保守的Npl4蛋白复合物介导蛋白酶体依赖性膜结合转录因子激活

质粒

本研究中使用的质粒汇总见表​表2。2。要生成NPL4-GFP公司整合质粒（pPS2009），DNA编码通过PCR从野生型酵母基因组DNA中扩增出Npl4。不是我和Xho公司I位点在5′合并和该PCR片段的3′端，以便于克隆并保持打开的阅读框。不是我/Xho公司然后克隆I-消化PCR产物进入之内不是我/Xho公司I消化的pPS967（YIpNUF2-GFP URA3)主干(卡哈纳等。, 1998). 收件人生成NPL4-pA-6His整合质粒（pPS2015）GFP公司pPS2009中的片段被移除Xho公司我/Hin公司dIII消化并替换为Xho公司我/Hin公司包含四个串联的dIII碎片蛋白A的免疫球蛋白（Ig）G结合结构域的重复序列（2XpA）和从pPS1634中分离出的6-His标记，pPS1656的衍生物（YCpNUF2-2XpA-6His URA3；卡哈纳等。, 1998). 收件人生成的融合GFP公司至的N末端SPT23标准在镀锌1发起人（pPS2348）SPT23标准开放阅读框PCR扩增为一个速度我/Xho公司来自pBDG769的I片段。这个速度我/Xho公司I-消化PCR产物连接到速度我/萨尔I消化的pCGF-1A（YEppGAL1绿色荧光蛋白URA3型；卡哈纳和西尔弗，1996年). 融合了GFP公司到的N终点MGA2公司在镀锌1启动子（pPS2351）与pPS2348相同，除了MGA2公司开放阅读框是从pBDG965中PCR扩增出来的Hin公司dIII型/萨尔我将帧内片段和克隆到Hin公司dIII型/萨尔I消化的pCGF-1A。

显微镜

直接从生长中期的培养物中观察活细胞在液体合成脱落介质中。观察到荧光信号使用配备GFP和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）过滤器组(Chroma技术,Brattleboro，VT）和100×DIC（Nomarski）物镜。图像是由Micromax数码相机拍摄（普林斯顿仪器，特伦顿，新泽西州）使用Metamorph成像软件（Universal imaging、Media、PA）。收件人制备固定细胞用于显微镜检查，细胞培养物固定率为3.7%甲醛5分钟。细胞在0.1 M钾中清洗两次磷酸盐缓冲液，pH 6.5，并由0.5%Triton X-100在P中渗透溶液（1.2 M山梨醇，0.1 M磷酸钾缓冲液，pH 6.5）。用磷酸盐缓冲盐水冲洗两次后，DNA用5ng/ml DAPI在室温下保持1分钟。细胞被清洗两次用磷酸盐缓冲盐水三次，然后在显微镜。对于图形​图2D，2D、 图像是在DeltaVision平台（Applied Precision，Inc.，Issaquah，华盛顿州）。数据收集在0.1μm的切片中迭代反褶积周期(阿加德等。, 1989). A类给出了每个单元的中心平面。

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图2

Npl4p-GFP定位于内质网/核膜。（A）全细胞的抗-Npl4（左）和抗GFP（右）蛋白印迹从表达内源性Npl4p的菌株中提取的提取物（通道1和4） 、一个基因组标记的Npl4p-GFP（第2和第5道）和一个基因组标记的Npl4p-蛋白A（pA）（通道3和6）。抗Npl4斑点显示用两种不同的基因精确替换内源性Npl4pC末端标记的蛋白质（将通道2和3与通道1进行比较）。这个抗Npl4与Npl4-pA（车道3）的强大反应性是以下因素的结果抗体与Npl4p表位以及IgG结合pA的相互作用标签。兔抗GFP印迹识别Npl4p-GFP和Npl4p-pA（分别为第5和第6车道）。不同蛋白质的特性由箭头指示。星号表示身份不明交叉反应蛋白。（B） 观察到的Npl4p-GFP定位荧光显微镜。在中期观察活细胞。定位主要是细胞核（白色箭头）和细胞质核周膜上的明显浓度。白色箭头显示了Npl4p-GFP定位到外周膜的示例。右侧显示了细胞的Nomarski图像。（C） 中性粒细胞4p-GFP与DAPI染色的核DNA共定位。细胞被固定在甲醛，用Triton X-100渗透，DAPI染色荧光显微镜。大多数Npl4p-GFP定位于DAPI观察到的与核重叠和围绕核的区域染色。右侧显示了细胞的Nomarski图像。（D）荧光显微镜观察Npl4p-GFP的表达DeltaVision平台。连续0.1μm荧光图像通过表达Npl4p-GFP的二倍体酵母菌株NPL4号机组并经历了五轮反褶积。所呈现的图像代表了未卷积数据的中心平面。白色箭头表示Npl4p-GFP在核周膜。白色箭头表示Npl4p-GFP示例定位于外周膜。

细胞分离、微粒体纯化和膜提取

微粒体纯化基本上按照Latterich和Schekman（1994）.确定分馏曲线Npl4p、来自粗裂解物的同等蛋白质、高速上清液、，并通过蛋白质印迹分析对微粒体组分进行分析抗Npl4抗体(DeHoratius和Silver，1996年). 要确定从微粒体膜中提取Npl4p，6×150μg将纯化的野生型微粒体丸化并重新悬浮在1ml的B88缓冲液（20mM HEPES，pH 6.8，150mM KOAc，5mM镁（OAc）₂，250 mM山梨醇），1 M KOAc在B88中，2 MB88中KOAc，B88中3 M尿素，0.1 M纳₂一氧化碳_三B88中pH值为11，或B88中的1%Triton X-100。样品在室内涡流1分钟温度并通过离心。将颗粒重新悬浮在150μL的1×蛋白质中样品缓冲液和上清液部分为三氯乙酸沉淀并重新悬浮在150μL的1×蛋白质样品缓冲液中。用SDS-PAGE和Western blotted分离每个样品（20μg含抗Npl4（1:500稀释）、抗Cdc48（1:1000稀释）(Latterich（锁存器）等。, 1995)，抗Sec17（1:1000稀释），或抗Sec62（1:10000稀释）。

铜化蛋白的Npl4p-pA纯化与鉴定

Npl4p-pA和铜纯化蛋白基本上是作为由描述Siniossoglou公司等。(1997)简单地说，酵母表达未标记或蛋白A标记Npl4的细胞生长在1 l YEPD（酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖），25°C至操作系统₆₀₀=1.5，球形成型，冷冻隔夜−20°C。在冰上解冻后，球状体离心，重新悬浮在20 ml裂解缓冲液中（150 mM KCl，20 mM三重HCl，pH 8.0，5 mM MgCl₂，1%Triton®声波风廓线仪X-100，加上2 mM苯甲基磺酰氟和2.5μg/ml每种胃蛋白酶抑制素A、 亮氨酸蛋白酶、抑肽酶和凝乳抑素），并用10在40-ml Dounce均质器中手动敲击。产生的匀浆在13000×克上清液是应用于含有500μL制备的IgG Sepharose的柱珠。洗涤后用乙酸洗脱结合的蛋白质，三氯乙酸沉淀，并在30μL SDS中再次悬浮蛋白质样品缓冲液（1/5000原始裂解液体积）。每个样品（25μL）通过SDS-PAGE分离，蛋白质通过考马斯蓝染色。

切除感兴趣的条带并进行凝胶内胰蛋白酶消化，如所述威廉等。(1997). The提取并分析得到的肽混合物基质辅助激光解吸/电离飞行时间质量Dana-Farber癌症研究所分子生物学中心的光谱学设施（马萨诸塞州波士顿）。胰蛋白酶片段的测定大小用于在复合非冗余物中搜索候选蛋白质使用吉祥物的蛋白质序列数据库（OWL）搜索程序(珀金斯等。, 1999).

npl4-1号机组高拷贝抑制器屏幕

这个npl4-1号机组菌株PSY825被转化为高拷贝（2μURA3型)酵母基因组文库（C。Connelly和P.Hieter），并选择抑制因子在33°C。20株菌株表现出质粒依赖性生长拯救并进行了进一步分析。Pst（磅/平方英尺）我的消化表明20个无性系中有3个不同的插入物。1号HCS（pPS1914）被发现14次，HCS#9（pPS915）和HCS#40（pPS1904）每个人被发现三次。测序和亚克隆显示pPS1914（HCS#1）和pPS1915（HCS#9）都包含部分MGA2公司开放阅读框架（缺少C末端199个氨基酸）负责npl4-1型高拷贝抑制。被截断的MGA2公司子克隆（pPS2019）为通过隔离和自校准千磅I-消化pPS1914主干。pPS1916（HCS#40）的救援能力npl4-1号机组33°C下的增长是由于有机发光二极管1基因。

npl4-1号机组特效镇静剂屏幕

这个npl4-1号机组菌株PSY2373和PSY2374使用不是I-消化酵母体内诱变的基因组文库大肠杆菌属大肠杆菌一个Tn3衍生的小转座子携带酵母选择性标记LEU2级(库马尔和斯奈德，2000年)、和在30°C下选择抑制器。产生的突变体（200）为通过与父母杂交测试隐性/显性行为npl4-1号机组相反交配类型的应变。在所有情况下由此产生的二倍体能够在30°C下生长，这表明分离的抑制物占优势。其中一个突变体（PSY2377）显示LEU的严格连接⁺在30°C下生长并对其进行了进一步分析。隔离和识别该突变中转座子插入位点侧翼的基因组DNA(Kumar和Snyder，2000年)表明转座子是整合的在第2133帧中SPT23标准第XI号染色体上的基因。

Northern Blot分析

进行温度变化分析重量,npl4-1号机组,npl4-2号机组,cdc48-3型,ufd1-1型和转速4Δ菌株，细胞生长于25°C至外径₆₀₀=0.3，然后切换至37°C。在37°C的不同时间段后，收集细胞（T=0时间点也在温度变化之前进行了测量）。所有样本立即在−20°C下冷冻，以便所有RNA制剂并行执行。用探针探测总RNA[α-³²P] dCTP标记为1.2-kb内部萨尔我/派克靴我有机发光二极管1从中分离出的碎片pBDG769和300-bp行动1（肌动蛋白）探针来自pPS332。收件人确定相对有机发光二极管1水平，有机发光二极管1和行动1每个样本的信号通过以下公式进行量化荧光成像仪分析。减去背景后油1/行动1计算每个样本的比率并相对于油1/行动1比率用于在无UFA的情况下在25°C下生长的野生型细胞。

Npl4p定位于核周膜

先前的研究表明，Npl4p可能是核孔间接定位于固定细胞核边缘免疫荧光(DeHoratius和Silver，1996年). 收件人在活酵母细胞中定位Npl4p，我们整合了编码C端子GFP标签位于NPL4号机组基因组位点。西部印迹表明，得到的融合蛋白是全长的并替换了内源性未标记Npl4p（图​（图2A，2A、 车道2和5）。可行性由此产生的菌株证实了Npl4p-GFP的功能性，因为它是细胞中存在唯一形式的Npl4p。通过荧光显微镜活酵母细胞，Npl4p-GFP似乎主要定位于细胞核（图​（图2B，2B、 箭头）和细胞质，可能在核周膜。在某些情况下，Npl4p-GFP信号也可以在似乎与皮质膜相对应的部位检测到（图​（图2B，2B、 箭头）。为了确认Npl4p-GFP的膜定位是核周，we甲醛固定和DAPI染色表达Npl4p-GFP的酵母细胞。如图所示​图2C，2C、 的大多数Npl4p-GFP信号可以在与或者围绕着核DNA。Npl4p-GFP的扩散细胞质池也可以在这些细胞中看到。最后，分析Npl4p-GFP更详细地说，我们在DeltaVision平台。图像通过0.1-μm截面捕获每个细胞都进行反褶积以最小化背景和离焦信号(阿加德等。, 1989). 之后去卷积，核周存在Npl4p-GFP（图​（图2D，箭头）2D、，箭头）和外围膜（图​（图2D，2D、 箭头）是特别的显而易见。Npl4p-GFP的核周膜信号非常相似与ER和细胞核相关的蛋白质的预期值相比膜（在酵母中是连续的）。

为了从生物化学上证实这种Npl4p定位模式，酵母提取物被分离成可溶性和微粒体（ER/核膜）组分（见材料和方法）。针对等量蛋白质的免疫印迹每个含有抗Npl4抗体的组分显示内源性Npl4p与微粒体膜相关（图​（图3A，三A、 车道2），并以可溶性形式存在池（图​（图3A，三A、 车道3）。该Npl4p部分甚至保持可溶高速（100000×克)旋转（希区柯克，Krebber、Frietze、Lin、Latterich和Silver，未发表的结果）。我们估计～20%的细胞Npl4p是膜相关的，基于原油中发现类似水平的Npl4p（图​（图3A，车道三A中，车道1）和微粒体（图​（图3A，三A、 车道2）分数，而总所分离的微粒体蛋白占细胞总蛋白的1/5。Npl4p-GFP显示了相同的分馏曲线（Hitchcock，Krebber，Frietze、Lin、Latterich和Silver，未发布的结果）。

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图3

Npl4p定位的生化特征以及相互作用。（A） Npl4p存在于可溶性和膜结合中分数。粗全细胞提取物中的同等蛋白质（1号通道），纯化微粒体（通道2）和ER/核膜清除提取物（lane 3）从野生型酵母菌株中分离得到SDS-PAGE和免疫印迹抗Npl4抗体。乐队表示对应于Npl4p，星号表示未识别交叉反应蛋白。（B） Npl4p的微粒体分数为紧密的膜相关。从野生型酵母中纯化的微粒体菌株单独用缓冲液清洗（1号和2号通道），1 M KOAc（3和4车道），2 M KOAc（5和6车道），3 M尿素（7和8车道），0.1M钠₂一氧化碳_三pH 11（9和10车道），或1%Triton®声波风廓线仪X-100（11号和12号车道）。然后将样品分离成颗粒（P；膜相关；奇数车道）或可溶性（S；偶数车道）级分，并用抗Npl4进行SDS-PAGE和蛋白质印迹和抗Cdc48抗体。外围ER的提取轮廓膜蛋白Sec17p和内质网整合膜蛋白Sec62p用抗Sec17和抗Sec62蛋白免疫印迹法测定抗体作为对照。（C） Npl4p-蛋白A（pA）与Cdc48p共纯化和Ufd1p。来自任一菌株的酵母全细胞提取物培养表达未标记Npl4p（通道1）或Npl4p-pA（通道2）的细胞带有IgG-Sepharose珠。经过大量洗涤后，蛋白质与用酸洗脱珠子，并通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色。切除蛋白质的质谱分析谱带显示了Npl4p-pA铜化p100和p43的特性蛋白质分别为Cdc48p和Ufd1p。

假设Npl4p氨基酸序列不包含任何预测跨膜结构域，我们想测试Npl4p的性质与微粒体膜的相互作用。微粒体膜衍生用不同的缓冲液和分离成可溶性（S）和颗粒（P）组分（图​（图3B）。免疫印迹法三B） ●●●●。抗Npl4的免疫印迹显示Npl4p可以不能用高盐（1 M和2 M）萃取到可溶部分醋酸钾，分别位于第4和第6车道）用3 M尿素从膜上分离（图​（图3B，三B、 车道8）或0.1 M碳酸钠，pH 11（图​（图3B，三B、 车道10）。只有在以下人员在场的情况下1%Triton X-100完全提取Npl4p（图​（图3B，三B、 车道12）。Npl4p相互作用蛋白Cdc48p（图​（图3C）三C） 显示了类似的先前发布的提取轮廓(Latterich（锁存器）et（等）阿尔。, 1995). 作为对照，这些相同的组分也被外周ER抗体免疫印迹膜蛋白Sec17p和整合ER膜蛋白Sec62p。作为预计，添加3后，Sec17p从膜上分离M尿素（图​（图3B，三B、 通道8）和0.1 M碳酸钠，pH 11（图​（图3B，三B、 车道10）。相反，Sec63p未与微粒体分离任何条件下的膜，添加1%Triton X-100的情况除外（图​（图3B，三B、 车道12）。这些结果表明Npl4p蛋白表现为紧密相关的外周ER/核膜蛋白。

Npl4p与Ufd1p和AAA-ATP酶Cdc48p的配合物

为了鉴定Npl4p可能与之结合的其他蛋白质相互作用，我们将DNA编码蛋白A（pA）整合在NPL4号机组基因组位点，生成NPL4-磷酸打开阅读框。替换的全长融合蛋白的表达内源性Npl4p经Western blotting证实（图​（图3A，三A、 车道3和6）。该结构的功能性通过可行性得到了证实产生的应变。从酵母细胞中制备提取物表达Npl4p-pA或未标记Npl4p作为对照。孵化后通过IgG-Sepharose和大量洗涤，洗脱结合蛋白，SDS-PAGE分离，考马斯蓝染色观察（图​（图3C）。三C） ●●●●。在Npl4p-pA样品中，三种主要的洗脱蛋白是观察到：p100、p90和p43（图​（图3C，三C、 车道2）。在未标记的样品，只观察到背景考马斯蓝染色（图​（图3C，三C、 车道1）。将条带从凝胶中切除并进行质量测定用于识别的光谱分析。p90被鉴定为Npl4p-pA融合蛋白p100被鉴定为Cdc48p，p43被鉴定为标识为Ufd1p。Ufd1p是一种功能未知的必需蛋白这是在酵母突变株的筛选中发现的，该突变株能够稳定人工泛素融合蛋白（泛素融合降解[UFD]屏幕）(约翰逊等。, 1995). Cdc48p蛋白，与它的哺乳动物同源物p97一起，是AAA-ATP酶家族与同型膜有关融合，泛素介导的蛋白质周转（包括UFD通路）和细胞周期进展(莫尔等。, 1982；弗罗里奇等。, 1991；阿查里亚等。, 1995；Latterich（锁存器）等。, 1995；拉布耶等。, 1995；吉斯兰等。, 1996；戴等。, 1998). 这个哺乳动物Npl4、Ufd1和p97/Cdc48蛋白最近也被发现演示以进行交互(迈耶等。, 2000)，表示这个蛋白复合体在进化上是保守的。

基于Npl4p与Cdc48p的相互作用，以及膜Npl4p的定位，我们测试了npl4号机组突变体显示同种膜融合的缺陷。微粒体膜与野生型隔离，npl4-1型、和npl4-2号机组酵母应变，然后测试它们在之前的描述的体外同型膜融合试验(Latterich和Schekman，1994年). 膜来源于npl4号机组菌株能够融合到与野生型膜（Hitchcock，Krebber、Frietze、Lin、Latterich和Silver，未发布结果），提示Npl4p不需要用于同种膜融合。

npl4突变体被过度生产的脂肪酸脱饱和途径的成分和蛋白酶体相关基因RPN4号机组

为了发现npl4号机组菌株，进行筛选以鉴定酵母当过度表达时，可以拯救的基因npl4-1号机组温度敏感性。这个npl4-1号机组菌株被转化高拷贝（2μURA3型)酵母基因组文库（赠予C.Connelly和P.Hieter），并在非许可区进行生长筛选温度（30°C）。从这个屏幕上分离出一个基因，有机发光二极管1，编码酵母Δ9-脂肪酸去饱和酶，即UFA的所有从头合成所需(斯图基等。,1990). 如图所示​图4A4A（顶部）温度灵敏度npl4-1号机组在30°C时挽救2μ有机发光二极管1与空向量相比控件。然而，npl4-1型在较高温度下生长（36°C）未被抢救，表明有机发光二极管1只能补充npl4-1号机组中间温度灵敏度温度。的温度灵敏度npl4-2号机组在36和37°C温度也降低了2μ有机发光二极管1（图​（图4A，4A、 底部），表明这种效应不是等位基因特异性的。

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图4

酵母npl4号机组变种人被监管机构拯救UFA途径和蛋白酶体。（A） 抑制npl4-1号机组和npl4-2号机组温度灵敏度通过高拷贝表达有机发光二极管1,SPT23标准,MGA2公司、和RPN4.npl4-1（PSY2340，顶部）和npl4-2号机组（PSY2341，底部）菌株转化为空向量，或2μ向量包含NPL4号机组,油1,MGA2公司（aa1-914），毫克2,SPT23标准，或转速4被连续稀释到YEPD媒体。显示每个稀释液中发现的细胞数在底部。将培养皿在指定温度下培养24–48小时（B）npl4-1号机组拉紧被一个转座子插入等位基因外源性抑制SPT23标准野生型增长（WT；FY23），npl4-1号机组（PSY2373），以及npl4-1 SPT23：：Tn3:：LEU2Leu上的（PSY2377）菌株⁻在指定的温度下进行。FY23和PSY2373菌株为转换为空LEU2级允许增长的向量卢⁻脱落板。（C） 的示意图美国。酿酒Mga2p和Spt23p蛋白。这些部分冗余因素有38%相同，54%相似。序列特征包括假定的基本核定位信号（NLS），假定的富含亮氨酸的核输出信号（NES）和两个锚蛋白重复序列。这个TIG结构域是一种存在于细胞表面的类Ig折叠结构域受体和包括NF-κB在内的细胞内转录因子。显示C末端跨膜结构域（TM）。坚固的块没有指定或预测功能的氨基酸保存用白色方框表示。隔离中的截断位置MGA2公司显示高拷贝抑制克隆（pPS2019）通过Mga2p示意图中的箭头。转座子的位置（时间：LEU2级)插入npl4-1号机组基因外抑制等位基因SPT23标准（PSY2377）如Spt23p示意图所示。（D） 酵母的温度敏感性npl4号机组突变体是通过用UFA补充生长培养基，部分得到拯救。野生型（重量），机油1Δ,npl4-1号机组、和npl4-2号机组YEPD板上出现应变未补充（左侧）或补充（右侧）0.5 mM UFA（0.25 mM棕榈油酸[16:1]，0.25 mM油酸[18:1]，1%特吉醇）。将平板在指示温度下培养48小时。

从中分离出的另一个基因npl4-1号机组高拷贝抑制器屏幕，MGA2公司，编码一个转录因子已经证明可以激活有机发光二极管1(张等。, 1999). Mga2p和冗余转录活化剂Spt23p最近被证明是膜结合的前体蛋白，然后在蛋白酶体依赖性中裂解从膜的方式(霍普等。, 2000). 它是假设随后需要从膜上切割激活有机发光二极管1由Mga2p和Spt23p转录。有趣的是MGA2公司在我们的屏幕中分离的克隆包含相同截断形式的MGA2公司缺少C末端199个氨基酸的编码序列。的网站截断，消除跨膜结构域（由图中Mga2p示意图中的箭头​图4C）4C） 可能导致表达Mga2p的可溶性截短形式。与相同有机发光二极管1，的截断的MGA2公司克隆人可以拯救npl4-1号机组和npl4-2号机组中间温度下的温度灵敏度（图​（图4A，4A、 顶部和底部）。直接测试时，全长MGA2公司能够抑制二者都npl4-1号机组和npl4-2号机组类似于截断的的形式MGA2公司，尽管这种抑制稍弱对于npl4-1号机组（图​（图4A4A顶部）。此外，冗余基因SPT23标准进行了高拷贝抑制测试npl4型温度灵敏度(张等。, 1997；张等。1999年). 在以下情况下npl4-1号机组,第23页只能微弱地抑制生长缺陷30°C的中间温度（图​（图4A，4A、 顶部）。相反，npl4-2号机组突变体几乎完全被SPT23标准（图​（图4A，4A、 底部）。

作为遗传相互作用的补充证据NPL4号机组和SPT23标准，我们已经分离出一个转座插入等位基因SPT23标准作为主要的外源性抑制因子npl4-1号机组30°C但不高于30°C时的温度灵敏度温度（见图​图4B4B和材料和方法）。的排序转座子和侧翼基因组DNA显示转座子插入导致框内缬氨酸密码子和终止的位置密码子2130核苷酸（对应710个氨基酸）进入的编码序列SPT23标准。此插入的性质将阻止预测的锚蛋白重复序列和跨膜表达域（参见图中的Spt23p示意图​图4C）。4C） ●●●●。这一发现表明截短的可溶性形式的Spt23p can的单拷贝表达外源性抑制npl4-1号机组温度灵敏度30°C。

这些基因筛查的结果表明灵敏度npl4号机组突变可以通过增加的级别有机发光二极管1基因直接或通过过度表达有机发光二极管1自身或通过过度表达间接或截断（并可能激活）转录因子直接的有机发光二极管1表达式。鉴于Ole1p将生产UFA，我们试图确定npl4号机组突变体可以通过补充其生长来拯救UFA媒体。事实上npl4-1号机组和npl4-2号机组中间温度下的应变（30和36°C，分别）通过补充棕榈油酸（16:1）和油酸恢复酸（18:1；图​图4D）。4D） ●●●●。这种影响不是由于使用了洗涤剂溶解不明飞行物（希区柯克、克雷伯、弗里茨、林、拉特里奇、，和Silver，未发布的结果）。这个机油1Δ应变是用于控制所有温度，因为其生长依赖于仅在存在补充UFA的情况下。

在我们的研究过程中，我们还发现了一种基因相互作用NPL4号机组和蛋白酶体调节因子RPN4号机组/索尼1/UFD5.RPN4最初是在我们的实验室中被鉴定为C末端的外源性抑制因子突变体第63节/NPL1公司(纳尔逊等。,1993)也在同一基因筛查中被分离出来UFD1号机组(约翰逊等。, 1995). 此外，RPN4号机组已经证明与蛋白酶体(藤室等。, 1998)并进行监管蛋白酶体基因转录(曼哈普特等。, 1999). 什么时候？以高拷贝表示，RPN4号机组强烈拯救两者的温度敏感性npl4-1号机组和npl4-2号机组突变菌株与空载体DNA的比较（图​（图4A）。4A） ●●●●。在案例npl4-1号机组,RPN4号机组拯救增长30°C的中间温度（图​（图4A，4A、 顶部），而在案例npl4-2号机组,RPN4号机组能够抢救36°C和37°C下的生长（图​（图4A，4A、 底部）。此外，npl4-1rpn4Δ双突变体显示出合成的缓慢生长与野生型和两个单一突变体相比，25°C下的表型单独（希区柯克、克雷伯、弗里茨、林、拉特里奇和西尔弗，未发表的结果）。

Npl4p是必需的油1表达式

上述遗传数据使我们得出以下假设：蛋白酶体依赖性可能需要Npl4pMga2p和Spt23p转录因子的处理/激活后来的有机发光二极管1表达式(霍普等。, 2000).截断形式的隔离MGA2公司和SPT23标准作为抑制器npl4号机组温度敏感性为这一假设提供了特别有力的支持。作为在第一次测试中，我们问有机发光二极管1转录水平为减少了npl4号机组突变细胞与控制转录本(行动1). Northern印迹分析为对从野生型中分离的总RNA进行检测，npl4-1号机组,和npl4-2号机组转换到非许可温度（37°C）。如图所示​图5，5,有机发光二极管1转录水平为两者都正常npl4-1号机组和npl4-2号机组单元格位于允许温度（图​（图5，5，比较车道3、6和9）。然而，有机发光二极管1这些突变体的水平显著降低在切换至37°C 60分钟后（图​（图5，5，泳道7和10）。相反，有机发光二极管1在野生型细胞中切换至37°C（图​（图5，5，车道4）。这个npl4-1号机组和npl4-2号机组菌株能够抑制有机发光二极管1表达程度与野生型细胞相似（图​（图5，5，车道2，5和8）。量化中的变化有机发光二极管1表达，相对的有机发光二极管1/行动1信号已计算（参见材料和方法；图​图5，5，底部）。

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图5

需要NPL4功能有机发光二极管1转录。Northern分析是在总RNA分离自机油1Δ（车道1），野生型（WT；车道2–4），npl4-1号机组（5-7车道），npl4-2号机组（8–10车道），cdc48-3型（11–13车道），ufd1-1型（14-16车道），以及rpn4Δ单元格（17–19车道）有机发光二极管1-和行动1-特异性DNA探针。细胞在YEPD中生长在25°C的介质中添加或不添加UFA。对于野生型细胞，温度敏感菌株npl4-1号机组,npl4-2号机组、和cdc48-3型、和非温度敏感性菌株ufd1-1型和转速4Δ，在轮班到37°C持续60分钟。A标准化有机发光二极管1/行动1计算每个样品与允许量化中的相对变化有机发光二极管1样本之间的表达。

鉴于NPL4号机组功能丧失有机发光二极管1表达式，我们确定NPL4号机组相关基因，CDC48型,UFD1号机组、和RPN4号机组，也需要有机发光二极管1表达式。作为一个测试Npl4p相互作用蛋白Cdc48p的需求，对从对温度敏感的cdc48–3应变。与相同npl4-1号机组和npl4-2号机组,油1级别为允许温度为25°C时正常cdc48-3型单元格（图​（图5，5，比较泳道3和12）。然而，有机发光二极管1信使核糖核酸在向非许可方转移60分钟后无法检测到温度为37°C（图​（图5，5，13号车道）。要确定Npl4p相互作用蛋白Ufd1p也需要用于有机发光二极管1表情，我们监控有机发光二极管1mRNA水平ufd1-1型突变株。无重大缺陷有机发光二极管1在ufd1-1型单元格位于与野生型细胞相比，温度为25°C（图​（图5，5，比较车道3和15). 有趣的是ufd1-1型菌株具有显著的较低级别的有机发光二极管1mRNA在转移至37°C 60分钟后（图​（图5，5，比较4号和16号车道），尽管这种压力对温度不敏感。最后，我们测试了以下方面的需求这个RPN4号机组中的基因有机发光二极管1表达式。有机发光二极管1转录水平在转速4Δ应变25°C（图​（图5，5，比较车道3和18）。就像ufd1-1型应变，rpn4Δ细胞对温度不敏感；然而，在切换到37°C 60分钟后，有机发光二极管1水平在转速4Δ应变为与野生型相比（图​（图5，5，比较车道4和19）。这个cdc48-3型,ufd1-1，和转速4Δ突变体能够压抑有机发光二极管1mRNA表达不明飞行物，虽然没有野生型细胞那么强烈（图​（图5，车道5,车道2、11、14和17）。

Npl4p定位和Npl4p-Ufd1p-Cdc48p复合体

我们的体内和生化定位研究表明Npl4p亚群（～20%）与ER/核紧密结合膜，剩余部分为可溶性细胞质/核质池。我们还显示了总细胞数Npl4p蛋白与Ufd1p和Cdc48p紧密结合蛋白质。虽然这些蛋白质的哺乳动物同源物有之前已经证明可以进行交互(迈耶等。,2000)，我们目前的研究首次描述了Npl4复合物。UFD1号机组在基因筛查中发现指导蛋白酶体依赖性转化的途径泛素融合蛋白（UFD途径；约翰逊等。,1995). Cdc48p是一种AAA ATP酶，首次在冷敏感细胞视觉周期突变体(莫尔等。,1982). 有趣的是，我们观察到npl4号机组单元格显示G2/M细胞周期阻滞，类似于cdc48突变体（希区柯克、克雷伯、弗里茨、林、拉特里奇、，和Silver，未发布的结果）。Cdc48p及其哺乳动物同源物p97也与其他细胞过程有关包括同源膜融合和泛素介导的蛋白质降解（包括UFD途径；阿查里亚等。,1995；Latterich（锁存器）等。, 1995；拉布耶等。,1995；吉斯兰等。, 1996；Koegl公司等。, 1999).Cdc48p/p97和其他AAA-ATP酶被认为是蛋白质伴侣，要么是展开蛋白质，要么是分解蛋白质复合物；反过来，底物特异性是通过Cdc48p/p97与不同辅因子蛋白的相互作用(汉森等。, 1997；Patel和Latterich，1998年；戈尔比克et（等）阿尔。, 1999).

Npl4与Mga2p和Spt23p的加工

维持细胞膜中的UFA水平对于适当的膜流动性和动力学，以及膜结合细胞器功能。真核细胞的分子机制监测UFA水平和/或膜流动性仍不清楚。然而，这个油1编码Δ9-脂肪酸去饱和酶的基因负责所有UFA从头合成的酶似乎是这种信号通路的主要靶点(斯图基等。,1990). 的确，油1这两个地方的活动都受到严格管制转录和转录后水平对细胞脂肪酸需求(Bossie和Martin，1989年；崔等。, 1996；冈萨雷斯和马丁，1996年).

部分冗余SPT23标准和MGA2公司基因有已证明需要有机发光二极管1表达式，可能是转录激活物(张等。, 1997,1999). A类最近的报告霍普等。(2000)透露了一本小说调节Mga2p和Spt23p活性的机制对细胞内UFA水平的反应。Mga2p和Spt23p制作为锚定在内质网/核膜上的新生跨膜蛋白；泛素蛋白酶体依赖性蛋白水解裂解，然后允许活性可溶性转录激活物的释放(霍普et（等）阿尔。, 2000).

我们的数据支持一个模型（如图所示​图7）7)那个地方NPL4号机组功能UFA调控途径的上游。在此模型中膜相关Npl4p-Ufd1p-Cdc48p复合物的协同功能用蛋白酶体进行蛋白质水解处理膜结合物转录因子Mga2p和Spt23p。活性Mga2p和Spt23p导致增加油1转录和随后的UFA合成。当Npl4活动受到影响时，例如npl4号机组温度敏感突变体Mga2p和Spt23p仍然存在未处理且无法激活有机发光二极管1转录；作为一个结果，UFA水平下降，可能对细胞产生全球影响膜动力学和膜结合细胞器功能。

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图7

中Npl4函数的模型内质网膜结合转录的蛋白酶体依赖性处理因子Mga2p和Spt23p。详情见正文。

为了支持该模型npl4号机组突变体部分是通过所有基因的过度表达来拯救的该路径的下游组件，即，有机发光二极管1,MGA2公司、和SPT23标准以及不明飞行物本身。我们的截断形式的隔离MGA2公司和SPT23标准（缺乏C末端跨膜结构域）npl4号机组抑制物特别有趣，因为这些可溶性蛋白质应绕过Npl4p相关处理的要求。NPL4号机组还显示与蛋白酶体相关转速4。转速4（也称为SON1/UFD5)已被提议与蛋白酶体进行铜提纯并影响蛋白酶体亚基的转录(芬利et（等）阿尔。, 1998；藤室等。, 1998；格利克曼et（等）阿尔。, 1998；曼哈普特等。, 1999；Ng公司et（等）阿尔。, 2000). 此外，Npl4p相互作用蛋白Cdc48p和Ufd1p以前与蛋白酶体介导的退化，退化(约翰逊等。, 1995；吉斯兰et（等）阿尔。, 1996；戴等。, 1998).

作为这个模型的直接证据，我们已经证明了有机发光二极管1水平急剧下降npl4号机组和cdc48短时间转向非许可的突变体温度。非温度敏感性菌株ufd1-1型和转速4Δ也会显示中的缺陷有机发光二极管1在37°C下表达。此外，我们还证明了Mga2p和Spt23p融合蛋白在npl4号机组,cdc48,ufd1型、和转速4Δ突变细胞即使在允许的温度下。我们建议有机发光二极管1在这些突变株中观察到的转录本允许温度（Mga2p和Spt23p熔化的条件蛋白质没有得到有效加工）可以解释为内源性Mga2p和Spt23p蛋白的充分残余处理。

由建议的模型霍普等。(2000)推测Npl4p-Ufd1p-Cdc48p复合体介导发生在加工反应，如蛋白酶体释放或处理后的Mga2p和Spt23p易位进入细胞核(霍普等。, 2000). 与此模型相比，我们观察到在这些突变体中，Mga2p和Spt23p蛋白几乎没有加工背景。

我们感谢D.Finley、D.Garfinkel、E.Johnson和T.Rapaport检测质粒、菌株和抗体。我们特别感谢对K.Auld、A.Brodsky、M。Damelin、J.K.Hood、P.Ko Ferrigno和A.E.McBride与刺激与Silver和Latterich实验室的所有成员进行讨论。我们还要感谢P.Ko Ferrigno在以下方面的专家建议DeltaVision显微镜和Dana-Farber癌症研究所的J.Lee用于质谱分析的分子生物学核心设施Npl4p相互作用蛋白。这项工作由美国国立研究院资助向P.A.S.和Deutsche Forschungsgemeinschaft提供健康（NIH）拨款英国国立卫生研究院（NIH）的一项培训拨款支持了英国皇家科学院（H.K.A.L）的研究金加州大学圣地亚哥分校。A.L.H.得到NIH的支持哈佛医学院和Dana-Farber癌症培训拨款研究所。