Cdc48p公司^Npl4p/Ufd1p通过锚上的多-泛素信号结合和分离异二聚体膜锚定/栓系转录因子复合物在体外

摘要

介绍

Cdc48p，共酿酒酵母是AAA的高度保守成员(A类T基地A类与多种细胞相关A类活性）ATP酶家族的分子伴侣，在许多细胞过程中发挥重要作用，包括膜融合、纺锤体解体、ERAD(E类内质的R（右）小叶A类有关联的D类降解）和泛素（Ub）/蛋白酶体依赖性蛋白水解（在伍德曼，2003;Wang等人，2004年;叶，2006). Cdc48p含有两个中心定位的ATP酶域（D1和D2）。该蛋白质以六聚体的形式存在，D1和D2结构域形成堆叠环，将ATP水解与六聚体中的构象变化耦合（参见Pye，2006年). 据推测，这种活性对底物施加机械力，导致其构象发生依赖于Cdc48p的变化。

虽然Cdc48p与Ub和多-Ub链相互作用，但与其氨基末端结构域相关联的Ub结合适配器增强了与泛素化底物的相互作用(Meyer等人，2002年;Ye等人，2003年). 研究得最好的Cdc48p适配器之一是高度保守的二聚体Npl4p-Ufd1p复合物。主要在酵母中进行的研究表明，Npl4p-Ufd1p介导Cdc48p活性的一个子集；膜结合转录因子Mga2p和Spt23p在ERAD、有丝分裂和活化中的作用（综述于贝斯和汉普顿，2002年;Wang等人，2004年;叶，2006). 多个结构域介导复合物的Ub结合活性，酵母和后生动物Npl4p的结构和功能都有重要差异(Meyer等人，2002年;Ye等人，2003年). 后生动物Npl4p具有羧基末端结合Ub的锌指结构域，该结构域与游离的Ub和Lys 48和Lys 63连接的Ub链相互作用，该结构域的缺失消除了其结合Ub的功能(Meyer等人，2002年;Ye等人，2003年). 酵母Npl4p缺乏该结构域，因此Npl4p-Ufd1p复合物的底物结合可能由Ufd1p的Ub结合功能介导(Ye等人，2003年). 结构研究表明，Ufd1p的氨基末端对单-Ub和多-Ub有两个不同的结合位点，尽管它对多-Ub链具有较高的亲和力(Park等人，2005年). 此外，考虑到从酵母中免疫纯化的含有Ufd1p的复合物结合Lys 48链而非Lys 63链，含有Lys 48键的底物可能是Cdc48p的首选靶点^Npl4p/Ufd1p在酵母中(Ye等人，2003年).

除了内质网错误折叠的泛素化蛋白的逆转录易位外，Cdc48p复合物还被提议在许多与Ub相关的过程中发挥作用，包括那些具有不同后果的蛋白（在哈拉瓦尼和拉特里奇，2006年). 例如，研究表明Cdc48p复合物将E3/E4连接酶招募到特定底物和/或调节其构象，从而允许连接酶介导的Ub修饰(Ishigaki等人，2004年;Yoshida等人，2005年;Richly等人，2005年). 相反，Cdc48p还与去泛素酶相互作用，因此可能控制Ub链从某些底物上的分解(Rumpf和Jentsch，2006年;Mullally等人，2006年). 尽管如此，我们目前对Cdc48p如何参与这些不同过程的机制性理解非常有限。

如上所述，Cdc48p^Npl4p/Ufd1p复合物是激活酵母膜结合转录因子Mga2p和Spt23p所必需的(Rape等人，2001年;Hitchcock等人，2001年). Mga2p和Spt23p在调节有机发光二极管1和其他脂质代谢基因(Hoppe等人，2000年;Auld等人，2006年). 这些蛋白质合成为120kDa（即p120）内质网（ER）定位前体（两种蛋白质都包含羧基末端跨膜结构域）(Hoppe等人，2000年). 通过其IPT同质异构化(我类似g的/P（P）列克星素/T型转录因子）结构域中，二聚体的一个分子经历泛素化和蛋白酶体依赖的内-pro裂解事件，然后发生双向降解(Piwko和Jentsch，2006年). 蛋白质（即p90）的氨基末端90kDa免于完全降解，这可能是由于存在高度稳定的IPT二聚化结构域。p90通过与未处理的p120的相互作用保持与膜的连接(Rape等人，2001年;Shcherbik等人，2003年). 以前的研究提供了证据证明Rsp5p-Ub连接酶和Cdc48p^Npl4p/Ufd1p需要从各自的ER结合锚中动员转录活性Mga2p90和Spt23p90产品(Rape等人，2001年;Shcherbik等人，2003年). 就Spt23p而言，Cdc48p^Npl4p/Ufd1p-已假设介导的Spt23p90动员依赖于Cdc48p^Npl4p/Ufd1p与mono-Ub Spt23p90的相互作用(Rape等人，2001年). 我们之前已经使用基于细胞的系统证明，非Ub修饰的Mga2p90的核转运与膜锚的多泛素化有关，并且在含有突变的酵母菌株中受到抑制rsp5,cdc48或npl4号机组(Shcherbik等人，2003年). 在这项研究中，我们利用了在体外系统以更精确地定义Rsp5p、Cdc48p之间的物理和功能交互^Npl4p/Ufd1p以及异聚物（即p120-p90）Mga2p和Spt23p复合物。

结果

Cdc48p公司^{GSTNpl4p/Ufd1p}与Mga2p120-Mga2p90复合物结合需要Rsp5p依赖的多-泛素化在体外

因为我们过去基于细胞的研究主要集中在Mga2p上，所以我们首先开始使用纯化成分来确定Cdc48p之间的相互作用^Npl4p/Ufd1pMga2p120-Mga2p90复合物是直接的，需要Mga2p20的泛素化。重组GST标记的Cdc48p、Npl4p和Ufd1p在细菌中产生，并被谷胱甘肽sepharose捕获。加工蛋白酶将Cdc48p和Ufd1p从固体载体中释放出来。将蛋白质与含有GST-Npl4p的谷胱甘肽微球混合，允许形成复合物。将该材料的一部分制成颗粒，并通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色进行分析，以验证Cdc48p^{GSTNpl4p/Ufd1p}复杂地层。如左面板所示图1A，Cdc48p^{GSTNpl4p/Ufd1p}制剂含有化学计量量的Cdc48p、GST-Npl4p和Ufd1p。我们无法在仅含GST的珠子上检测到Cdc48p和Ufd1p。

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图1

Cdc48p公司^{GSTNpl4p/Ufd1p}与多泛素化Mga2p120和Mga2p 90相互作用

（A） （左面板）在细菌中产生重组GST标记的Cdc48p、Npl4p和Ufd1p蛋白，并用谷胱甘肽珠纯化。使用加工蛋白酶从珠子中释放GST标记的Cdc48p和Ufd1p。然后将蛋白质与珠状结合的GST-Npl4p或单独的GST对照混合，允许形成蛋白质复合物。将珠状物造粒，再悬浮在SDS-PAGE加载缓冲液中，煮沸，用SDS-PACE溶解，形成Cdc48p^{GSTNpl4p/Ufd1p}复合物通过考马斯蓝染色进行验证。（右图）从表达FLAG标记Mga2p的酵母或空载体对照中分离微粒体并溶解。用抗FLAG抗体偶联琼脂糖免疫沉淀蛋白质。蛋白质用FLAG肽洗脱，SDS-PAGE分离，考马斯蓝染色显示。（B） 琼脂糖捕获的Mga2p120-Mga2p90复合物放置在在体外泛素化反应包含指示的E1、E2 Ubc1p和不同数量的Rsp5p（600 ng、200 ng、66 ng）。终止后，洗涤琼脂糖珠以去除酶，并用FLAG肽洗脱复合物。在含有抗FLAG和抗Ub抗体的重复凝胶上进行蛋白质印迹。*表示另一种工艺Mga2p产品，详见正文。（C） 来自在体外泛素化反应与含有GST或Cdc48p的谷胱甘肽珠培养^{GSTNpl4p/Ufd1p}.清洗珠子，将其重新悬浮在SDS-PAGE加载缓冲液中，并煮沸样品。等量的洗脱材料在重复的8.0%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上运行，并用抗FLAG和抗Ub抗体分别进行western印迹。对两种膜进行Ponceau S染色（仅显示用于抗FLAG印迹的膜），以显示每个结合反应中等量的重组蛋白。（D） 使用所示GST融合蛋白/复合物和泛素修饰或未修饰的Mga2p120-Mga2p90复合物进行结合分析。

由于我们遇到了许多技术问题，使用细菌制备的重组蛋白生成二聚体Mga2p120-Mga2p90，我们从酵母微粒体中免疫纯化了Mga2p20-Mga2p 90复合物。微粒体由过度表达氨基末端FLAG标记的Mga2p的细胞制备。使用含有Triton X-100的缓冲液溶解膜，并将复合物捕获到抗FLAG抗体偶联的琼脂糖珠上。如右面板所示图1A，该方法生成纯（大于90%）Mga2p120-Mga2p90络合物。低丰度的约100kDa带（用*in表示图1A和1B)这里以及其他图中检测到的是抗FLAG反应性和抗Ub非反应性蛋白。该Mga2p产品可能代表了图1A和1B，我们的相互作用研究（见下文）和最近公布的数据(Piwko和Jentsch，2006年)一种替代蛋白酶体生成的Mga2p120系留Mga2p蛋白，缺乏羧基末端跨膜和Rsp5p结合位点。

接下来放置的是胎圈耦合Mga2p120-Mga2p90在体外含有或缺乏重组E3-Ub连接酶Rsp5p的泛素化反应。我们之前已经证明Mga2p是Rsp5p的直接靶点，Rsp5p-Mga2p的结合是由位于Mga2p120羧基末端结构域内的不完美WW相互作用基序（即LPKY）介导的(Shcherbik等人，2004年). 泛素化反应完成后，清洗珠子，用FLAG肽洗脱Mga2p。用抗FLAG和抗Ub抗体对洗脱产物进行western blotting分析。如所示图1B在含有E1、E2和Rsp5p酶的反应中，高分子量泛素化Mga2p产物明显，但在仅补充E1和E2蛋白的反应中不明显。此外，在任何泛素化反应中，我们都没有检测到Mga2p90分子量的大小变化。还值得注意的是，泛素化产物的出现与Mga2p120的减少相关，而与Mga2p90的减少无关。这些结果表明，Mga2p120-Mga2p90复合物中首选的Rsp5p靶点是Mga2p 120。

用谷胱甘肽珠偶联Cdc48p进行结合分析^{GSTNpl4p/Ufd1p}以及如上所述生成的Mga2p产品。如所示图1C，我们只能检测到Cdc48p之间的强相互作用^{GSTNpl4p/Ufd1p}和Mga2p90使用来自包含E1、E2和Rsp5p酶的泛素化反应的输入。此外，除了在结合反应中下拉未修饰的Mga2p90外，我们还造粒了高分子量的Ub修饰Mga2p蛋白(图1C). 在用所示抗体进行探测之前，对印迹进行Ponceau S染色，结果显示Cdc48p的量相等^{GSTNpl4p/Ufd1p}在所有下拉列表中。Cdc48p也获得了类似的结果^{Npl4p/GSTUfd1p}复合物，其中GST-Ufd1p用于制剂中(图1S补充数据）。值得注意的是，我们通常用最佳量的Cdc48p造粒约20%的底物输入（即Ub修饰的Mga2p120-Mga2p90复合物）^{GSTNpl4p/Ufd1p}或Cdc48p^{Npl4p/GSTUfd1p}放置在结合分析中。除了与Cdc48p进行相互作用分析之外^{GSTNpl4p/Ufd1p}，我们还对GST-Cdc48p和GST-Npl4p/Ufd1p复合物进行了结合研究，以确定相互作用是否由AAA ATP酶和/或其二聚体辅因子介导。如所示图1D，与多-泛素化Mga2p120的相互作用(^多边形Ub当结合反应中存在Ub-结合适配器复合物Npl4p/Ufd1p时，Mga2p120）和Mga2p 90明显。奇怪的是，我们只能从^{Poly-Ub公司}含有GST-Cdc48p的反应中的Mga2p120-Mga2p90（长时间暴露时明显存在弱泛素信号）。考虑到以前的研究表明，当在蛋白质上使用较小的标记或将未标记的Cdc48p偶联到含有Ufd1p的Cdc48相互作用域的GST融合时，Cdc48p对多-泛素化底物具有亲和力(Meyer等人，2002年和Ye等人，2003年)，GST-Cdc48p上的GST标签可能会对Cdc48p结合产生负面影响。

考虑到免疫纯化的Mga2p120-Mga2p90复合物不是100%纯的，除了Mga2p120之外的Rsp5p靶标可能介导与Mga2p90的相互作用。为了解决这种可能性，我们对两种不同的Mga2p突变体进行了额外的结合分析，其中一种突变体仅包含Mga2p的90kDa氨基末端部分（该突变体是从总细胞提取物中进行免疫纯化的，因为它缺乏跨膜结构域并且不结合ER-），另一种突突变体（即Mga2p-ΔLPKY）缺少与Rsp5p结合基序对应的4个氨基酸(Shcherbik等人，2004年).图2显示Cdc48p^{GSTNpl4p/Ufd1p}不能与Mga2p90相互作用，该Mga2p 90来自泛素化反应，仅含有Mga2p20ΔLPKY-Mga2p90复合物，该复合物缺乏Rsp5p结合位点。这些结果有力地证明了Cdc48p^{GSTNpl4p/Ufd1p}与Mga2p90的相互作用是通过多-泛素化Mga2p20介导的。

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图2

Cdc48p公司^{GSTNpl4p/Ufd1p}与Mga2p90的相互作用取决于Mga2p 120和Rsp5p结合基序的存在

准备输入（A）并进行结合分析（B），如图1除了免疫纯化的FLAG标记的Mga2p90（由含有半乳糖诱导的FLAG标签的细胞的全细胞提取物制备镁2截短突变体）和FLAG标记的Mga2p120ΔLPKY-Mga2p90复合物也包括在内。

我们接下来测试了Cdc48p^{GSTNpl4p/Ufd1p}与Mga2p120-Mga2p90结合需要在基底上形成聚-Ub链。使用WT（野生型）Ub或无法形成链的化学修饰Ub突变体（即甲基化Ub）进行泛素化反应。这些反应的产物随后用于Cdc48p^{GSTNpl4p/Ufd1p}下拉分析。如所示图3A，我们无法检测到Mga2p120-Mga2p90和Cdc48p之间的相互作用^{GSTNpl4p/Ufd1p}使用在含有甲基化Ub的泛素化反应中产生的底物。然而，一种可能性是Cdc48p^{GSTNpl4p/Ufd1p}与甲基化Ub结合有缺陷。解决Cdc48p的首选项^{GSTNpl4p/Ufd1p}用于与交互^{Poly-Ub公司}Mga2p120-Mga2p90通过另一种方法，我们首先用突变Ub（即K48R/K63R）修饰Mga2p20-Mga2p 90复合物，在Lys 48和Lys 63处具有取代。当用该突变体进行泛素化反应时，Rsp5p不能有效地促进聚-Ub链组装，并且Rsp5p的减少量和形成的主要产物是多个单泛素化的Mga2p120（左图图3B). 如右面板所示图3B，我们也无法检测到Cdc48p之间的相互作用^{GSTNpl4p/Ufd1p}以及用K48R/K63R Ub突变基因修饰过的Mga2p120-Mga2p90。我们从这些研究中得出结论，Cdc48p^{GSTNpl4p/Ufd1p}通过放置在膜相互作用锚上的Rsp5p依赖性多-泛素信号与Mga2p120-Mga2p90复合物相互作用。我们还根据先前的研究推断，酵母Cdc48p^Npl4p/Ufd1p不与Lys 63链相互作用(Ye等人，2003年)Mga2p120上存在的Lys-48连接链介导Cdc48pGSTNpl4p/Ufd1p-Mga2p20-Mga2p 90相互作用。

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图3

一个Cdc48p^{GSTNpl4p/Ufd1p}-Mga2p120-Mga2p90相互作用需要多泛素化

（A） ●●●●。（左侧）制备Mga2p120-Mga2p90复合物，并将其固定在抗FLAG抗体偶联的琼脂糖微球上。泛素化反应在甲基化Ub存在下进行(^遇见Ub）、E1、E2 Ubc1p和Rsp5p的不同量（30 ng、100 ng和300 ng）。用FLAG肽从珠子中洗脱反应产物，并用所示抗体进行两次免疫印迹分析。（右侧面板）GST下拉菜单如图例所示图1C（B）（左面板）在存在WT或指示的泛素突变体和70 ng Rsp5p的情况下，按照A中所述进行泛素化反应。用FLAG肽从珠子中洗脱反应产物，并用所示抗体进行两次免疫印迹分析。（右侧面板）使用WT和K48R/K63R泛素修饰的Mga2p120-Mga2p90复合物进行GST下拉，如图例所述图1C.

Cdc48p公司^Npl4p/Ufd1p促进Mga2p90从膜中动员和Mga2p90从捕获的珠中分离^{Poly-Ub公司}镁2p120

除了上述相互作用实验外，我们还研究了重组Cdc48p^Npl4p/Ufd1p使用无细胞系统影响内质网膜Mga2p蛋白的动员。从表达表位标记Mga2p的细胞制备微粒体。重组GST融合的Cdc48p、Npl4p和Ufd1p蛋白（单独或以复合物形式）如上所述生成，但Procession蛋白酶用于从谷胱甘肽珠中释放蛋白质和复合物（通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色判断的纯度显示在图4A). 将蛋白质、ATP和ATP再生系统添加到微粒体中，并将样品在27°C下培养1小时。然后对样品进行超速离心，并通过蛋白质印迹测定上清液和沉淀膜中Mga2p120和Mga2p90的量。如所示图4A（右图），含有Cdc48p的反应中存在最大量的可溶Mga2p90^Npl4p/Ufd1p并且包含ATP消耗酶Apyrase抑制的Cdc48p^Npl4p/Ufd1p-介导Mga2p90从膜中释放。有趣的是，我们无法检测到Mga2p120或高分子量修饰的Mga2p20肽的存在，这表明至少在体外，Mga2p90动员不与Cdc48p耦合^Npl4p/Ufd1p-膜结合锚的诱导逆行移位(图4A). 在含有Npl4p/Ufd1p复合物的反应中，还检测到可溶性Mga2p90略有增加，可能是由于内源性膜相关Cdc48p的存在(Rape等人，2001年;Hitchcock等人，2001年).

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图4

Cdc48p公司^Npl4p/Ufd1p-从属Mga2p90动员需要Rsp5p，动员产品未经Ub修改

（A） （左面板）制备重组GST融合蛋白和复合物，并将其捕获在谷胱甘肽琼脂糖上。用精密蛋白酶从珠子中去除产物，用SDS-PAGE进行解析，并用考马斯蓝染色进行可视化。（右图）从表达氨基末端FLAG标记的Mga2p的细胞中分离出微粒体。体外用微粒体和指示的重组蛋白、复合物、ATP、ATP能量再生系统和/或Apyrase进行动员试验。反应完成后，通过超速离心将样品分离为不溶性（膜）和可溶性组分，并通过western blotting测定这些组分中Mga2p120和Mga2p 90的含量。（B） （左面板）微粒体由重量或第5-1页在非允许温度下表达FLAG标记Mga2p的细胞。溶解膜，用抗FLAG抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀蛋白通过SDS-PAGE溶解，转移到硝酸纤维素膜上，并用指示的抗体进行检测。（右侧面板）体外使用左侧面板中描述的微粒体进行动员测定。（C） 终止后在体外使用上清液（S）和溶解颗粒（M）中的物质进行动员反应和抗FLAG免疫沉淀。然后用抗FLAG和抗Ub抗体进行SDS-PAGE和western blotting。

确定Cdc48p^Npl4p/Ufd1p-介导的Mga2p90动员依赖于Rsp5p生成的信号，我们使用从第5-1页细胞在37°C下生长。rsp5-1型细胞具有温度敏感性rsp5当细胞在37°C下生长时，基因突变和连接酶不起作用。图4B研究表明，在由第5-1页非允许温度下的突变细胞（左面板）。的右侧面板图4B显示Cdc48p^Npl4p/Ufd1p无法从升级Mga2p90版本（右侧面板）第5-1页衍生微粒体。因为Cdc48p^Npl4p/Ufd1p-膜上同源Spt23p90的介导动员似乎依赖于与单-泛素化Spt23p 90的相互作用(Rape等人，2001年)，我们想研究可溶性Mga2p90是否有这种修饰。如所示图4C，我们不能在使用识别单个连接的Ub部分或组装的Ub链的抗体的可溶性部分中使用任何泛素修饰的Mga2p，包括单-泛素化Mga2p90。此外，我们没有发现可溶性Mga2p90与膜结合Mga2p 90的相对迁移存在差异，即使蛋白质在大凝胶上溶解（数据未显示）。

尽管上述发现表明Cdc48p具有直接的Mga2p120-Mga2p90分离酶功能^Npl4p/Ufd1p在生物学上相关在体外动员系统，基于系统的性质，分离活动是间接的是完全可能的。为了解决这些问题，我们着手建立一个无微粒体在体外分离分析。制备了表位标记的Mga2p120-Mga2p90复合物，并如前所述对Ub进行了修饰，除了MGA2公司以含有氨基（即FLAG）和羧基末端（即HA）标记的表达结构为底物。用FLAG肽释放后，将Mga2p120-Mga2p90复合物重新捕获在抗HA抗体缀合的珠上，得到Mga2p90，其通过存在于相关Mga2p120上的羧基末端表位标签锚定在固体支持物上。然后将这个综合体放置在在体外用指示的蛋白质和复合物、ATP和ATP能量再生系统进行分离分析。将小球制成丸，并用抗FLAG抗体进行免疫印迹法测定固体载体中Mga2p90的释放量。如所示图5，Cdc48p^Npl4p/Ufd1p诱导Mga2p90从珠子中释放。这种活性是ATP依赖性的，因为在含有Apyrase的反应中没有观察到分离，它还需要Rsp5p依赖的泛素化。我们还注意到Cdc48p单独（无GST标记）促进了连接酶依赖^多边形UbMga2p120-Mga2p90分离，尽管程度与整个复合物不同。这个结果表明，至少在这里使用的条件下，Cdc48p具有足够的泛素结合活性，并且与Cdc48p和Npl4p/Ufd1p都具有Ub相互作用域的想法一致(Meyer等人，2002年;Ye等人，2003年). 或者，这些制剂可能含有能够与重组Cdc48p协同作用的共纯化Npl4p和Ufd1p。在缺乏识别酵母Npl4p和Ufd1p的可用抗体的情况下，我们用两种方法解决了后者的可能性。首先，我们分析了在体外通过考马斯蓝染色进行分离分析，未发现与Npl4p或Ufd1p分子量类似的蛋白质与Mga2p共纯化（图2SA）。此外，图2SB显示Mga2p90在在体外分离分析在相对较高的Cdc48p输入量下趋于稳定，这一结果与Cdc48p-介导的Mga2p90分离依赖于潜在的小/亚化学计量量污染Npl4p/Ufd1p的概念不一致。因此，我们得出结论，该体系中Cdc48p依赖的Mga2p90分离是直接的，并且随着Npl4p和Ufd1p的存在而增强。

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图5

Cdc48p公司^Npl4p/Ufd1p促进Mga2p90从珠状Ub改性Mga2p20中分离

制备Mga2p120-Mga2p90复合物，如前所述用抗FLAG肽修饰Ub并从珠状物中洗脱，但使用了同时带有氨基（FLAG）和羧基（HA）末端标记的表达Mga2p的细胞。用FLAG肽洗脱后，用抗HA抗体偶联琼脂糖将Ub修饰材料重新捕获到另一个固体载体上。将50 ng材料放入含有ATP、ATP能量再生系统和100 ng BSA的反应中，显示重组蛋白、复合物（总共100 ng）和/或Apyrase。丸粒化，通过western印迹法测定丸粒结合和释放的Mga2p量。

Cdc48p公司^Npl4p/Ufd1p结合并分离异二聚体^{Poly-Ub公司}Spt23p120-Spt23p90复合物

如引言中所述，Cdc48p^Npl4p/Ufd1p-Spt23p90与连接的Spt23p120的依赖性分离被认为是通过一个Spt23p90单-双肽信号，该信号是蛋白酶体依赖性加工反应的残余物(强奸等，2001年). 奇怪的是，当我们从微粒体中免疫纯化FLAG标记的Spt23p120-Spt23p90复合物，并用FLAG肽洗脱免疫沉淀蛋白时，我们无法检测到任何单-泛素化的Spt32p90(图6A). 仅观察到大分子量泛素修饰产物大于120kDa(图6A). 确定Cdc48p是否^Npl4p/Ufd1p通过类似于Mga2p的机制结合和分离Spt23p120-Spt23p90，我们采用了类似的方法和实验，如上文所述，使用免疫纯化的Spt23p20-Sp23p90复合物。与Mga2p的结果类似，我们只能检测到Cdc48p之间的相互作用^{Npl4p/GSTUfd1p}当输入来自包含Rsp5p和WT-Ub的泛素化反应时，Ub修饰的Spt23p120和非Ub修饰Spt23p 90(图6B). 还分别使用微粒体和珠结合的Spt23p120-Spt23p90进行动员和分离测定。如所示图7A，Cdc48p^Npl4p/Ufd1p促进Spt23p90从微粒体的动员，并且来自可溶性部分的免疫纯化的Spt23p90产物不是泛素修饰的。最后是Cdc48p，更大程度上是Cdc48^Npl4p/Ufd1p，有助于将Spt23p90从其珠状物中释放出来^{Poly-Ub公司}Spt23p120合作伙伴(图7B). 我们从这些实验中得出结论，Cdc48p^Npl4p/Ufd1p通过类似机制促进Mga2p90和Spt23p90从其各自的Poly-Ub改性膜结合锚中解封。

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图6

Cdc48p公司^{Npl4p/GSTUfd1p}通过Spt23p120多-泛素信号结合异二聚体Spt23p120-Spt23p90

（A） 微粒体由含有半乳糖诱导的FLAG标记的细胞制备SPT23标准或空载体（V），用抗FLAG抗体偶联琼脂糖进行溶解和免疫沉淀。在广泛洗涤后，用FLAG肽洗脱Spt23p。用SDS-PAGE分离洗脱物，用抗FLAG和抗Ub抗体进行免疫印迹。（B）体外与所示配合物的结合分析是使用之前所述的经Ub修饰的Spt23p120-Spt23p90底物进行的。

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图7

Cdc48p公司^Npl4p/Ufd1p促进Spt23p从微粒体动员和分离^{Poly-Ub公司}Spt23p120-Spt23p90复合物在体外

除表位标记的Spt23p蛋白携带与Mga2p相同的标签外，还按照上图图例所述进行了基于微粒体的动员和动员产物分析（A）和基于珠的分离（B）研究。（C） Rsp5p-Cdc48p的建议模型^Npl4p/Ufd1p-介导膜结合转录因子动员。泛素结合位点尚待确定。

讨论

我们之前提出了一个基于细胞研究的模型，其中Cdc48p^Npl4p/Ufd1p通过与多-泛素化Mga2p120的相互作用促进Mga2p 90从内质网膜中释放(Shcherbik等人，2003年). 由于动员与缺乏Cdc48p或Npl4p功能的细胞中多-泛素化Mga2p120的增加有关，我们最初认为Mga2p 90的释放/解离与Mga2p20的逆行转移和膜结合锚的蛋白酶体依赖性降解有关。这个在体外这里显示的绑定数据支持我们模型的“信号”组件，表明Cdc48p之间的交互^Npl4p/Ufd1p并且Mga2p120-Mga2p90是由Rsp5p诱导的Mga2p20上的poly-Ub信号直接介导的（参见图7C用于描述我们的模型）。然而，我们的在体外动员/隔离数据表明Cdc48p^Npl4p/Ufd1p-Mga2p90的依赖性释放与Mga2p20的逆转录易位和Cdc48p的分离酶功能无关^Npl4p/Ufd1p就足够了。虽然我们不能排除在体外分析缺乏逆转录易位所需的成分，我们没有观察到Mga2p120半衰期在重量与cdc48或npl4号机组突变株（NS和DSH，未公布数据）。因此，Cdc48p很可能^Npl4p/Ufd1p促进Mga2p90从膜中释放在体外和体内通过简单地将系留的Mga2p90与其poly-Ub标记的膜结合锚分离。如果是这样，为什么泛素化形式的Mga2p120在缺乏功能性Cdc48p的细胞中积聚^Npl4p/Ufd1p复杂？根据最近的发现，这种复合物也与氘化酶有关(Rumpf和Jentsch，2006年)，可以想象Cdc48p^Npl4p/Ufd1p-Mga2p90的依赖性动员与Cdc48p耦合^Npl4p/Ufd1p介导的Mga2p120的去泛素化，这可以作为产生未修饰的Mga2p120单体的再循环机制。或者，这些形式可能代表少量错误折叠的非功能性多-泛素化Mga2p120，通常通过ERAD途径清除。尽管如此，还需要进一步的实验来确定在缺乏Cdc48p的细胞中积累多-泛素化Mga2p120的机制^Npl4p/Ufd1p功能。

以前的研究表明Cdc48p^Npl4p/Ufd1p也在促进Spt23p90从内质网向细胞核的动员以及该蛋白从微粒体释放到可溶性部分中发挥作用在体外(Rape等人，2001年). 与这些结果一致，我们发现Cdc48p^Npl4p/Ufd1p诱导Mga2p90和Spt23p90释放到可溶性部分，而不促进整个复合物的逆行转移。因此，所提出的模型之间的主要脱节是负责促进Cdc48p的泛素信号的性质^Npl4p/Ufd1p互动。先前对Spt23p的研究表明，Spt23p90的单泛素化是信号(Rape等人，2001年). 这一结论是基于从溶解的微粒体中免疫沉淀Spt23p并用珠结合材料进行抗Ub蛋白印迹得出的。使用额外的纯化步骤（即用FLAG肽从琼脂糖珠中洗脱免疫纯化的FLAG标记的Spt23p120-Spt23p90复合物），我们只检测到分子量大于120kDa的泛素化Spt23p，并且我们还无法识别泛素化90kDa产品。此外，我们发现使用基于微粒体的在体外Cdc48p动员试验^Npl4p/Ufd1p活化的Spt23p产物没有泛素修饰，Cdc48p之间存在相互作用^Npl4p/Ufd1p和Spt23p120-Spt23p90复合物需要Spt23p120多泛素化。因此，我们建议Cdc48p^Npl4p/Ufd1p通过类似机制促进Spt23p90和Mga2p90从内质网中释放。

虽然从我们的在体外这里的研究表明Cdc48p^Npl4p/Ufd1p通过膜结合锚上的多-泛素信号直接介导Mga2p120-Mga2p90和Spt23p120-Spt23p90复合物的分离，其机制需要进一步研究。Cdc48p可能^Npl4p/Ufd1p复合物破坏了二聚蛋白质之间的非共价相互作用，或重塑了其中一个蛋白质的结构域（例如二聚结构域），从而失去了二聚能力。此外，目前尚不清楚Cdc48p是以顺式作用于泛素锚定还是反式作用于未修饰的Mga2p90。需要进一步的实验，包括基于结构的研究，以解决这些精确的机制。还将定义Cdc48p是否以及如何^Npl4p/Ufd1p-依赖过程受到调节，以及存在于该复合体中的各种Ub结合结构域如何有助于分离。Mga2p和Spt23p嵌于细胞膜中，它们调节参与脂质代谢的基因(Hoppe等人，2000年,Auld等人，2006年). 因此可以想象Cdc48p^Npl4p/Ufd1p-依赖性Mga2p90和/或Spt23p90释放与膜流动性传感机制耦合。事实上，在我们的在体外无可否认，检测结果很低（约10%），可能表明其他重要的协同事件，例如膜结合转录因子或Cdc48p成员的额外修饰^Npl4p/Ufd1p复杂。对于各种Ub相互作用域（可能至少存在于Cdc48p和Ufd1p上），确定它们对相互作用和分离过程的相对贡献将是有趣的。可以想象，Mga2p/Spt23p上的poly-Ub信号与各种Ub结合域之间的多重相互作用发挥定位作用，因此只有蛋白质的特定域不稳定。泛素连接的位置、长度和类型也有可能在Cdc48p中发挥关键作用^Npl4p/Ufd1p-介导分离。

正如引言中所述，先前基于细胞的研究结果表明，丰富且高度保守的Cdc48p复合物在许多过程中发挥作用，包括错误折叠的ER蛋白的逆行移位、分离、泛素化和去泛素化。本文对异体转录因子复合物的研究首次提供了直接的生化证据，支持Cdc48p的分离酶功能。重要的是，这种依赖于Cdc48p的分离酶功能在其激活中起着关键的作用，并且是通过一种与蛋白酶体无关的机制来实现的。然而，Cdc48p分离酶功能对蛋白酶体依赖性事件也很重要，例如将修饰的Ub与非修饰的结合伙伴分离，以便只有泛素化的Ub靶向蛋白酶体进行破坏。考虑到大量的膜定位蛋白进行多泛素化，未来的研究将有兴趣确定Cdc48p（或哺乳动物细胞中的p97/VCP）通过蛋白酶体非依赖性机制，在调节膜栓系蛋白的亚细胞定位或膜上蛋白质相互作用中发挥广泛作用。此外，考虑到细胞中Cdc48p的相对丰度以及潜在的Cdc48p适配器数量的增长（在Elsasser和Finley，2005年)，如果Cdc48p依赖性分离酶活性在很大比例的真核蛋白的调节中很重要，这就不足为奇了。

实验程序

补充材料

致谢

脚注

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