan Liu）等。细胞干细胞. 2009.

.2009年1月9日；4(1):37-48.

doi:10.1016/j.stem.2008.11.006。

作者

刘燕（Yan Liu）¹, 香农·E·埃尔夫, 宫田康彦, 佐岛五郎, 刘玉辉, 黄刚（Gang Huang）, 西尔瓦娜·迪·詹多梅尼科, 詹妮弗·M·李, 安东尼·德布拉西奥, 西尔维娅·梅内德斯, 杰克·安提宾, 鲍里斯·雷瓦, 安德鲁·科夫, 斯蒂芬·尼默

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¹美国纽约州纽约市斯隆-凯特琳纪念癌症中心斯隆-卡特琳研究所分子药理学和化学项目，邮编：10021。

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摘要

众所周知，p53蛋白在细胞对DNA损伤反应中的重要性，但其在稳态造血过程中的功能尚未确定。我们已经定义了p53在调节造血干细胞静止中的关键作用，特别是在促进缺乏MEF/ELF4转录因子的造血干细胞增强静止中。对从野生型和p53阴性小鼠分离的HSC进行转录谱分析，确定Gfi-1和Nectin为p53靶基因，并使用慢病毒载体上调或下调这些基因的表达，我们显示了它们在调节HSC静止中的重要性。确定p53（及其靶基因）在控制HSC进入细胞周期中的作用可能会导致能够消除静止癌（干细胞）细胞的治疗策略。

PubMed免责声明

数字

**图1。p53维持HSC静止**
（A）采用多色流式细胞术测定造血干/祖细胞（Lin⁻Sca-1型⁺)细胞周期G0期[定义为含有2n DNA（G0/G1）的低Pyronin Y含量细胞]。野生型和*第53页* ^−/−小鼠用吡喃Y和Hoechst 33342染色。左侧显示了一个具有代表性的实验。右边的图表显示了G0细胞的平均百分比（±SD）（p<0.005，n=9）。（B） ●●●●。侧群（SP）细胞（CD34⁻LSK）从野生型和*第53页* ^−/−通过Hoechst 33342染色和使用蓝色和红色滤镜对小鼠进行鉴定。右边的条形图表示存在SP细胞的平均百分比（±SD）（p<0.003，n=7）。（C） CD34的细胞周期分析⁻LSK细胞用Hoechst 33342和Ki67染色并用FACS分析。所示数据为平均值±SD（p<0.0001，n=9）。（D） CD34-LSK细胞的增殖通过体内BrdU掺入法在48小时内进行测量。更广泛的*第53页* ^−/−可见CD34-LSK细胞（野生型CD34-LSK细胞为60%对30%；p<0.009，n=5）。

**图2。增加HSC频率*第53页* ^−/− *百万电子伏特* ^−/−老鼠**
（A） LSK细胞频率增加*第53页* ^−/− *墨西哥湾* ^−/−老鼠。林−Sca-1⁺c-套件⁺流式细胞术检测细胞数。数据显示骨髓中LSK细胞的平均百分比（±SD）（p<0.0002，n=13）。（B）骨髓中LT-HSC频率增加*第53页* ^−/− *墨西哥湾* ^−/−老鼠。LT-HSC的频率（CD150⁺Sca-1型⁺c-套件⁺CD41-CD48-Lin-）通过流式细胞术分析SLAM细胞表面标记物来确定。*第53页* ^−/−,*墨西哥湾* ^−/−和*第53页* ^−/− *墨西哥湾* ^−/−小鼠CD150的频率均显著增加⁺CD41-CD48-LSK细胞，对应于LT-HSC。所示数据为LT-HSC的平均百分比（±SD）（n=10）。（C）野生型骨髓细胞，*第53页* ^−/−,*墨西哥湾* ^−/−和*第53页* ^−/− *墨西哥湾* ^−/−小鼠用干细胞和祖细胞表面标记物染色，并用PI和Annexin-V染色评估细胞凋亡。所示数据为Annexin-V的平均百分比（±SD）⁺/圆周率⁻LSK细胞（方差分析P=0.2；即，统计上不显著，n=5）。

**图3。Mef阴性小鼠HSC自我更新能力的增加并不依赖于p53**
（A）在第5周通过菌落计分法评估骨髓鹅卵石区域形成细胞的稳态水平。所示数据为平均值（±SD）（n=3）。（B） LSK细胞（1×10^三)从野生型，*第53页* ^−/−,*百万电子伏特* ^−/−和*第53页* ^−/− *墨西哥湾* ^−/−小鼠在MS5基质细胞上培养4周，并在LTC-IC分析中测试集落形成。所示数据为形成菌落的平均数（±SD）（n=3）。（C）连续的再植研究。利用野生型BMMC，通过甲纤维素培养对髓系祖细胞进行定量，*第53页* ^−/−,*百万电子伏特* ^−/−和*第53页* ^−/− *墨西哥湾* ^−/−老鼠。甲基纤维素培养物每周连续更换4周。所示平均值（±SD）（n=3）。（D）用1×10^三野生型LSK细胞，*第53页* ^−/−,*墨西哥湾* ^−/−和p53^−/− *墨西哥湾* ^−/−小鼠（CD45.2）加5×10⁵竞争性再填充分析中的竞争细胞（CD45.1）（如实验程序所述）。右侧条形图显示移植后16周（n=4）外周血中供体来源（CD45.2）细胞的平均百分比（±SD）。（E） LTC-IC分析用于枚举原始造血干细胞，使用LSK细胞的有限稀释液，LSK细胞首先在MS5基质上培养5周，然后在甲基纤维素上培养以供读取。图中显示了缺少LTC-IC的井数与每个井的LSK细胞数。

**图4。p53对维持MEF阴性小鼠造血干细胞静止至关重要**
（A）采用多色流式细胞术测定Lin的百分比⁻Sca-1型⁺处于细胞周期G0期的细胞[定义为含有2n DNA（G0/G1）的低Pyronin Y含量细胞]。所示数据为平均百分比（±SD）（n=6）。（B） CD34内SP细胞的分析⁻LSK细胞。CD34型⁻来自野生型的LSK细胞，*第53页* ^−/−,*墨西哥湾* ^−/−和*第53页* ^−/− *墨西哥湾* ^−/−检测小鼠SP细胞的比例。所示数据为SP细胞的平均百分比（±SD）（n=3）。（C）野生型骨髓细胞，*第53页* ^−/−,*墨西哥湾* ^−/−和*第53页* ^−/− *墨西哥湾* ^−/−在接受全身照射（TBI，6.5Gy）12小时后获得的小鼠通过PI和Annexin-V染色评估细胞凋亡。所示数据为膜联蛋白-V的平均百分比（±SD）⁺/PI LSK细胞（n=3）。（D）照射后HSC中γ-H2AX焦点的产生。野生型LSK细胞，*第53页* ^−/−,*墨西哥湾* ^−/−和*第53页* ^−/− *墨西哥湾* ^−/−小鼠在照射（200拉德）后3小时对γ-H2AX进行免疫染色（并对DAPI进行染色以鉴定细胞核）。底部的条形图显示显示0–2、3–5或>5病灶的LSK细胞百分比（每个基因型中计算200个细胞）。

**图5。MEF基因敲除小鼠HSC静止增强不依赖p21**
（A） p21和p27表达增加*墨西哥湾* ^−/−LSK细胞。野生型和非野生型LSK细胞中p21、p27和p16的相对mRNA表达水平*墨西哥湾* ^−/−通过qPCR对小鼠进行评估，并将其归一化为HPRT表达。所示数据为转录水平与HPRT的平均比率（±SD）（n=2）。（B）采用多色流式细胞术测定细胞周期G0期造血干细胞的百分比。林⁻Sca-1型⁺G0期细胞是指含有2n DNA（G0/G1）的低Pyronin Y含量细胞。右侧条形图显示平均百分比（±SD）（n=5）。（C）野生型LSK细胞的细胞周期分析，*第21页* ^−/−,*墨西哥湾* ^−/−和*第21页* ^−/− *墨西哥湾* ^−/−老鼠。细胞用Hoechst 33342和Ki67染色并用FACS分析。所示数据为平均百分比（±SD）（n=6）。（D）照射后HSC中γ-H2AX焦点的产生。野生型LSK，*第21页* ^−/−,*百万电子伏特* ^−/−和*第21页* ^−/− *墨西哥湾* ^−/−照射后3小时（200 rads）对小鼠进行γ-H2AX免疫染色。DAPI染色鉴定细胞核。底部的条形图显示显示0–2、3–5或>5病灶的LSK细胞百分比（每个基因型计算200个细胞）。

**图6。*Gfi-1型*和*内克丁*是HSC中p53的直接转录靶点和功能介质**
（A）野生型LSK细胞的转录谱分析，*第53页* ^−/−,*第53页* ^−/− *百万电子伏特* ^−/−用Affymetrix寡核苷酸芯片对小鼠进行分析。在两者中差异表达的基因*第53页* ^−/−和*第53页* ^−/− *墨西哥湾* ^−/−图中显示了HSC与野生型细胞的比较。我们利用Ingenuity Pathways Analysis（Ingenuiity Systems）将基因分组为特定的典型路径。FC代表折叠变换。（B） Gfi-1和Nectin表达增加*墨西哥湾* ^−/−LSK细胞。野生型LSK细胞中p16、p21、Gfi-1和Necdin的相对mRNA表达水平，*墨西哥湾* ^−/−,*第53页* ^−/− *墨西哥湾* ^−/−通过qPCR对小鼠进行评估，并将其归一化为HPRT表达。所示数据为转录水平相对于HPRT的平均比率（±SD）（n=2）。（C） p53激活了*内克丁*和*Gfi-1型*发起人。Hela细胞被转染*内克丁*发起人或*Gfi-1型*启动子驱动的荧光素酶报告质粒包含野生型p53结合位点或突变型p53连接位点。转染后24小时测定萤光素酶活性。数值为平均值（±SD）（n=3）。（D） p53在体内与Gfi-1和Ndn启动子结合。林的染色质结合DNA⁻骨髓细胞用p53特异性抗体或正常小鼠IgG免疫沉淀。使用引物对相应的模板进行qPCR扩增*Gfi-1、Necdin*，或*第21页*基因。（E） Gfi-1和Nectin表达下调*墨西哥湾* ^−/−细胞减少HSC的静止。*墨西哥湾* ^−/−林−Sca-1⁺用对照、Gfi-1或Necdin siRNA对细胞进行核感染。细胞核感染后24小时，用吡喃Y和Hoechst 33342对细胞进行染色，并用FACS进行分析。数值为平均值（±SD）（p<0.004，n=5）。每种siRNA（相对于对照siRNA）的敲除效果如右图所示。

**图7。Necdin用作调节HSC静止和维护的变阻器**
（A）下调Nectin表达对HSC静止的影响。野生型林⁻用对照或Necdin siRNA对细胞进行核感染。细胞核感染后24小时，用吡喃Y和Hoechst 33342对细胞进行染色，并用FACS进行分析。数值为平均值（±SD）（p<0.04，n=2）。（B） Nectin过度表达对HSC静止的影响。野生型林⁻用表达Necdin的慢病毒感染细胞。感染48小时后，用Pyronin Y和Hoechst 33342对细胞进行染色，并用FACS进行分析。所示值为平均值（±SD）（p<0.02，n=3）。（C） ●●●●。甲基纤维素测定中下调Nectin表达对造血干/祖细胞连续再植的影响。所示值为平均值（±SD）（n=3）。

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中的注释

造血干细胞静止：p53的另一个作用。
van Os R、de Haan G、Dykstra BJ。 van Os R等人。细胞干细胞。2009年1月9日；4(1):7-8. doi:10.1016/j.stem.2008.12.007。细胞干细胞。2009 采购管理信息：19128788

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