MicroRNA-101负调控Ezh2及其表达受雄激素受体和HIF-1α/HIF-1β的调控

微RNA、siRNA、DNA质粒和转染

Dharmacon，Inc.（伊利诺伊州芝加哥）合成了所有microRNA模拟物（miR-101、miR-26a和一个干扰对照），序列如下：miR-101，UACAGUACUGUGAACUGAA；miR-26a:UUCAAGUAAUCCAGGAUGCU；和加扰控制（miR-cont）：UCACAACCUAGAAAGAGUAGA。用于对照的siRNAs（GGG-CCA TGG-CAC-GTA-CGG-CAA-G）和Ezh2（GGT-GAT CAC-AGG-ATA-GGT-ATT）通过携带抗嘌呤霉素cDNA的慢病毒载体pLU传递[25].

为了生成报告构建物，我们从人类基因组DNA（P/N:5-0109，Affymetrix，Inc.）中扩增了一个493-碱基对（bp）DNA片段，该片段由Ezh2编码区的最后50 bps和Ezh2 mRNA的3’-UTR的443 bps组成。Ezh2的这个3'-UTR区域包含miR-101和miR-26a的预测靶位点，然后在Gaussia荧光素酶（GLuc）下游亚克隆，GLuc由磷酸甘油激酶（PGK）启动子驱动。我们还构建了带有这些miRNAs突变靶点的质粒。miRNA的种子序列识别其靶位点3'端的7-8核苷酸对miRNA介导的翻译抑制至关重要。因此，在Ezh2 3'-UTR中miR-101和miR-26a的预测靶位点中，我们分别用扰码序列替换这两个miRNAs种子序列识别的核苷酸。因此，我们生成了三个对照报告质粒，其中两个miR-101靶位点分别或组合发生突变(⁴⁵AGTACTGT公司⁶⁶至ACCG公司C类G公司G公司C类、和/或¹⁰¹GTACTGTA公司¹²¹到C类T型G公司C类A类G公司在，突变核苷酸以粗体显示），以及一个带有突变miR-26a靶位点的对照报告质粒(²³⁶塔克塔加²⁵⁷到CTGCA公司G公司计算机断层扫描). 为了在PC-3细胞中表达Ezh2，Ezh2 cDNA（由Sartorelli博士慷慨提供[10])分别亚克隆到慢病毒载体pSL4中，该载体共表达嘌呤霉素N-乙酰转移酶，使受感染的细胞对嘌呤霉素产生耐药性。

细胞培养、瞬时转染和慢病毒产生

PWR-1E、LNCaP、DU145和PC-3细胞系取自美国型培养物收集中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）。LNCaP、DU145和PC-3细胞在添加1%青霉素/链霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640中保存。在雄激素饥饿实验中，LNCaP细胞也在含有1%炭化型FBS（Invitrogen）的无酚红RPMI培养基中培养，并用0、0.01、0.1和10 nM R1881（一种合成的非芳香化雄激素）处理。PC-3细胞也用100μM甲磺酸去铁胺（DFO，Sigma）处理0和6小时，溶解在RPMI培养基中。PWR-1E细胞保存在角质形成细胞-SFM（Invitrogen）中。根据制造商提供的方案，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）瞬时转染PC-3细胞。根据制造商的方案，SiPort NeoFX脂质体胺（Ambion）用于LNCaP的瞬时转染。慢病毒的生产遵循先前报道的方案[26]. 简而言之，使用磷酸钙-DNA沉淀转染方案，用空pSL4载体pSL4-Ezh2、pLU-cont（对照）siRNA或pLU-Ezh2 siRNA以及三种包装质粒（pMDLg/pRRE、pRSV-RSE和pVSV-G）转染293T细胞。转染48小时后收集含有病毒颗粒的培养基。通过在25000rpm、4°C下超速离心90分钟来浓缩培养基中的慢病毒，并在-80°C下储存。为了感染细胞，将浓缩慢病毒添加到含有8μg/ml聚brene的培养基中。病毒添加后6 h，用正常培养基替换培养基。

荧光素酶报告试验

将培养在12孔板上的每个PC-3细胞孔转染50 ng报告质粒或突变报告质粒miR-101或miR-26a模拟物（每个孔中的最终浓度为100 nM）、100 ng表达由β-肌动蛋白启动子驱动的分泌型碱性磷酸酶（SEAP）的质粒和其他表达质粒（如需要）。在转染48小时后收集转染孔中的等分培养基，以测量荧光素酶活性。将50μl培养基（必要时稀释）与100μl底物溶液混合，底物溶液中含有0.5μg/ml的柯来特嗪（CTZ）、200 mM NaCl、50 mM Tris·HCl和0.01%的Triton X-100，pH值为8.7。在480 nm波长下测量光发射，并用SEAP表达进行归一化[27].

组蛋白提取

细胞在Triton提取缓冲液（磷酸盐缓冲液，含有0.5%Triton X-100，2 mM苯甲基磺酰氟，0.02%NaN）中重新悬浮_三)，在冰上轻轻摇晃溶解10分钟，并在4°C下以2000 rpm离心10分钟。用Triton提取缓冲液清洗细胞颗粒，并如上所述进行离心。为了提取组蛋白，将细胞颗粒重新悬浮在0.2 N HCl中，并在4°C下轻轻摇晃培养过夜。在4°C下以2000 rpm离心10分钟后，将含有组蛋白提取物的上清液转移到新试管中，并通过Western blot进行分析。

克隆形成试验

用对照miRNA（miR-cont）或miR-101模拟物（使用Lipofectamine 2000（Invitrogen））转染PC-3细胞。转染后48小时，在6厘米的细胞培养皿中以不同密度（125、250、500、1000和2000）培养细胞。7-10天后，用10%福尔马林固定细胞，并用0.1%结晶紫染色。每个培养皿中计数50个或更多细胞的菌落。

雄激素缺乏和比卡鲁胺治疗

将LNCaP细胞接种在完整培养基中培养48 h。用含1%炭化裂解FBS（Invitrogen）的无酚红色RPMI培养基代替培养基。在用0、0.01、0.1、1.0和10 nM R1881处理之前，允许细胞再适应这种雄激素缺乏状态24小时。为了抑制雄激素受体，在添加R1881之前，用5μM比卡鲁胺（B9061，Sigma）预处理雄激素剥夺条件下的LNCaP细胞。

WST-1细胞增殖试验

对LNCaP、DU-145和PC-3细胞进行不同的检测。将LNCaP细胞以6000个细胞/孔的密度接种在96周的平板上，并使用siPort NeoFX脂质体胺（Ambion）转染对照miRNA（miR-cont）或miR-101模拟物。在每个时间点，使用WST-1（Roche）按照制造商的方案测量三倍的细胞增殖。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）在6孔板中用miR-cont或miR-101模拟物转染DU-145和PC-3细胞。转染后48小时，在96孔板中以2000个细胞/ml的密度一式三份接种细胞。如上所述，测定每个时间点的细胞增殖。

实时RT-PCR分析

使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取细胞总RNA。通过TaqMan MicroRNA Assays（Applied Biosystems）测定细胞中成熟形式miR-101或miR-26a的水平，并将数据归一化为U6表达（AppliedBiosystes）。为了测定细胞中Ezh2 mRNA的水平，将2μg RNA与0.5μg/μl寡核苷酸引物（Promega）在70°C下孵育5分钟。然后添加以下逆转录酶混合物，并在42°C下培养1小时：5μl 5×MMLV缓冲液、5μl 10 mM dNTP、0.6μl RNasin、1μl MMLV逆转录酶，13.4μl无核水。然后使用Taqman基因表达分析进行定量PCR分析，以检测Ezh2的表达，并将数据归一化为GAPDH表达（应用生物系统）。所有分析均使用ABI7000序列检测系统进行。ΔΔC_T型方法[28]用于计算相对表达式。

Matrigel侵犯分析

将100μl Matrigel（BD Biosciences，在无血清冷细胞培养基中稀释至1 mg/ml）加入24孔transwell板的上部腔室中，并在37°C下孵育4小时，直到Matrigel固化。待测细胞在无FBS培养基中饥饿18-24 h，然后用胰蛋白酶消化法收获，用含1%FBS的培养基洗涤3次，然后在相同的培养基中以1×10的密度重新悬浮⁶细胞/ml。用温热的无血清培养基轻轻洗涤聚合的基质凝胶。在Matrigel顶部添加100μl细胞悬浮液，同时在每个底室中添加650μl含有10%FBS的完整培养基。将组装好的培养箱在37°C的细胞培养箱中培养48小时。仔细抽吸顶部和底部培养箱中的培养基，然后用PBS冲洗。通过计算结晶紫染色的细胞数量来量化细胞侵袭。

迁移分析

通过miR-cont或miR-101模拟物转染LNCaP细胞。72小时后，细胞在RPMI中以1×10的密度用1%的FBS重新悬浮⁵细胞/ml。向上室添加500μl细胞悬浮液（Becton Dickinson，35-3097，8μm孔径），同时向下室添加750μl含有5%FBS的RPMI。将培养箱在37°C的细胞培养箱中培养24小时。通过计算结晶紫染色的细胞数量来量化细胞迁移。

miR-101和miR-26a在前列腺癌细胞系中的表达

先前对miRNA图谱的研究表明，PCa中miR-101和miR-26a的水平降低[35，36]. 为了确定这两种miRNA的表达与前列腺癌细胞系恶性程度之间的相关性，我们使用实时RT-PCR研究了成熟形式miR-101和miR-26a在四种不同前列腺细胞系中的表达：PWR-1E、LNCaP、DU-145和PC-3。PWR-1E是一种非肿瘤性前列腺上皮细胞系[37]如前一项研究所述，其他三种细胞系具有致瘤性，并表现出更强的侵袭性，顺序为LNCaP、DU-145和PC-3[38]. 如图所示。​图2，2与PWR-1E细胞相比，DU-145和PC-3细胞的miR-101表达显著降低（分别降低34%和41%，p<0.05），而LNCaP细胞的miR-101表达略有增加（图。​（图2）。2). 尽管miR-26a的表达与这四种细胞系的侵袭性之间的负相关仅为微小，但PC-3和PWR-1E之间的表达差异仍然显著（减少30%，p=0.05）。

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图2

前列腺癌细胞系中miR-101和miR-26a的表达分析RT-PCR使用从PWR-1E、LNCaP、DU-145和PC-3细胞中分别提取的RNA，以及miR-101或miR-26a特异的干环引物。使用FAM标记的miR-101或miR-26a探针（Applied BioSystems）通过Taqman实时PCR对生成的cDNA进行进一步分析。每个样品分析三次。数据表示为两个实验的平均值，并使用ΔΔC归一化为内源性U6 RNA的表达_T型方法[28]如材料和方法所述。学生T检验用于确定统计显著性，星号表示p值不高于0.05。

外源性表达的miR-101和miR-26a对Ezh2表达的影响

为了确定miR-101和miR-26a是否靶向Ezh2的3'-UTR，我们研究了这两种miRNAs对含有GLuc和Ezh2 3'-UTR的报告子的影响。完整的（wt）报告子及其在miR-101或miR-26a结合位点带有替换核苷酸的突变版本如图所示。​图3A。第3页当增加miR-101和miR-26a的数量（0，50，100 nM）转染到PC-3细胞时，具有完整Ezh2 3'-UTR的报告构建物显示GLuc表达降低（图。​（图3B）。3B公司). 在我们同时突变两个miR-101靶点后，生成的报告基因结构m（45-66和101-121）完全失去了对转染miR-101的反应（图。​（图3C）。3C公司). 然而，当我们分别突变两个靶点时，我们观察到两个报告结构m（45-66）和m（101-121）的GLuc表达可以被miR-101部分抑制（图。​（图3C）。3C公司). 有趣的是，Ezh2 3'-UTR的核苷酸（nt）101-121的突变导致了比nt45-66更深刻的影响，表明miR-101与这两个位点的相互作用不同。类似地，带有突变miR-26a靶位点m（236-257）的报告结构也失去了对报告结构的抑制（图。​（图3D）。三维). 因此，报告者分析研究表明，报告者构建物的Ezh2 3'-UTR中存在这些miRNA靶位点是miR-101和miR-26a抑制的必要条件。

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图3

报告基因分析中miR-101和miR-26a对Ezh2 3'-UTR的影响以及内源性Ezh2的表达.答：。在野生型（wt）报告子中，在PGK启动子驱动的GLuc下游亚克隆了一个493 bp的片段，该片段包含Ezh2编码区的最后50 bps和Ezh2 3'-UTR的前443 bps，包含预测的miR-101和miR-26a靶位点。四个报告结构包含miR-101靶位点Ezh2 3'-UTR的突变：m（45-66）、m（101-121）和m（45-6和101-121；miR-26a靶点：m（236-257）。B。增加miR-101和miR-26a（0、50和100 nM，如有必要，用miR-cont补偿到100 nM）与wt报告子共转染“A”将SEAP表达质粒导入PC-3细胞（三倍体）。GLuc活性由SEAP活性测定并归一化（详见材料和方法）。C、。将100 nM的miR-cont或miR-101与50 ng所示报告构建物和SEAP表达质粒共同转染。如上所述测量并归一化GLuc活性。D。实验的执行方式为“C”使用标记的miR-26a和报告质粒。E.公司。用miR-cont、miR-101或miR-26a（120 nM）转染PC-3细胞。Western blot检测Ezh2和β-actin的表达。用β-肌动蛋白归一化的相对Ezh2水平被指出。F、。实时RT-PCR分析微RNA转染细胞中Ezh2 mRNA水平（归一化为GAPDH）。星号：p≤0.05。G公司和H（H）GLuc活性测定（三倍）和Western blotC、 D类和E类DU-145中(G公司)和LNCaP(H（H）)单元格。

为了确定miR-101和miR-26a对内源性Ezh2表达的调节，我们分别转染了PC-3细胞中miR-101与miR-26a的合成模拟物，并通过Western blot研究了Ezh2的表达。如图所示。​图3E，第三方，外源性表达的miR-101降低内源性Ezh2蛋白的表达，表明miR-101对Ezh2 mRNA翻译起负调控作用。有趣的是，miR-26a对Ezh2没有任何可检测到的抑制作用（图。​（图3E），第三方)，尽管它有效地抑制了包含Ezh2 3'-UTR的报告结构的表达（图。​（图3B）。3B公司). 除了蛋白质变化外，我们还检测到，与miR-cont转染的细胞相比，miR-101转染的PC-3细胞中Ezh2 mRNA显著减少（30%±15，p<0.05，图。​图3F第三层).

我们还将这些研究扩展到其他前列腺细胞系。在DU145和LNCaP细胞中的报告者分析表明，miR-101和miR-26a，而不是miR-cont，显著抑制了带有Ezh2 3'-UTR的报告者结构的表达。在DU145细胞中，miR-101和miR-26a都降低了Ezh2的表达（图。​（图3G）。第三代移动通信). 然而，在LNCaP细胞中，miR-101而非miR-26a下调了Ezh2的表达（图。​（图3H3小时).

先前的研究表明，基因3'-UTR的突变或多态性可能会消除其对miRNAs调节的反应性[39，40]. 因此，我们询问内源性Ezh2表达对异位miR-26a的惰性是否是由于PC-3细胞中Ezh2 3'-UTR处miR-26a靶位点的改变。我们扩增了PC-3细胞基因组DNA中含有miR-26a靶位点的区域，并通过DNA测序分析了PCR片段。然而，与NCBI中的人类基因组DNA序列相比，我们没有发现预测的miR-26靶点有任何变化（数据未显示）。

异位miR-101对前列腺癌细胞增殖、存活和侵袭性的影响

由于我们的数据表明miR-101抑制了Ezh2的表达，我们询问miR-101介导的Ezh2减少是否会影响组蛋白甲基化和PC-3细胞的生长、生存能力和侵袭性。Ezh2通过介导组蛋白H3-K27三甲基化调节其靶基因的表达[41]. 因此，我们在miR-101转染的PC-3细胞中检测了这种修饰。如图所示。​图4A，4A级miR-101的异位表达导致Ezh2和组蛋白H3-K27甲基化同时降低，而总组蛋白H3保持不变。使用这些细胞来确定miR-101对细胞生长的影响，我们没有检测到细胞增殖的显著变化（图。​（图4B，第4页，顶部面板）。同时，克隆形成试验表明，miR-101没有改变PC-3细胞的集落形成，这表明细胞存活率没有改变（图。​（图4B，4B类，中间面板）。我们询问PC-3细胞中miR-101适度减少Ezh2是否不足以引起细胞生长的任何变化。因此，我们通过携带Ezh2 siRNA的慢病毒感染PC-3细胞，该慢病毒可以将内源性Ezh2敲除90%以上。在细胞增殖研究中，与表达对照siRNA的细胞相比，这些Ezh2-siRNA转导的PC-3细胞在细胞增殖方面表现出明显缺陷（图。​（图4B，4B类，底部面板）。

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图4

外源性表达miR-101对PC-3细胞生长、存活和侵袭性的影响.答：。异位miR-101对组蛋白H3-K27甲基化的影响。用miR-cont或miR-101（120 nM）转染PC-3细胞。使用所示抗体通过Western blots分析转染细胞的等分样品。相对蛋白质表达在每张图片的底部。B。Ezh2下调对PC-3细胞增殖和集落形成的影响。在顶部和中间面板中，转染PC-3细胞的等分样品“A”通过WST-1增殖试验（顶部）和克隆形成试验（中部）进行研究。在底部面板中，通过WST-1试验检测携带对照和Ezh2 siRNA的慢病毒感染的PC-3细胞，并通过Western blot检测Ezh2敲除。C、。异位miR-101对PC-3细胞侵袭性的影响A类星号表示p<0.05，并显示代表性图像。D类和E类恢复Ezh2表达对miR-101转染PC-3细胞的影响。在D类，PC-3细胞用从pSL4载体或pSL4-Ezh2产生的慢病毒感染。在感染后48小时，用120nM的miR-cont或标记的miR-101转染细胞。再过48小时，用所示抗体通过Western blots分析细胞。在E类，感染/转染PC-3细胞的等分样品，具有相应的样品编号（1、2和3）D类通过侵袭实验进行研究。侵袭百分比用“*”表示，表示p<0.05和代表性图像。

我们使用Matrigel侵袭试验进一步研究了这些细胞的侵袭能力。如图所示。​图4C，4摄氏度与表达miR-cont的细胞相比，表达异位miR-101的PC-3细胞的穿透能力显著降低（46%±12，p<0.05），表明异位miR-01抑制PCa细胞的侵袭性。由于Ezh2抑制和PCa减弱进展之间的相关性已被充分记录[13，17]，我们询问miR-101降低Ezh2是否是miR-101转染细胞侵袭性降低的主要原因。我们用表达Ezh2的慢病毒感染miR-101转染的PC-3细胞，这可以将Ezh2的表达恢复到与内源性Ezh2相当的水平（90%）（图。​（图4D）。4D（四维）). 在侵袭试验中，Ezh2表达恢复的PC-3细胞与miR-cont转染的细胞表现出相似的穿透能力（92%±2.6，p<0.05，与图的第3列和第1列相比）。​图4E），第四版)表明miR-101主要通过下调Ezh2表达来减弱PC-3细胞的侵袭性。

我们询问是否可以将体外表达miR-101的PC-3细胞现象扩展到其他前列腺细胞系。因此，我们研究了异位miR-101对DU-145和LNCaP细胞的影响。在DU-145细胞中，我们观察到miR-101抑制细胞增殖和侵袭（图。​（图5A5A级和​和5B）。5亿). 这一结果与Chinnaiyan小组最近的研究结果一致[24]. PC-3和DU-145都是侵袭性和雄激素受体（AR）阴性的PCa细胞系。我们进一步研究了miR-101对侵袭性相对较低且AR阳性的LNCaP细胞的影响。我们首先观察到，与表达miR-cont的LNCaP细胞的典型纺锤形形态相比，表达异位miR-101的LNCa细胞随着细胞质部分的延伸和胞体的圆形而表现出形态学变化（图。​（图5C）。5摄氏度). 这可能不是由神经内分泌分化引起的，因为神经内分泌细胞的一些标记物没有显示出显著变化（数据未显示）。值得注意的是，在miR-101转染的PC-3和DU-145细胞中未观察到这些形态学变化（数据未显示）。出乎意料的是，与miR-cont转染细胞相比，表达异位miR-101的LNCaP细胞的细胞增殖增加，这与miR-101对DU-145细胞的作用相反（图。​（图5D）。第五天). 这种现象在多个独立的实验中是可以重现的。由于LNCaP细胞的这些形态变化可能会改变其细胞骨架结构并影响细胞迁移，因此我们使用伤口愈合和Boyden Chamber细胞迁移分析来评估这些细胞的迁移。在这两项研究中，miR-101转染的LNCaP细胞比miR-cont转染的细胞迁移率降低（图。​（图5E第五版和​和5F5楼).

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图5

miR-101对DU-145和LNCaP细胞的影响.A和B。异位miR-101对DU-145细胞增殖和侵袭性的影响。用120 nM的miR-cont或miR-101模拟物转染DU-145细胞，并在转染后72 h收集细胞。每种处理的细胞等分试样分三份进行研究(A类)WST-1细胞增殖试验和(B类)基质侵入试验。这些转染细胞的Western blot分析显示为“A类“和入侵检测的代表性图像也显示在”B类”（右侧面板）。C类、和D类异位miR-101对LNCaP细胞形态和增殖的影响。在C类，在显微镜下（20×）对转染后72 h的LNCaP细胞进行成像。黑色箭头表示细胞体的圆形，而白色箭头表示细胞细胞质部分的延伸。在D类将LNCaP细胞以6000个细胞/孔的密度分三份接种在96 well平板中，并转染120 nM的miR-cont或miR-101模拟物。用WST-1试剂检测细胞增殖。E类.转染miRNA模拟物（120 nM）的LNCaP细胞的伤口愈合试验。在指定的时间点拍摄图像。F类.转染miRNA模拟物（120 nM）的LNCaP细胞的Boyden室迁移试验。结晶紫染色后，用下图所示图像量化细胞数量。