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.2006年2月；26(3):822-30.
doi:10.1128/MCB.26.3.822-830.2006。

Doa1是一个Cdc48适配器，它拥有一个新的泛素结合域

詹姆斯·穆拉利 1, 塔蒂亚娜·切尔诺瓦, 基思·威尔金森
附属公司

Doa1是一个Cdc48适配器，它拥有一个新的泛素结合域

詹姆斯·穆拉利等。 分子细胞生物学. 2006年2月.

摘要

Cdc48（p97/VCP）是一种AAA-ATP酶分子伴侣，其细胞功能通过与泛素结合辅因子（例如Npl4-Ufd1和Shp1）的相互作用而得到促进。一些研究表明，酿酒酵母Doa1（Ufd3/Zzz4）及其哺乳动物同源物PLAA与Cdc48相互作用。然而，这种相互作用的功能尚未确定，也没有证明这些蛋白质之间的生理联系。在此，我们证明Cdc48与Doa1的C末端PUL结构域直接相互作用。我们发现Doa1具有一个新的泛素结合域（我们建议将其命名为PFU域，用于PLAA家族泛素结合结构域），这似乎是Doa1功能所必需的。我们的数据表明，Doa1的PUL和PFU结构域促进了Doa1-Cdc48-泛素三元复合物的形成，潜在地允许泛素化蛋白向Cdc48招募。DOA1和CDC48突变是上位性的，这表明它们的相互作用在生理上是相关的。最后，我们通过显示人-酵母嵌合体与泛素结合并补充酵母中的doa1Delta表型，提供了PLAA家族内功能保守性的证据。综合起来，我们的数据表明Doa1作为Cdc48的泛素结合辅因子发挥生理作用，人类PLAA可能通过与p97/VCP的相互作用发挥类似作用。

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数字

图1。
图1。
一个新的泛素结合域在Doa1中的定位，即PFU域。（A） 将表达各种HA标记Doa1截短片段的酵母菌株的全细胞裂解物与29链四泛素类似物-脑葡萄糖（泛素）或对照-脑葡萄糖培养。使用HA表位抗体免疫化学检测负载、结合和未结合Doa1。B、 绑定；U、 未绑定。（B） 序列比对上PLAA家族的域结构示意图，比较了人类PLAA和酿酒酵母Doa1.箭头指向面板C中突变的保守残基。（C）含有重组表达的His-Flag-Doa1或Doa1野生型（F417D，F434D）（HisFlag-Doa1-FD）的全细胞裂解物与单泛素-Sepharose孵育。使用Flag表位抗体免疫化学检测负载、结合和未结合Doa1。B、 绑定；U、 未绑定。
图2。
图2。
Doa1与泛素结合是维持泛素稳态功能所必需的。（A） 来自野生型和doa1Δ使用泛素抗体对生长在SD培养基上的酵母菌株进行单泛素和高分子量泛素结合物的免疫化学分析。（B） 野生型系列稀释液(DOA1公司)以及doa1Δ用空载体或泛素表达载体（UBI）转化酵母，测定泛素过度表达对卡那凡尼和茴香霉素敏感性的影响。在规定的葡萄糖培养基（对照）上生长显示出相等的负荷。（C） 对生长在SD培养基上的表达Flag-tagged野生型Doa1（Flag-Doa1）或Doma1（F417D，F434D）（Flag-Doa1-FD）的全细胞裂解物进行泛素免疫化学分析，以确定PFU域突变对体内Doa1功能的影响（通过单泛素水平测量）。（D） Flag-Doa1-的连续稀释，doa1Δ-和Flag-Doa1-FD表达酵母菌株用于通过卡那凡尼和茴香霉素敏感性测定PFU突变对体内Doa1功能的影响。在规定的葡萄糖培养基（对照）上的生长显示出相等的负荷。
图3。
图3。
人类PLAA C末端结构域的功能是保守的。（A） 上图：描绘酵母Doa1 WD40结构域和人类PLAA C末端结构域嵌合体的示意图。底部：酵母全细胞裂解物中HA-Doa1和HA-Doa1-PLAA嵌合体的相对大小和表达水平。使用HA表位抗体对这两种蛋白质进行免疫化学检测。（B） 将表达HA标记的Doa1-PLAA的酵母菌株的全细胞裂解液与单泛素、29-联四泛素类似物或对照-乙脑进行培养。使用HA表位抗体进行免疫化学检测负载、结合和未结合的Doa1 PLAA。B、 绑定；U、 未绑定。（C） 野生型亲本（WT）和doa1Δ使用泛素抗体对用空载体、HA-DOA1或HA-DOA1-PLAA（嵌合体）转化的细胞株进行单泛素和高分子量泛素结合物的免疫化学分析。（D） 野生型亲本的系列稀释(DOA1公司+向量）和doa1Δ用空载体转换细胞系(doa1Δ+矢量），HA-DOA1(doa1Δ+HA-DOA1）或HA-DOA1-PLAA(doa1Δ+HA-chimera）用于证明HA-Doa1-PLAA补体doa1Δ对卡那凡尼和茴香霉素的敏感性。在规定的葡萄糖培养基（对照）上生长显示出相等的负荷。
图4。
图4。
Cdc48通过与Doa1的C末端PUL结构域直接相互作用被招募为泛素。（A） 野生型亲本（WT）或doa1Δ对表达HisFlag-Doa1的酵母进行Ni处理2+琼脂糖亲和层析。洗脱后的蛋白质通过SDS-PAGE分离，通过Sypro-Ruby染色进行可视化，并通过质谱进行鉴定。箭头表示两种最显著的蛋白质，Doa1和Cdc48。（B） 使用针对Flag表位的抗体来联合免疫沉淀纯化物、重组His-Cdc48（在有或无纯化、重组HisFlag-Doa1、BSA和/或ATP的情况下）。使用His抗体免疫化学检测负载、结合和未结合的Cdc48和Doa16表位。（C） 使用针对Flag表位的抗体联合免疫沉淀纯化、重组His-Cdc48（存在或不存在纯化的重组His-Flag标记全长Doa1（HisFlag-Doa1）、WD40结构域（HisFlag-Doa2））WD40型)，C端域（HisFlag-Doa1Cterm公司)，或PUL域（HisFlag-Doa1普林斯顿大学图书馆). 该示意图描述了PUL域在Doa1内的位置。使用His抗体免疫化学检测负载、结合和未结合的Cdc48和Doa16表位。星号表示对Flag抗体重链和轻链的弱交叉反应。（D） 纯化的重组His-Cdc48和HisFlag-Doa1分别或联合培养，有或无ATP，并分析其与单泛素-Sepharose的结合。使用His抗体免疫化学检测负载、结合和未结合的Cdc48和Doa16表位。五十、 载荷；B、 绑定；U、 未绑定。
图5：。
图5：。
DOA1公司与基因有关CDC48型（A）使用系列稀释液来确定灭活Cdc48的效果(cdc48-1型)亲本野生型（WT）对卡那凡尼的敏感性，doa1Δ、和doa4Δ在30°C下培养的酵母细胞。在规定的葡萄糖培养基（对照）上生长显示出相等的负荷。（B） 使用泛素抗体对描述为A组并在20°C下培养的酵母菌株的全细胞裂解液进行单泛素和高分子量泛素结合物的免疫化学分析。最低面板：使用PGK抗体进行免疫化学分析，用作负荷控制。
图6。
图6。
提出了Doa1功能域模型以及与Cdc48功能的相关性。在这个模型中，Doa1-PFU结构域与泛素化底物结合，Cdc48通过与Doa1的PUL结构域的相互作用作用于这些底物。通过as-of-yet-unidentified蛋白与Doa1的WD40结构域结合可能有助于Cdc48的作用或作为Cdc48-Doa1相互作用的调节器。
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