p21和活性氧产生之间的反馈对于细胞衰老是必要的
,1,2 ,1,2 ,1,2 ,1 ,2 ,1,2 ,1,2 ,1 ,2 ,2 ,2,三 ,4 ,1,2和a、,1,2
乔·法·帕索斯
1英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所老龄研究实验室
2英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所老龄与营养综合系统生物学中心
格林·纳尔逊
1英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所老龄研究实验室
2英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所老龄与营养综合系统生物学中心
王春芳
1英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所老龄研究实验室
2英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所老龄与营养综合系统生物学中心
托尔斯滕·里希特
1英国泰恩河畔纽卡斯尔纽卡斯尔大学老龄化与健康研究所老龄化研究实验室
塞德里克·西米利翁
2英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所老龄与营养综合系统生物学中心
卡罗尔·J·普罗克特
1英国泰恩河畔纽卡斯尔纽卡斯尔大学老龄化与健康研究所老龄化研究实验室
2英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所老龄与营养综合系统生物学中心
佐托米·米娃
1英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所老龄研究实验室
2英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所老龄与营养综合系统生物学中心
Sharon Olijslagers公司
1英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所老龄研究实验室
詹妮弗·哈利南
2英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所老龄与营养综合系统生物学中心
茴香擦拭布
2英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所老龄与营养综合系统生物学中心
加布里埃尔·萨雷茨基
2英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所老龄与营养综合系统生物学中心
三英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所坩埚实验室
卡尔·伦哈德·鲁道夫
4德国乌尔姆大学分子医学系和Max-Planck干细胞衰老研究小组
汤姆·B·L·柯克伍德
1英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所老龄研究实验室
2英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所老龄与营养综合系统生物学中心
托马斯·冯·兹格利尼基
1英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所老龄研究实验室
2英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所老龄与营养综合系统生物学中心
1英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所老龄研究实验室
2英国泰恩河畔纽卡斯尔纽卡斯尔大学老龄化与健康研究所老龄化与营养综合系统生物学中心
三英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所坩埚实验室
4德国乌尔姆大学分子医学系和Max-Planck干细胞衰老研究小组
2009年10月13日收到;2009年12月18日接受。
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- 补充资料
补充电影SM1
GUID:9DA109DF-7265-4208-B5E4-1DD64F558BC4
补充信息补充图S1-19,补充表S1-3
GUID:DD4D4E74-5915-4332-BF39-DE6A0416239E
摘要
细胞衰老——正常增殖细胞(如成纤维细胞)中循环的永久性停止,导致哺乳动物组织内环境稳态的年龄相关性丧失,并起到肿瘤抑制机制的作用。事实证明,导致衰老的途径比先前设想的更加复杂。结合电子版相互作用组分析和功能靶基因抑制、随机建模和活细胞显微镜,我们在这里表明存在一个由DNA损伤反应(DDR)触发的动态反馈回路,在延迟几天后,将细胞锁定在积极维持的“深层”细胞衰老状态。环的基本特征是,检查点基因CDKN1A(p21)的长期激活通过GADD45-MAPK14(p38MAPK)-GRB2-TGFβ的串行信号传导诱导线粒体功能障碍和活性氧(ROS)的产生。这些活性氧反过来补充短期DNA损伤病灶,并维持持续的DDR。我们证明,在建立衰老表型的过程中,这个环路对于生长停滞的稳定性是必要的,也是充分的。
关键词:衰老、细胞衰老、DNA损伤灶、线粒体、活性氧
结果
延缓线粒体功能障碍和活性氧生成是衰老的结果
为了测量衰老过程中ROS诱导的动力学,我们用电离辐射(IR,20Gy)处理增殖活性的人MRC5成纤维细胞。这消除了BrdU、Ki67的细胞生长和标记指数,并导致衰老相关β-半乳糖苷酶(Sen-β-Gal)的表达,其程度与细胞达到正常增殖极限时出现的深度复制性衰老相当(数据未显示;补充图S1A和B). IR后,DNA损伤灶频率持续升高(补充图S1C–E)但没有与端粒共定位(补充图S1F)共同表明,这些细胞被胁迫诱导过早衰老(SIPS)。重要的是,线粒体超氧化物(在流式细胞术中以MitoSOX荧光强度测量)和细胞过氧化物(二氢罗丹明123/DHR荧光强度)的水平IR后没有立即改变,但24小时后,两个ROS指标的水平都增加,并且从第2天开始的整个观察期内都保持升高(). ROS指标的延迟变化伴随着壬基吖啶橙(NAO)荧光测量的线粒体质量的相应增加()JC-1(5,5′,6,6′-四氯-1,1′,3,3′-四乙基苯并咪唑基碳氰化物碘化物)荧光(MMP,). 这进一步与UCP-2号机组(补充图S1G),编码人类成纤维细胞中的主要解偶联蛋白。IR-介导的停搏后,质子泄漏依赖性(耐寡霉素)吸氧增加约两倍,类似于深度复制性衰老()证实线粒体解偶联是DDR后的早期事件。DDR下MMP的丢失也反映在细胞[Ca2+]我体内平衡(补充图S2).
线粒体功能障碍和ROS的产生是衰老的结果。(A类)流式细胞术测定照射后特定时间MRC5人成纤维细胞线粒体SOX、DHR和NAO荧光(M(M)±标准误差。,n个=3). 星号表示与未辐照对照组的显著差异(ANOVA)。(B类)MRC5细胞的典型JC-1共聚焦荧光图像(红色荧光表示MMP高,绿色表示MMP低,bar:25μm)和JC-1比率的量化(M(M)±标准误差。,n个=3). 与P(P)<0.001(Mann–Whitney秩和检验)。(C类)年轻增殖细胞(young)、深度衰老细胞(SEN)和辐射细胞(IR)中,抗低聚肌球蛋白(线粒体质子泄漏)呼吸与基础(灰色条)和最大(FCCP-)刺激(黑色条)线粒体摄氧量的比例(M(M)±标准偏差。,n个=9–12). IR和SEN与YOUNG不同P(P)<0.05,但不相互影响(方差分析)。(D类,E类)TRF2中去除8天多西环素(−DOX)ΔBΔM细胞增加了MitoSOX荧光(D),降低了JC1红/绿比率(E)。棒材:20μm。缩微照片是三个实验的代表。
为了观察ROS的产生是否也会在端粒依赖性衰老中诱导,我们有条件地过度表达了端粒结合蛋白TRF2(TRF2)的显性阴性版本ΔBΔM)通过去除强力霉素(补充图S3A–C). 这诱导了纯粹的端粒依赖性衰老(van Steensel等人,1998年)并导致线粒体功能障碍和活性氧生成的出现,以及生长潜力的丧失和含有活化H2AX(γH2AX,
补充图S3D–G). 抗氧化剂处理(低环境氧和自由基清除剂PBN处理下的细胞生长)减少,但没有消除DNA损伤灶诱导(补充图S3H). TRF2的逆转录病毒转导ΔBΔM在原代人MRC5成纤维细胞中也诱导了类似的反应(补充图S4). MMP降低和ROS水平升高是线粒体功能障碍的一个特征,最近在衰老细胞中观察到了线粒体功能障碍(Passos等人,2007年a). 我们的数据现在表明,线粒体功能障碍是DDR的延迟结果,无论这是如何引起的。我们推断,这种活性氧生成增加可能反过来导致DNA损伤和DDR,从而形成正反馈回路。
识别诱导活性氧生成并维持DDR作为正反馈回路一部分的信号通路
为了验证这一观点并描述DDR和线粒体功能障碍/活性氧产生之间的信号通路,我们首先调节TP53型MRC5人成纤维细胞中的水平,并测量ROS水平和DNA损伤病灶频率。TP53过表达增加了细胞ROS水平和DNA损伤灶频率,而siRNA介导的TP53型辐照前(补充图S5)降低了两个参数(). 抑制CDKN1A、MAPK14(通过siRNA或小分子抑制剂,补充图S6)和TGFβ(通过小分子抑制剂或阻断TGFBRII抗体)同样降低ROS和DDR()表明衰老成纤维细胞中线粒体功能障碍和ROS的诱导不是因为TP53与线粒体的直接相互作用,而是通过CDKN1A和MAPK14/TGFβ介导的。这与最近的数据显示TP53对DDR依赖性诱导成纤维细胞衰老相关白细胞介素分泌是不必要的一致(Rodier等人,2009年). 也有已发表的证据表明,TGFβ和p38(MAPK14)激活可以通过线粒体和非线粒体(NADPH氧化酶依赖性)途径诱导细胞产生ROS(托雷斯和福尔曼,2003年;Koli等人,2008年). 两者都反复与衰老表型的诱导有关(Davis等人,2005年;Debacq-Chainiaux等人,2005年;Chretien等人,2008年)包括DNA损伤灶的形成(Satyanarayana等人,2004年). 然而,TGFβ和MAPK14之间关于线粒体ROS生成的信号传递层次以及与CDKN1A的连接(如果有的话)并不明显。
通过TP53-CDKN1A-GADD45A-MAPK14-GRB2-TGFBRII-TGFβ的反馈信号诱导ROS生成并维持DDR。(A类–C类)用wtTP53(pC-p53)、空载体(pCDNA)、siRNA(如指示)、抑制剂治疗或未治疗(N)转染MRC5细胞。在未照射细胞和20Gy IR后48 h测量DHR荧光强度(黑色)和γH2AX焦点频率(红色)(M(M)±标准误差。,n个=3).*P(P)<0.04,**P(P)<0.01,***P(P)<0.001(方差分析/Tukey),NS,不显著。(D类)通过MAPK14连接CDKN1A和TGFβ的途径。边缘厚度:任何单独交互的LLS;边缘颜色:pathway LLS;节点颜色:衰老与年轻MRC5的对数折叠mRNA变化;箭头:在(B)和(C)中被阻断的基因;格雷:最可能的途径。
为了确定连接CDKN1A和MAPK14或TGFβ的候选通路,我们进行了电子版交互组分析。我们首先搜索了一个结合Biogrid的交互式数据库(Stark等人,2006年)和磷化氢。蛋白激酶目标数据库ELM(Diella等人,2008年)对于CDKN1A和MAPK14或TGFβ1/2之间的所有已知路径,中间节点不超过四个。我们计算了每条通路的对数似然分数(LLS),作为所涉及的每个个体交互作用的LLS平均值。20条最可能的路径如所示补充图S7请注意,生物网格中的许多交互作用没有固有的方向性,因此生成的网络是无方向的。因此,路径分析确定了许多假阳性候选路径。然而,所有最可能的途径都揭示了CDKN1A靶基因GADD45A的中心位置(补充图S7). GADD45A直接与CDKN1A结合(Kearsey等人,1995年)可以间接(通过MAP3K4和MAP2K3)和直接激活MAPK14(Bulavin等人,2003年).
为了从实验上分析GADD45A的作用以及MAPK14和TGFβ的层次结构,我们进行了进一步的顺序候选抑制,包括单个抑制和各种组合抑制。所有处理都以相似的数量减少了ROS形成和DDR,并且任何组合处理都没有加性效应(),强烈表明所有测试的基因产物都是一个单一上位通路的成员。替代途径中LLS的计算表明,MAPK14位于TGFβ上游的概率比其位于下游的概率高约两个数量级(补充表S1). 根据相互作用组分析,最可能的途径如下所示将这些通路中的基因与MRC5成纤维细胞衰老的Affymetrix基因表达分析结果叠加(Passos等人,2007a),我们注意到,在衰老的人成纤维细胞中,此途径中的中心基因往往协调上调,当受到无监督的层次聚类时,导致紧密聚类(补充图S8). 我们进一步证实了CDKN1A-MAPK14-TGFβ作为结合DDR和ROS生成的正反馈回路的一部分的信号传导,这表明(i)抑制MAPK14可以减少TGFβ分泌量(补充图S9A)IR后MMP增加,线粒体质量降低(补充图S9B); (ii)抑制MAPK14或TGFβ或两者都降低了含有激活的ATM/ATR和53BP1的DNA损伤病灶(补充图S10); (iii)用MAPK14抑制剂SB203580治疗可降低活化TP53(p53-S15)、CDKN1A和磷酸化MAPK14本身的水平(补充图S11); (iv)抑制MAPK14,但不抑制花生四烯酸代谢、细胞色素P450或PI3K信号,特别减少了端粒依赖性衰老中活性氧水平的升高(补充图S12); (v) 单独或联合抑制MAPK14和TGFβ可降低IR后MRC5成纤维细胞的细胞核CDKN1A水平(补充图S13A); 和(vi)清除ROS可降低IR后DDR病灶频率和CDKN1A诱导(补充图S13B).
总之,这些数据强烈表明,衰老细胞中的DDR和最终生长停滞可能是通过TP53-CDKN1A-GADD45A-MAPK14-GRB2-TGFBRII-TGFβ(补充图3A).
随机反馈回路模型预测单细胞水平上DDR和生长停滞的动力学
我们量化了如下所示的概念模型看看它是否能充分解释衰老诱导和维持的动力学。为了创建DDR反馈回路的随机机械模型,我们扩展了之前发布的TP53/Mdm2电路模型(Proctor和Gray,2008年)包括CDKN1A、GADD45、MAPK14、ROS和DNA损伤的合成/激活和降解/失活/修复反应(补充表S2和第3章). 我们为反应速率常数和变量的初始量选择了实际值(参见补充表S2和第3章)并从IR前2天到IR后6天对500个细胞进行随机模拟。我们使用TP53-S15、CDKN1A和MAPK14蛋白水平的实验动力学数据对模型进行参数化(补充图S11)、DNA损伤病灶频率(补充图S1E)和ROS水平(和). 该模型非常精确地复制了辐射后活化的TP53、CDKN1A、ROS和DNA损伤灶的动力学行为。在模拟中,关键变量在2-3天后稳定下来,从而使CDKN1A水平保持在背景水平以上,从而产生稳定的生长停滞表型(). 相比之下,没有反馈的模型通常会在2-3天内恢复到辐照前的水平().
随机反馈回路模型在单细胞水平预测DDR和生长停滞的动力学。(A类)反馈回路模型。端粒未包裹(红色)或未修复的双链断裂(黑色)触发DDR激活TP53和CDKN1A。高CDKN1A水平通过GADD45、MAPK14和TGFβ启动信号传递,导致线粒体功能障碍和ROS生成增加,从而损伤核DNA,从而诱导更多非减数DNA损伤灶,稳定DDR和生长停滞,导致稳定的衰老表型。(B类)随机模拟。IR在t吨=0,SB203580来自t吨=6天。结果是M(M)±标准差。,n个=500.垂直线表示SB203580治疗的开始(MAPK14活性抑制60%,比较补充图S11). 对于CDKN1A,显示了基底上方2 s.d.处的阈值(虚线)。实验数据(ROS的DHR流式细胞术,病灶频率的γH2A.X免疫荧光,CDKN1A/TUBULIN和p53 S15/总TP53 western,M(M)±标准误差。,n个⩾3)以红色显示以进行比较。(C类)与中的模拟相同但在CDKN1A后完全没有反馈。(D类)根据随机模型预测,SB203580在IR后94小时处理对每个细胞的DNA损伤焦点频率的影响。M(M)(黑色),s.d.(灰色),n个=500. (E类)在20 Gy IR后,在指定时间(h)表达AcGFP–53BP1c的MRC5细胞的共聚焦时间序列t吨=94小时(+SB)。图像是压缩堆栈(最大强度投影),焦距=4.5μm,灰度值转换为查找表中所示的色阶。全分辨率时间序列如所示补充电影SM1。绿色箭头表示此单元格中在整个观察期间持续存在的一个焦点。所有其他焦点都是短暂的,红色箭头标记了这些示例。(F类)通过活细胞显微镜测量IR和SB203580治疗后AcGFP-53BP1c病灶的频率。M(M)(黑色)、s.e.m.(深色)、s.d.(浅色)、,n个=22.垂直条表示SB203580处理开始于t吨=94小时(G公司)AcGFP–53BP1c病灶在年轻、衰老和辐照MRC5细胞中的Kaplan–Mayer生存曲线。从两个独立的实验来看,每次治疗分析的病灶数量在61到146个之间。***P(P)=1.1×10−12(Cox回归)。(H(H))在开始使用SB203580治疗之前(对照组)和之后,每个细胞的长寿命和短寿命AcGFP–53BP1c病灶的频率(均用20 Gy照射)。M(M)±标准误差。,n个=275–354.*P(P)=0.006; NS,不显著(学生t吨-测试)。
在建立不可逆细胞衰老的过程中,反馈环路信号对于维持增殖停滞是必要的和充分的。(A类)20 Gy IR后指定时间细胞和年轻(CONT)细胞和复制衰老(SEN)细胞中的ROS水平(DHR荧光强度)(M(M)±标准误差。,n个=3). 在指定时间开始使用SB203580、PBN或siRNA对抗CDKN1A的治疗,并在48–72小时后测量ROS水平。在除CONT外的所有时间点,P(P)<0.01(ANOVA),与仅经IR处理的细胞进行比较。(B类)与(A)中相同的实验,测量DNA损伤病灶频率。在除CONT外的所有时间点,P(P)<0.01(ANOVA),与仅经IR处理的细胞进行比较。(C类)与(A)中相同的实验,测量KI67阳性细胞的频率。除CONT和>20d外的所有时间点,P(P)<0.01(ANOVA),与仅经IR处理的细胞进行比较。(D类)照射MRC5细胞,在第6天用SB203580或PBN处理,并共同染色Ki67(红色)和CDKN1A(绿色)。右侧是未染色、单染色和双染色细胞频率的量化。(E类)在第6天用20 Gy照射体积培养的MRC5细胞,不处理或用SB203580或PBN处理,在第9天计算细胞数以计算ΔPD(M(M)±标准偏差。,n个=3). 对照组的PD没有显著变化,但两种治疗组的PD均高于对照组P(P)<0.01(方差分析)。(F类)在第1天用1000个细胞/孔将辐照后的细胞接种,第6天不处理或用SB203580或PBN处理。第21天对细胞进行染色。
在建立了与实验数据的一致性之后,该模型被用于预测干预反馈回路的效果。IR后第6天抑制MAPK14信号或抗氧化剂治疗使ROS水平降低约一半(). 该模型预测DDR显著降低,重要的是,CDKN1A水平降低到一定程度,使一部分细胞摆脱生长停滞(). 因此,该模型预测,在DNA损伤诱导衰老后,反馈回路对于生长停滞的稳定性是必要的,也是充分的。
在较高的时间分辨率下,该模型预测在MAPK14抑制后的几个小时内,IR-risted细胞中DDR病灶频率显著下降(). 为了验证这一预测,我们使用53BP1–GFP融合蛋白作为活细胞中的DDR报告蛋白。53BP1在细胞核内广泛表达并均匀分布,在DNA损伤后重新分布到病灶中。我们将53BP1的一个大的C末端片段融合到GFP中,该片段包含形成病灶和与TP53相互作用所必需的TUDOR和BRCT结构域,产生AcGFP–53BP1c融合蛋白,定量报告活细胞中的病灶动态(Nelson等人,2009年). DNA损伤灶的频率和激活的p53、CDKN1A和ROS的水平在IR后2天左右都稳定下来,并在随后的几天内保持不变(和;补充图S1E). 因此,我们观察了在IR介导的阻滞后3天至5天稳定表达AcGFP–53BP1c的单个MRC5成纤维细胞。在观察期间,用MAPK14抑制剂SB203580处理细胞94小时。时间分辨活细胞显微镜可以定性和定量识别单个DNA损伤病灶(和补充电影SM1). Foci频率测量与免疫荧光静态测量结果一致(补充图S10B)并对随机模型的预测进行了定量验证(比较).
对时间序列的仔细观察表明,许多单个病灶的寿命比观察期短得多(参见补充电影SM1). 我们通过使用宽z叠加范围(4.5μm)和高成像频率(每7分钟一次)确保正确跟踪单个焦点。至少两张连续图像上病灶的出现或消失分别作为记录标准。
我们测量了年轻增殖、辐射和深度衰老的MRC5成纤维细胞中单个病灶的寿命(). 增殖细胞中几乎没有病灶,其中大多数寿命低于5小时,可能是由复制应激引起的。衰老细胞Foci寿命显著增加。然而,即使在深度端粒依赖性复制性衰老中,也并非所有病灶都成为永久性病灶。相反,大约一半的病灶寿命短,寿命低于15小时(). IR后>2天的Foci动力学与复制衰老非常相似(). 单个细胞追踪结果显示,SB203580处理下的总病灶频率降低是由于短寿命病灶数量减少所致(补充图S14). 以15小时的寿命作为截止时间,我们发现SB203580治疗后,短期病灶的频率显著降低,但长期病灶的频率没有显著降低(). 这些数据表明,通过MAPK14的延迟信号传导介导的活性氧生成,通过持续补充短寿命DNA损伤病灶,有助于DDR。
DDR和ROS生成之间的反馈回路对于在建立不可逆衰老过程中维持衰老生长停滞是必要和充分的
为了分析反馈回路与衰老表型建立和维持的相关性,我们在IR诱导SIPS后的不同时间点通过回路抑制信号传递,并测量ROS水平、DNA损伤灶频率和增殖标记物。使用MAPK14抑制剂SB203580或自由基清除剂PBN处理来阻断环,并且实验覆盖了从IR后30分钟到21天的时间范围以及深度复制衰老。拥有(补充图S1A)并已发布(Coppe等人,2008年;Rodier等人,2009年)数据表明,人类成纤维细胞在7-10天内出现完全衰老表型。两种治疗都降低了ROS水平()和γH2A。X焦点频率()同样,即使在诱导衰老数周后开始,也表明反馈回路在深度衰老中仍然活跃。治疗也在整个时间范围内增强MMP(数据未显示)。DDR诱导后1周内开始的治疗有效地挽救了生长停滞(). 20 Gy IR后,所有成纤维细胞的增殖相关抗原Ki67稳定为阴性,但如果在SIPS诱导后9天内开始治疗,则SB203580或PBN治疗可使多达30%的细胞恢复正常(). 几乎所有Ki67阳性细胞的CDKN1A表达均为阴性(),表明这些细胞不仅重新进入G1期,而且有可能进入细胞周期。事实上,我们在两种散装培养物中观察到,在SIPS诱导后6天,用SB203580或PBN处理的细胞增殖恢复强劲()和克隆生长()分析。处理后的细胞至少在数周内以正常增殖速度生长,而在20 Gy IR后,未处理的细胞完全没有生长,这表明处理不仅推迟了衰老,而且实际上挽救了衰老。如果用低剂量5 Gy照射的细胞在2 h内处理,则获得非常相似的结果(补充图S15)或照射后6天(补充图S16). 此外,用另一种抗氧化剂对5个Gy照射过的细胞进行后处理,N个-乙酰半胱氨酸,挽救细胞增殖(数据未显示)。
我们比较了实验观察到的增长拯救与随机模型的预测。在模型中进行单细胞追踪后,我们观察到,在SB203580处理下,一些细胞在一段时间内会显示CDKN1A值,低于IR前增殖细胞中确定的基本平均CDKN1A蛋白水平(补充图S17). 在我们的随机模型中,我们将CDKN1A的阈值设置为高于基准值2×标准偏差(参见)并假设如果CDKN1A水平持续低于该阈值至少6小时(即允许通过CDKN1A依赖的G1/S边界),细胞将从生长停滞中恢复。通过查询500个单独的细胞轨迹,我们发现在SB203580治疗下有96个细胞(19.2%)符合这一标准,而在单纯IR治疗后没有一个细胞符合这一要求(补充图S16). 与实验数据的比较()结果表明,该模型通过反馈回路抑制定量预测了生长停滞的挽救。
总之,这些结果表明,DDR和ROS生成之间的反馈回路是必要的,足以在SIPS启动后维持至少1周的细胞周期阻滞。然而,在衰老开始后9天之后的时间点,反馈信号的抑制在挽救癫痫发作中的效率逐渐降低(),表明我们的模型中没有考虑的其他机制稳定了深度衰老中的生长停滞。深度衰老中生长停滞的稳定可能部分归因于染色质组织的显著变化(成田等人,2003年). 衰老相关异染色质焦点(SAHF)和HP-1γ焦点是衰老相关染色质重新建模的两个标志物,在IR后6天,其水平较低,但在随后的几周内随着生长停滞的不可逆性而增加(补充图S18). 在晚期(IR后10天)用SB203580或PBN处理细胞,但不能有效地挽救生长,也不能改变SAHF相关的核粒度(补充图S18C).
通过CDKN1A的DNA损伤信号导致ROS介导的损伤增加体内
评估反馈回路信号与氧化损伤产生的相关性体内我们使用了原代胚胎成纤维细胞(小鼠胚胎成纤维纤维细胞,MEF)和晚期组织(G4)TERC公司−/−和G4TERC−/−CDKN1A−/–老鼠。多代人的端粒酶功能丧失导致端粒功能障碍,引发组织中广泛的DDR。淘汰CDKN1A基因抑制下游信号,部分挽救了G4TERC−/−老鼠(Choudhury等人,2007年). 与人类细胞一样,在IR后48小时,wt MEF中的ROS水平增加,并且在CDKN1A−/−MEF公司(). 此外,CDKN1A公司缺失抑制了端粒依赖性衰老(即在低环境氧条件下)中ROS和DDR的诱导G4TERC−/−MEF公司(). 有趣的是,在双KO MEF中,端粒和剩余病灶的共同定位最为接近,证实通过CDKN1A的信号丢失优先减少非端粒病灶(). 这些数据证实了小鼠细胞中存在CDKN1A依赖性反馈回路信号,与人类细胞中的信号非常相似。
CDKN1A公司基因敲除可挽救后代的氧化损伤TERC−/−老鼠。(A类)MEF中IR后48小时的MitoSOX荧光。M(M)±标准误差。,n个=3,P(P)=0.029(学生的t吨-测试)针对IR CDKN1A+/+和IR CDKN2A−/−。(B类)具有指定基因型的γH2AX-阳性MEF的线粒体SOX、DHR和NAO荧光强度和频率。G4表示生成较晚TERC−/−P<0.0001(ANOVA/Tukey)G4CDKN1A型+/+反对G4CDKN1A−/−(所有参数)。(C类)MEF核的代表性显微照片。红色:端粒;绿色:γH2A。X;白色:根据皮尔逊相关分析,显著的共同定位。右侧所示基因型MEF中端粒焦点共定位的皮尔逊相关系数(M(M)±标准误差。,n个=80–90,**P(P)<0.0001,*P(P)=0.043). (A–C)中的MEF在3%的环境氧气浓度下生长。(D类–F类)γH2A的代表性显微照片。具有指定基因型的小鼠(12-15个月龄)肠隐窝中的X(D)、宽带自体荧光(E)和8oxodG免疫染色(F)。定量数据(右栏)为M(M)±标准误差。,n个=3–5.*P(P)<0.009对G4TERC−/−所有参数(ANOVA/Tukey)。(F)中的箭头显示8oxodG-阳性细胞的示例。(G公司)8oxodG-阳性细胞与同一单个隐窝中自体荧光的频率。显示了线性回归(直线)和95%置信区间(虚线)。P(P)<0.0001. (H(H))γH2A。三种基因型同一个体隐窝中X焦点密度与自体荧光的关系。图中显示了线性回归(直线)和95%置信区间(虚线)。
在对照小鼠的各种细胞和组织中,包括肠隐窝中的肠细胞,衰老细胞显示DNA损伤灶的频率随着年龄的增长而增加。我们确定这些病灶阳性细胞没有凋亡,并且其中很少有γH2A双重阳性细胞。X和增殖标记物(Wang等人,2009年). 我们在Sen-β-Gal-阳性和γH2A的估计值之间获得了良好的定量一致性。X阳性、PCNA阴性的肠细胞,强烈表明这些细胞正在衰老(Lawless等人,2009年). 评估这是否会导致氧化负荷增加体内,我们测量了γH2A。年龄匹配对照组肠隐窝X灶形成和两种组织氧化损伤标记物(宽带自体荧光和8-oxodG免疫反应),G4TERC−/−和G4TERC−/−CDKN1A−/–老鼠(). γH2A的频率。每个隐窝的X阳性肠上皮细胞在G4TERC−/−与野生型或TERC+/-小鼠相比(,另请参见(Choudhury等人,2007年;Wang等人,2009年)). 虽然损失了CDKN1A公司只是轻微减少了显示γH2A的地穴数量。X阳性(Choudhury等人,2007年),显著降低γH2A的频率。每个隐窝的X阳性细胞(). 这种效应与凋亡无关,因为TUNEL阳性隐窝细胞的频率不依赖于CDKN1A公司(Choudhury等人,2007年).
宽带自体荧光主要来源于氧化和交联的细胞成分,如晚期糖基化终产物和老年色素脂褐素,因此与氧化应激有关(Gerstbrein等人,2005年). 自G4TERC−/−老鼠,但这是因为失去了CDKN1A公司(). 氧化DNA碱基修饰也有类似的模式(). 自体荧光与8-oxoG染色强度显著相关()和γH2A。单隐窝水平的X焦点频率,基因型之间只有微小重叠(). 这些数据表明,通过CDKN1A的DNA损伤信号体内对隐窝细胞的氧化损伤。
依赖CDKN1A的活性氧的产生并不局限于增殖组织:脑神经元遭受严重的DNA损伤(Rass等人,2007年)从而显示出频繁的DNA损伤病灶(Sedelnikova等人,2004年). 小脑神经元显示DDR的频率在后代中增加TERC−/−老鼠,而这种增加在G4TERC−/−CDKN1A−/–老鼠(补充图S19A). 这些神经元的自身荧光强度和8-oxodG阳性平行变化(补充图S19B–D). 在皮层和海马体(未显示)也获得了类似的数据。这些数据表明端粒功能障碍导致氧化损伤体内通过CDKN1A发出信号。
讨论
衰老的自由基假说认为ROS介导的分子损伤是衰老的潜在原因。尽管干预研究的结果相互矛盾体内(Muller等人,2007年),ROS水平对衰老的影响在体外已经有很好的记录(Passos等人,2007b;Lu和Finkel,2008年). 我们的结果表明,线粒体功能障碍和活性氧的产生不仅可以加速衰老的开始(例如,通过加快端粒缩短,参见(冯·兹格利尼基,2002)),但也是持续DDR信号的组成部分和结果,因此是衰老表型的组成部分。
Takahashi等人(2006年)是第一个令人信服地证明存在ROS生成的正反馈回路的人。在他们的表达温度敏感性猴病毒40大T抗原的人成纤维细胞模型中,环将CDKN2A通路与ROS产生和蛋白激酶Cδ信号相互连接(Takahashi等人,2006年). 最近的研究表明,致癌诱导的衰老可导致AMPK激活、线粒体功能障碍和活性氧的产生,而活性氧的生成又可自行触发衰老(Moiseeva等人,2009年)因此,这暗示了另一个与衰老中的活性氧有关的反馈回路。视网膜母细胞瘤蛋白pRb是CDKN1A和CDKN2A通路生长停滞的重要下游介质(Chang等人,2000年;Dai和Enders,2000年;Beausejour等人,2003年;Takahashi等人,2006年). 然而,在我们的原代人或小鼠成纤维细胞系统中,CDKN2A和pRb都不一定参与线粒体功能障碍和ROS生成的诱导。
虽然我们不排除存在其他稳定衰老细胞中ROS生成的途径,但我们已确定通过CDKN1A、MAPK14和TGFβ的信号传导是端粒依赖性和非依赖性DDR与人和小鼠原代成纤维细胞ROS生成之间的重要联系。此身份由以下人员告知生物信息学交互分析和定量随机建模。交互分析允许集成来自广泛来源的大量数据,即使它们仅在分散的数据库集中可用,高吞吐量实验的结果通常也是如此。不直接相互作用的基因之间可能的关系可以通过标准图论算法进行分析,例如这里使用的最短路径分析。LLS对边的赋值(Lee等人,2004年)提供了个体相互作用强度的度量,并允许按照生物合理性的顺序对可能的路径进行排序。相互作用体的主要局限性是其有限的方向性和静态性质。作为克服这些局限性的第一步,我们将Biogrid数据与磷化氢相结合。全基因组蛋白质磷酸化数据库ELM(Diella等人,2008年)并用一组查询特定的基因表达数据覆盖结果。
衰老过程(包括细胞衰老)的一个特征是其固有的随机异质性(Kirkwood等人,2005年;Passos等人,2007a). 因此,我们选择了一个能够解释随机过程并解释随机变化的定量模型。这也使我们能够适当地处理仅在极低拷贝数下存在的分子物种(例如DNA损伤病灶)和产生不同结果的细胞部分(例如干预后的重新进入增殖)。
重要的是,我们发现,通过CDKN1A-GADD45A-MAPK14-GRB2-TGFβ发出信号,导致衰老细胞中的ROS水平增加,并反馈到DNA损伤诱导和反应中,产生稳定的、自我维持的反馈回路。这种反馈循环即使在不可逆的深度衰老中也会持续存在在体外在衰老细胞中体内在衰老的建立阶段,循环对于维持复制停滞是必要的和充分的。因此,这是建立不可逆衰老的必要前提。
我们的数据强烈表明,在衰老的早期建立阶段,DNA损伤灶的最低频率对于维持足够长的生长停滞时间以使细胞走向不可逆转是必要的。在我们的实验中,这个阈值频率似乎约为每个核五个焦点,但在不同的细胞和/或不同的实验条件下可能有所不同。重要的是,我们的数据表明,这些病灶本身并不一定是永久性的,从而导致永久性生长停滞。细胞可能会遭受永久性损伤(即端粒未封盖)或原则上的高水平可修复损伤(例如,在高剂量IR后)。无论如何,如果这种情况在1-2天内无法解决,就会激活一个细胞自主程序,从而永久性地产生ROS和ROS介导的DNA损伤。随后的损伤诱导和修复的随机平衡将DNA损伤信号保持在阈值以上,直到进一步的机制(包括但不一定限于CDKN2A激活、自分泌信号和染色质重塑)确保永久性细胞周期阻滞。在我们的SIPS模型中,发现衰老细胞中大约一半的病灶是短命的,而短命的病灶对于维持生长停滞的稳定性是必要的和足够的,这并不意味着在某些条件下,持续的、不可修复的DNA损伤信号可能不足以诱导衰老。然而,它表明,假设DNA损伤需要是不可修复的和持续的,以产生持续的扩散抑制是没有必要的。相反,短暂的DNA损伤可以对衰老起到重要作用,只要它不断由正反馈回路补充,从而在损伤诱导和修复之间保持动态平衡。
另一个增加的复杂性是,焦距组成可以随时间变化。例如,当细胞进入有丝分裂期时,53BP1、MRE11和NBS1从DNA损伤灶中丢失,而γH2AX和MDC1仍集中于染色质(Nelson等人,2009年;Nakamura等人,2010年). 在衰老过程中,病灶的成分也可能发生变化(Panda等人,2008年). 更好地理解病灶动力学将有助于理解细胞损伤反应和老化。
标准细胞培养中的氧水平异常高,导致线粒体产生的活性氧至少部分增加,从而加速端粒依赖性衰老(冯·兹格利尼基,2002;Passos等人,2007a)和/或SIPS(Parrinello等人,2003年). 这并不意味着此处所述的衰老过程中ROS生成反馈环的诱导是一种细胞培养产物;然而,在生理上较低的环境氧浓度下,MEF中ROS水平和DDR仍以相同的p21依赖方式进行调节(参见). 此外,DDR和氧化应激在衰老小鼠端粒非依赖性细胞衰老过程中密切相关(Wang等人,2009年),并且这种关联依赖于p21(本研究)。端粒依赖性衰老可以通过降低线粒体ROS的产生和/或释放来延缓(Saretzki等人,2003年;Passos等人,2007a)这可能是由于端粒缩短较慢和非端粒DDR水平降低所致。最后,最近的数据表明,在致癌ras诱导的衰老中,线粒体功能障碍和活性氧的产生是通过p53和pRb依赖性途径触发的,并且能够促进ras依赖性生长停滞(Moiseeva等人,2009年). 总之,这些数据表明,涉及线粒体功能障碍和活性氧生成的反馈回路在各种生理相关形式的细胞衰老中可能很重要。
我们推测线粒体功能障碍和活性氧产生可能是衰老表型发展的原因。线粒体功能障碍,包括ROS的产生,在衰老细胞中诱导逆行反应,这是核基因表达模式的主要重新编程(Butow和Avadhani,2004年;Passos等人,2007a,2007年c). 最近的工作不仅牵涉到ROS(Bartek等人,2007年)但也包括生长因子、趋化因子和细胞因子信号传导的因子,这些因子对肿瘤诱导衰老至关重要(Acosta等人,2008年;Kuilman等人,2008年;Wajapeye等人,2008年;Kuilman和Peeper,2009年). 这些家族的许多基因产物参与逆行反应(Butow和Avadhani,2004年)它们与TP53和MAPK途径相互作用(Acosta等人,2008年). 对线粒体功能障碍在建立分泌性衰老表型中的作用进行详细检查显然是必要的。
虽然在某些条件下,衰老细胞可以有效地从组织中清除(Ventura等人,2007年;Krizhanovsky等人,2008年),携带各种衰老标记的细胞,包括DNA损伤灶确实在人体内积聚(Dimri等人,1995年),灵长类(Herbig等人,2006年)和鼠标(Wang等人,2009年)年龄增长的组织。DNA损伤灶与活性氧生成有关体内和在体外(本文)认为,具有活化DDR的组织-受体细胞可能不仅通过分泌生物活性肽而干扰组织功能和体内平衡(Campisi和d'Adda di Fagagna,2007年;Coppe等人,2008年)而且还通过在其微环境中诱导ROS介导的损伤。H(H)2O(运行)2是线粒体、细胞质和细胞外超氧化物歧化的主要产物。它溶于水和脂质,是一种寿命相对较长的活性氧,便于在细胞之间扩散。因此,H2O(运行)2带有活化DDR的细胞释放可能有助于“旁观者效应”,即衰老细胞似乎会“感染”其原本未受应激的邻居(Sokolov等人,2007年).
重要的是,我们的结果表明,在深度衰老中,对衰老表型的单个成分(例如活性氧的产生)进行干预是可能的。即使这些干预措施不能挽救生长停滞表型,它们也可以改善衰老细胞对其微环境的表型影响(“旁观者效应”)。有初步证据表明,“抗衰老”干预措施有可能延缓衰老。然而,细胞周期检查点机制上游的干预措施可能会显著增加癌症风险(贝克等人,2008年;Tomas-Loba等人,2008年). 对控制衰老表型的信号通路网络的进一步了解无疑将有助于确定最有希望的靶点,以改善老化细胞对环境的负面影响。
材料和方法
细胞和组织
含有强力霉素诱导的TRF2的T19细胞ΔBΔM和逆转录病毒表达载体pLPCNMyc-TRF2ΔBΔM是来自纽约洛克菲勒大学T de Lange的礼物(van Steensel等人,1998年). MRC-5人胚肺成纤维细胞(PD 38)感染pLPCNMyc-TRF2ΔBΔM逆转录病毒。TRF2的表达ΔBΔM使用T19细胞中的抗FLAG M2小鼠单克隆抗体(Sigma)或感染MRC5的抗Myc抗体Myc-FITC(#46-0307,Invitrogen)进行监测。MEF在3%的环境氧气下生长。
产生转基因小鼠,并按照说明制备12–15个月龄小鼠的MEF以及大脑和肠道切片(Choudhury等人,2007年). 实验得到了当地伦理委员会的批准。
抑制剂
PD 25-30的MRC-5细胞瞬时转染对照非靶向siRNA、TP53 siRNA(信号沉默®p53 siRNA试剂盒,细胞信号技术),CDKN1A siRNA(信号沉默®p21 Waf1/Cip1 siRNA人特异性)、MAPK14 siRNA(信号沉默®池p38 MAPK siRNA)或GADD45A siRNATM(TM)DuoPak,Invitrogen)根据供应商的协议使用核感染(Amaxa)。
使用10μM SB202190(Sigma)或SB203580(Tocris Bioscience)抑制MAPK14活性。使用抗磷酸化p38 MAPK(小鼠单克隆,细胞信号传导)和抗p38 MAPK(兔多克隆,细胞信息传导)通过western blot证实抑制作用。使用TGFβR2抗体(兔多克隆,细胞信号传导)或10μM SB431542(Tocris Bioscience)抑制TGFβ途径。使用Quantikine测量分泌的人TGFβ1®人TGF-β1免疫分析(#DB100B,研发系统)。
显微镜
使用传统技术进行透射电子显微镜检查。所有荧光显微镜均在共焦模式下进行(蔡司LSM510)。始终使用63×(NA=1.4)物镜和1 Airy单位针孔在相同的激发和发射条件下测量Foci频率和荧光强度。对于5μm组织切片的宽带自体荧光,使用20×(NA=0.5)物镜,其针孔相当于11μm z切片。样品在458 nm处激发,在475 nm以上捕获荧光发射,同时捕获透射图像。每个细胞或每个隐窝的荧光强度在ImageJ中进行了量化(http://rsb.info.nih.gov/ij/). 通过流式细胞仪测量活细胞中的MMP(Passos等人,2007a)或在配备Solent培养箱(Solent Scientific)的LSM510中,37°C,加湿5%CO2,使用63×(NA=1.4)物镜;将100 nM Mitotracker Green和16 nM TMRM(四甲基罗丹明甲酯,Invitrogen)在37°C的无血清培养基中加载30 min。分别使用488和543 nm激发和505–530 nm带通或560 nm长通发射捕获线粒体绿色荧光(与线粒体总质量成比例)和TMRM荧光(与MMP成比例)。整个细胞深度的图像是使用每400 nm一个1.4μm的z切片作为z堆栈来获取的,使用惠更斯(SVI)进行去卷积,并使用相同的物体尺寸截止参数和不同处理之间的强度作为表面投影进行渲染。
为了获得SAHF形成的定量估计,从感兴趣的屏蔽区域的DAPI染色图像中计算平均梯度振幅,并使用imageJ插件作为粒度度量http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/differences网站/(Unser,1999年). 平均梯度振幅除以平均DAPI强度。
对于活细胞时间扫描显微镜,细胞被镀在磐城玻璃底皿(磐城)中,并在配有37°C的Solent培养箱(Solent Scientific)的倒置蔡司LSM510上成像,加湿5%CO2,使用40×1.3 NA油物镜,如上所述(Nelson等人,2002年). 在捕获z堆栈之前,在每个时间点执行自动对焦,以确保捕获整个细胞(在4.5μm总z范围内,每1.5μm有1.65μm针孔)。使用ImageJ手动跟踪细胞和AcGFP–53BP1c病灶(网址:http://rsb.info.nih.gov/ij/).
进一步的实验程序
流式细胞术和共焦成像技术用于测量线粒体超氧化物、细胞过氧化物、线粒体质量、细胞质钙、γH2A。X、免疫荧光、端粒免疫荧光原位杂交、RT-PCR和sen-β-Gal染色(Passos等人,2007a). 每次测量至少对30000个细胞进行流式细胞术。抗-p21小鼠单克隆IgG(U2OS,Calbiochem Inc.)、抗p16兔多克隆IgG-(C20,Santa Cruz Biotechnology Inc.)、抗击p38 MAPK兔多克隆(细胞信号)用于免疫荧光和抗γ-H2A。使用X兔单克隆(细胞信号传导)和小鼠单克隆8-oxodG(日本研究所,带鼠对鼠试剂盒),用vectastain ABC试剂盒(PK-6101,Vector)进行免疫组化。
使用高分辨率呼吸测定法(Oxygraph-2K;Oroboros Instruments,Insbruck,Austria)测定细胞摄氧量。在37°C下进行测量。记录稳态基础氧摄取率后,依次添加以下化学品:寡霉素(1μg/ml)、羰基氰化物对(三氟甲氧基)苯腙(FCCP,3–4.5μM,取决于细胞状态)、鱼藤酮(0.5μM)和抗霉素A(2.5μM)。抗粘菌素氧摄取被登记为非线粒体氧摄取,并从原始数据中减去以计算线粒体氧摄取。
统计
如果数据不是正态分布的,则通过Mann–Whitney秩和检验比较各组平均值。采用方差分析(ANOVA)进行多重比较,然后采用Tukey检验进行单个亚组的比较。γH2A。如前所述,通过pixelwise Pearson相关分析测试X端粒共定位(Passos等人,2007a).
致谢
我们感谢G Lei博士、A Tsolou博士、A Oakley博士、M Maddick女士和M C Fawcett女士的技术帮助,感谢纽约洛克菲勒大学T de Lange教授的TRF2ΔBΔM细胞和pLPCNMyc-TRF2ΔBΔM表达式向量。该研究得到了BBSRC/EPSRC(CISBAN)向TK和TvZ以及英国老龄化研究中心向TvZ提供的资助。JP通过葡萄牙波尔图波尔图大学GABBA项目得到了技术基金会的部分支持。CP由苏格兰阿尔茨海默病研究基金会和阿尔茨海默氏病研究信托基金会的奖学金资助。
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